CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA Guía de Ejercicios Prácticos

Competencia asociada: Operar

INDUSTRIAL
procesos biotecnológicos
TECNOLOGO PROCESOS
BIOTECNOLOGICOS APLICADOS A LA
INDUSTRIA

Línea MATERIALES Y HERRAMIENTAS

tecnológica:
Red Tecnológica: BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
Centro de CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA Regional: Valle
Formación: INDUSTRIAL
Nombre del PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO, TÉCNICAS DE
Ejercicio Práctico SIEMBRA
No. 1
Contexto: Para estudiar los microorganismos y hacer uso de sus potenciales
en la obtención de productos biotecnológicos de interés industrial es
necesario que los cultivemos en laboratorio, y entender como es la
dinámica de vida de las células microbianas para comprender sus
condiciones óptimas de crecimiento, nutricionales y bioenergética.
Nombre de la Preparación de materiales y medios de cultivo para realizar técnicas
Actividad: de siembra

CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD

 Usar uniforme blanco y limpio

 Los materiales como bolsos ubicarlos en sus respectivas gavetas de seguridad, solo
utilizar el material de documentación y el computador portátil
 No comer ni ingerir bebidas en el Laboratorio/ No masticar chicle
 Limpiar el sitio de trabajo
 Distribuirse según los grupos asignados por el Instructor.
 La cristalería que se va a revisar dejarla en orden en el sitio de almacenamiento
 Chequear que las máquinas se encuentren limpias y en buen estado para su
identificación y revisión.

EQUIPAMIENTO
EQUIPOS
1. Balanza de Precisión Electrónica 0,0000 g
2. Horno de esterilización
3. Incubadora de microorganismos (Bacterias, Fungi)
4. pHmetro digital de mesa
5. Destilador de agua- Desionizante
6. Cabina de flujo laminar Nivel de Bioseguridad II
7. Plancha de agitación y calentamiento

MATERIALES

INSUMOS
1. Detergente Químico

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Ing. Yuria Martínez

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2. Hisopo
3. Algodón
4. Papel de aluminio
5. Papel Sellador Envoplast
6. Papel kraft
7. Cloro
10. Alcohol al 70 %

MATERIALES
1. Caja de Petri
2. Asas
3. Erlenmeyer
4. Bomba manual pipeteadora
5. Tubos de ensayo

PROCEDIMIENTO

Actividad en Laboratorio:
1. Parte A: Preparación y Esterilización de materiales.
2. Parte B: Preparación y Esterilización de Medios de Cultivo.

NOTA: Por favor, tenga en cuenta que está trabajando y manipulando microorganismos:
No hable durante su manipulación para evitar contaminaciones, desinféctese las manos
muy bien antes y después de manipularlos y no olvide usar gorro, tapabocas y bata de
laboratorio, ya que sin este tipo de precauciones se pueden ocasionar accidentes en el
laboratorio. Cualquier duda que tenga por favor pregunte al instructor

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Los microorganismos viven en equilibrio dinámico con el medio ambiente; este equilibrio
puede ser roto por cualquier agente físico químico. Por “control” de los microorganismos
se entiende tanto la inhibición del “crecimiento” (multiplicación) microbiano como la
destrucción de aquellos.

CONCEPTOS BÁSICOS. Los microorganismos viven en equilibrio dinámico con el medio

ambiente; este equilibrio puede ser roto por cualquier agente físico químico. Por “control”
de los microorganismos se entiende tanto la inhibición del “crecimiento” (multiplicación)
microbiano como la destrucción de aquellos.

En este contexto se emplean una serie de términos que definimos brevemente:

Esterilización: Es el proceso que destruye todas las formas viables de cualquier agente
microbiológico contenido en un producto, tanto en forma vegetativa como en forma de

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resistencia. La esterilidad es algo absoluto e incluye la destrucción de las esporas, las

formas vegetativas, los virus, etc.

