Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional De Ciencias Biológicas

Ingeniería Bioquímica
Precipitación, separación y punto isoeléctrico de proteínas

De la Cruz Ramírez José Antonio Guzman Avila Abraham Osvaldo

Introducción:

Las proteínas no son solamente polipéptidos, sino que tienen una secuencia de aminoácidos
propia. Antes de su estudio, es necesario que esto esté totalmente puro: sin contaminación de
proteínas u otras sustancias celulares para esto es necesario separarlos.

Una proteína tiene múltiples grupos acido-base, lo que hace sus propiedades de solubilidad,
dependiente de la concentración de sal, polaridad del solvente, pH y temperatura. Diferentes
proteínas tienen diferentes propiedades de solubilidad, por lo que cuando una proteína es soluble
otras precipitan.

Objetivo:

 Analizar el efecto que produce la modificación de factores fisicoquímicos sobre la

solubilidad de las proteínas.

 Determinar el punto isoeléctrico de la insulina, basándose en sus propiedades de

solubilidad a diferentes valores de pH.

Resultados:

Salting Out
Biuret Interpretación

Filtrado 1 (sobrenadante) + Positiva porque hay proteínas

Precipitado 1 + Positiva porque hay proteínas

Filtrado 2 (sobrenadante) - Las proteínas precipitaron,

están en el precipitado 2
Precipitado 2 + Positiva porque hay proteínas.

Precipitación por efecto del pH y disolventes

Tubo 1 2 3
Clara de huevo filtrada 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml

HCl 0.1 ml 1ml - -

NaOH 0.1 ml 1ml

Regulador de acetatos - - 1ml

0.1M (4.7ml)
Observaciones Precipitación media No hay precipitación Precipitación mayor

Etanol 3ml 3ml 3ml

Observaciones Precipitación media No hay precipitación Precipitación mayor

Precipitación por metales pesados

Tubo Clara de huevo Solución Observaciones

1 1ml Cloruro mercúrico 5% Precipito muy rápido y es el

(0.25ml) precipitado más grueso de
todos

2 1ml Nitrato de plata 2% Precipito rapido

(0.25ml)
3 1ml Acetato de plomo 2% Precipito
(0.25ml)

4 1ml Cloruro de bario 5% Tarda mucho en precipitar y

(0.25ml) no lo hace al 100%
5 1ml Cloruro de sodio 5% Solubilizo la proteína
(0.25ml) (salting in )

6 1ml Agua (0.25ml) Precipita levemente

Determinación del punto isoeléctrico de la insulina

Tubo Ac. Acético Acetato de Insulina pH Observaciones
sodio 0.2 M
0.2 M (ml) 40U/ml
(ml)

1 0.23 0.02 0.06ml 3.67 No precipito

2 0.15 0.10 0.06ml 4.56 No precipito
 3 0.05 0.20 0.06ml 5.34 No precipito
4 0.01 0.24 0.06ml 5.42 Precipito

5 0.00 .025 0.06ml 9.06 No precipito

Cálculos:

Para el punto isoeléctrico de la insulina:

pH= pka+ log¿ ¿
[0.20]
pH=4.74+ log
[0.05]
pH=5.34
Para cuando únicamente hay concentración de sal:

1 1
pH=7+ 4.74+ log [0.25 ]
2 2
pH=9.06
Discusión:

1.Separación de proteínas por precipitación con sales.

Al adicionar 6 mL de la solución saturada de (NH 4)2SO4 esta provocó la precipitación de ciertas
proteínas, esto fue causado por la competencia que se da por las moléculas de agua solubilizando
a la proteína y las que solubilizan a los iones NH 4+ y SO42-, acaparando los iones las moléculas de
agua, y causando que la proteína se coagule por las interacciones hidrofóbicas que hay entre los
residuos de aminoácidos de la misma. Para comprobar que había proteínas en cada fase se realizó
a una muestra de 1ml de cada una de ellas, la reacción de Biuret. De las cuales se obtuvo un
resultado positivo para ambas.

2. Punto isoeléctrico de la insulina.

En este caso tendría que haber precipito el tubo No.3 en condiciones óptimas del experimento,
pero debido a problemas como lo puede ser las mediciones o el tipo de insulina utilizada este
experimento no dio los resultados que se esperaban.
Conclusiones:

Bibliografía:

Nelson, D. Cox, M. 2013. Lehninger – Principles of biochemistry. W.H. and Freeman. Pp. 147-151.

  Murray, Robert K.. Harper – Bioquìmica ilustrada. MC Graw Hill. Pp. 25

Pregunta extra:

¿Cuáles son las proteínas de la clara de huevo?

R= Ovalbúmina – 54%, Ovotransferrina – 12%, Ovomucoide – 11%, Ovoglobulina G2 – 4%,
Ovoglobulina G3 – 4%, Ovomucina – 3.5%, Lisozima – 3.4%, Ovoinhibidor – 1%, Ovoglicoproteína
– 1%, Flavoproteína - 0.8%, Ovomacroglobulina – 0.5%, Avidina – 0.05%, Cistatina – 0.05%.