Desinfección: es el proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los

Microorganismos más comunes (sobre todo patógenos), pero no necesariamente las
esporas. En el contexto de salubridad, lo que se pretende crear es la imposibilidad de una
infección posterior por un germen determinado, en el contexto de biotecnología
industrial se usa para prevenir la contaminación del material biológico que participa en el
proceso. Generalmente, el desinfectante es un producto químico excesivamente tóxico
para ser usado directamente sobre tejidos vivos, por lo que se suele aplicar a seres
inanimados, o a seres vivos en zonas superficiales. Muy pocos desinfectantes llegan a
esterilizar.

Antisepsia: es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los

microorganismos patógenos más comunes, pero no necesariamente esporas, presentes
sobre el cuerpo, la piel, las mucosas, los tejidos vivos, etc. Acción ejercida por unos
agentes químicos que se oponen a la sepsis (putrefacción). Con ello se previene o
detiene el desarrollo de microorganismos, ya destruyéndolos o inhibiéndolos en su
crecimiento. El agente empleado se denomina antiséptico y se suele aplicar sobre tejidos
vivos, debido a que el desinfectante es más enérgico que el antiséptico.

Asepsia: se refiere a la ausencia de microorganismos de un objeto o área. Conjunto de

técnicas que tienen por objeto evitar la llegada o acceso de los microorganismos a los
productos o medio ambiente, impidiendo con ello la contaminación ( laboratorios...).

Antibiosis: efecto producido por los antibióticos, sustancias químicas producidas por un
microorganismo que actúan sobre otro tipo de microorganismos. Los antibióticos, al
principio, se obtenían sólo a partir de los microorganismos, pero hoy día se obtienen,
sobre todo, por síntesis química en el laboratorio, de ahí que el término antibiótico se
sustituya por el de quimioantibiótico.

Estos se clasifican en dos grupos:

 Microbicidas: actúan produciendo la muerte de las formas viables de los

microorganismos como bacterias (bactericidas), hongos (fungicidas) o virus
(viricidas).
 Microbiostáticos: actúan no destruyendo, sino inhibiendo el crecimiento de las
bacterias (bacteriostáticos), hongos (fungistáticos) o virus (virustáticos) de forma
reversible, de tal modo que al cesar el producto cesa la acción.

Limpieza del Material de vidrio. La limpieza del material de vidrio tiene que ser

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esmerada y debe tener siempre presente la norma de limpiarlo después de usado, de

modo que quede dispuesto para su empleo inmediato. Además si se deja largo tiempo sin
limpiar, es más difícil de eliminar la suciedad.

Se usan agentes de limpieza, pero se ayuda con medios mecánicos. Las escobillas son
muy utilizadas, pero hay que proceder con cuidado y evitar que el alambre toque al vidrio,
pues por ligero golpe se rompería. Como agentes de limpieza se emplean detergentes
aniónicos y no iónicos como el Extran MA01 o MA02. Si la suciedad no se elimina, se
emplea un poco de carbonato sódico, frotando con la escobilla.

 Métodos de esterilización.

Los métodos de esterilización: Comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y

preferentemente químicos que se emplean para destruir gérmenes patógenos.

Métodos Físicos:

Calor húmedo, ebullición, pasteurización, vapor a presión (autoclave), calor seco

Para realizar la esterilización se deben hacer paquetes bien cerrados y ordenados para
que haya buena penetración de vapor en el material.
No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilización.
El método utilizado para envolver los paquetes deberá garantizar el mantenimiento de las
condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento.

Procedimiento:

1. Poner 2.5 lts. de agua destilada en el autoclave.

2. Disponer el material a esterilizar sobre una plataforma evitando amontonamiento. Los
frascos deben estar con la tapa floja y las cajas metálicas con la tapa entreabierta.
3. Cerrar y atornillar la tapa de la autoclave.
4. Verificar que la llave de salida se encuentre abierta.
5. Encender la fuente térmica para hervir el agua dentro del autoclave.
6. Purgar hasta 5' después que se vea salir por la llave de escape solo vapor.
7. Cerrar la llave.
8. Controlar el aparato de registro que puede ser un manómetro calibrado o un
termómetro. Cuando el aparato registre 1.054 grs./cm2, 15 lbs/sq.in, 121ºC o 249.°F, se
empezará a contar el tiempo.
9. Mantener el registro constante durante 15-20 minutos.
10. Apagar la fuente térmica y dejar enfriar sin abrir.
11. Cuando la temperatura o presión haya descendido, abrir la llave de escape de vapor.
12. Abrir el autoclave.

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Los materiales salen húmedos por el contacto con el vapor. Aquellos que estén envueltos
en papel deberán secarse en la estufa, ya que el papel mojado es muy fácil de romper y el
material se contaminaría nuevamente.

Disposición de desechos
Colocar el medio de cultivo sólido sobrante sobre un papel y envolverlo, colocar el
paquete en una bolsa de plástico y desecharlo en el contenedor rojo.

MEDIOS DE CULTIVO

Los caldos no necesitan calentamiento ni ninguna otra manipulación antes de ser

llevados al autoclave. Las soluciones con agar sin embargo, requieren calentamiento casi
hasta ebullición con agitación constante y a fuego suave (o a Baño María o microondas)
para lograr su solubilización completa. Se debe observar con cuidado la solución durante
el calentamiento ya que una vez que aparecieron las primeras burbujas tiende a
desbordar por ebullición.

Luego los medios se dosifican teniendo en cuenta el uso que se les dará. Los tubos que
contengan estas soluciones que serán esterilizadas en autoclave deben contener sólo
dos terceras partes de su volumen total ocupado por el líquido para evitar desbordes. Así
preparadas las soluciones deben esterilizarse en autoclave (15 minutos a 121 ºC). Una
vez retirados del autoclave, los medios deben dejarse enfriar y conservarse así
refrigerados.

Si van a ser utilizados en el momento se colocarán en un baño de agua a 55 ºC para que

se enfríen antes de verterlos sobre las placas. Si sobre la superficie de una placa recién
preparada aparecieran burbujas, éstas pueden eliminarse al pasar rápidamente la llama
del mechero de alcohol sobre la superficie del agar.

Recomendaciones

 Leer cuidadosamente el rótulo del envase. Controlar la fecha de vencimiento.

 No introducir ningún tipo de herramientas en el medio (espátulas, varillas,
cucharas, etc.)
 Para homogeneizar el medio agitar tomando el envase desde el cuello del
erlenmeyer, evitar las varillas de vidrio.

Los tubos con tapa a rosca no deben ajustarse completamente cuando se introducen en
el autoclave para su esterilización, la tapa debe quedar con media rosca. Una vez
retirados del autoclave, sí deben ajustarse para minimizar los riesgos de contaminación.

PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE SUPERFICIES:

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Previamente revisar condiciones de Bioprotección.

1. Con un paño húmedo pasar Jabón detergente y dejar actuar por 5 minutos.
2. Enjuagar con agua potable o limpia
3. Aspersar Hipoclorito de Sodio al 3% en Solución. Dejar 3 minutos
4. Enjuagar con un paño humedecido
5. Aspersar Alcohol al 70% y dejar actuar hasta evaporar

PARTE A. MATERIALES

OBJETIVO:
Alistar y esterilizar el material de vidrio para procesos microbiológicos

PROCEDIMIENTO
Seguir las instrucciones del instructor y monitor para la desinfección, envoltura y posterior
esterilización del material de vidrio utilizado en la práctica, tener en cuenta los
fundamentos teóricos.

A. Procedimiento de Limpieza y Desinfección de Superficies:

Previamente revisar condiciones de Bioprotección.
6. Con un paño húmedo pasar Jabón detergente y dejar actuar por 5 minutos.
7. Enjuagar con agua potable o limpia
8. Aspersar Hipoclorito de Sodio al 3% en Solución. Dejar 3 minutos
9. Enjuagar con un paño humedecido
10. Aspersar Alcohol al 70% y dejar actuar hasta evaporar

B. Preparación y esterilización de material de vidrio.

1. Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al
final con agua destilada.
2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al aire.
3. En las pipetas de 1.0 mL colocar (con un clip) un filtro de algodón en la boquilla.
4. Envolver las cajas de Petri y pipetas con papel kraft de acuerdo a las indicaciones del
instructor.
5. Introducir los hisopos en un tubo de 22 x 175 y tapar con algodón.
6. En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de las pipetas.
7. Introducir el material en un horno previamente calentado a 180ºC, esperar a que la
temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento contar el tiempo de
esterilización (1 hora).

C. Preparación y esterilización de medios de cultivo.

Medio de cultivo líquido
1. Leer cuidadosamente la etiqueta del medio de cultivo deshidratado.
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 100 mL de caldo del medio de cultivo

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deshidratado (ver figura 2).

3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida
para evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Disolver el medio en 50 mL de agua destilada en un matraz de 250 mL, y una vez
disuelto completar el volumen con 50 mL más.
5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2. con HCl 0.1M o solución de NaOH 0.1M según sea el
caso
6. Colocar 10 mL de caldo en 5 tubos de 16x150 c/u.

C-1. Medio de cultivo semisólido

1. Colocar los 50 mL restantes del caldo en el matraz de 150 mL y calcular la cantidad

necesaria de agar-agar para obtener un medio semisólido (2 g agar/ 1 L medio)*.
2. Tapar el matraz y calentar hasta disolver totalmente, procurando agitar repetidamente.
3. Una vez fundido el medio de cultivo semisólido colocar 10 mL en 5 tubos de 16x150
c/u.
*NOTA: si el medio de cultivo está deshidratado, hacer los cálculos y disolver con
calentamiento.

C-2. Medio de cultivo sólido

1. Leer cuidadosamente la etiqueta del medio de cultivo deshidratado.
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 70 mL de medio de cultivo sólido
deshidratado y seguir los pasos 3 y 4.
3. No medir pH. No es recomendable para medios que contienen agar-agar.
4. Tapar el matraz y calentar hasta disolución total, para ello agitar repetidamente y evitar
que el medio de cultivo hierva y se derrame.
5. Distribuir el medio de cultivo en el siguiente material:
2 tubos de 22x175 con 20 mL
4 tubos de 16x150 con 7 mL
6. Tapar cada uno de los tubos con algodón, etiquetarlos y esterilizarlos en autoclave a
121oC y 15 lbs. de presión durante 20 minutos.

NOTA 1. No pipetear el agar fundido pues se tapará la pipeta. Para ello medir el volumen
con agua y marcar los tubos, posteriormente agregar el medio hasta dicha marca.

NOTA 2. Un medio de cultivo sólido (agar) se puede preparar a partir del medio de cultivo
líquido (caldo), agregando a éste la cantidad necesaria de agar-agar (15 a 20 g agar/ 1 L
medio) para el volumen de medio de deseado.

A. Control de calidad del proceso de esterilización

Actividad para un equipo por mesa

1. Colocar los tubos con agar inclinado con las cajas de Petri en forma invertida en estufa

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de incubación ajustada a 30°C durante 24-48h

2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la
aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de tubos con
medio liquido; así como la formación de colonias microbianas en la superficie de medios
sólidos.
3. Si no hay contaminación de los medios se abrirá una de las cajas de Petri de cada
medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiqueta como
aire.
4. la otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y
se etiquetara – en área aséptica-
5. La tercera caja se etiqueta sin abrir y se etiqueta como control.
Precauciones generales
Al calentar los medios de cultivo con agar-agar es muy importante procurar agitar
repetidamente el medio para evitar que el agar-agar se pegue en el fondo del matraz y
que se queme. Asimismo evitar que hierva para evitar su derrame.
Etiqueta debidamente tu material de vidrio (tubos d ensayo, matraces) antes de verter los
medios de cultivo en ellos. Procura no utilizar maskin-tape.
Los cestos o las latas metálicas deben estar debidamente forradas con papel kraft o de
estraza.

El material donde se preparó el medio de cultivo sólido (agar-agar) debe ser lavado con
agua y jabón inmediatamente después de su uso. Así evitarás que el agar-agar se pegue
al vidrio.
Antes de mandar a incubar el material con los medios de cultivo, verifica la manera cómo
hay que prepararlo para que sean recibidos (Reglamento del Área de Esterilización e
Incubación).

Figura No 2. Representación esquemática de la preparación de medios de cultivo.

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PARTE B. MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO:
Conocer el procedimiento para la preparación de material estéril y medios de cultivo.

MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO

1. Caldo peptona
2. Agar nutritivo
3. Agar Patata Glucosa
4. Agar Saboraud con cloranfenicol
5. Agar Avena
6. Agar King B
7. Agar MRS
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PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO:

 Lea la etiqueta del medio de cultivo y siga al pie de la letra las instrucciones que
en ella se indican.
 Haga las cuentas correspondientes para preparar los medios de cultivo que se le
indiquen en clase.
 Pese el medio y agréguele la cantidad de agua indicada (solo use agua destilada).
 Luego lleve a hervir el medio con el objeto de que el polvo se disuelva por
completo (hay algunas excepciones). El procedimiento se realizará con agitación
constante del recipiente que contiene el medio de cultivo.
 Si se va a preparar caldos de cultivo se utiliza medios sin agar, y no se lleva a
ebullición el medio
 Lleve a esterilizar el medio en autoclave a 121 ° C, 15 lb de presión 15 min.
 Los medios que contienen sustancias alterables por las altas temperaturas debe
esterilizarse por el método fraccionado, los que contienen azúcares y antibióticos
se esterilizan a 12lb de presión.
 Se deja atemperar y se sirve en cajas de Petri, tubos inclinados o tubos tapa
rosca, según sea el método de siembra que se vaya a trabajar.

EVIDENCIA DE LA ACTIVIDAD PRÁCTICA

A. Elaboración de un trabajo en grupo sobre los contenidos conceptuales que se

exponen en el siguiente taller a preguntas:
1. Conceptos básicos: esterilización, desinfección, sepsis, asepsis, asepsia,
antisepsia, antibiosis, microbicida y microbiostático.
2. ¿Qué se hace con el material desechable? ¿Y con el reutilizable?
3. ¿Cómo se realiza la limpieza del material en el laboratorio de microbiología?
4. ¿Qué diferencia hay entre la descontaminación por calor seco y con calor
húmedo?
5. Describir las técnicas que existen de descontaminación por calor seco.
6. Describir las técnicas que existen de descontaminación por calor húmedo.
7. Explicar qué es un autoclave, para qué se utiliza, cuál es su fundamento y sus
elementos principales, cómo se maneja y las precauciones que se han de tomar
en su manejo.
8. ¿Qué diferencia existe entre la tindalización, la uperización y la pasteurización?
¿Para qué se utiliza cada técnica?
9. Realizar un esquema con los tipos de tratamientos de descontaminación que se
pueden realizar a temperatura ambiente. ¿Qué diferencia hay entre los físicos y
los químicos?
10. ¿Qué tipos de radiaciones se pueden utilizar en procesos de descontaminación?
¿Qué peligros pueden suponer?
11. ¿Cuáles son los sistemas de filtración que se pueden utilizar en procesos de
descontaminación? Explicar cada uno de ellos.

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12. Realizar un esquema de las técnicas de descontaminación química. ¿Cuál es el

efecto que produce cada uno de ellos? ¿Cuáles son de esterilización y cuáles de
desinfección?
13. Describir los controles de esterilización que se pueden realizar y cuál es el
fundamento de cada uno de ellos.

B. Exposición del trabajo: una persona de cualquier grupo inicia la exposición del
tema (EL TEMA SERÁ SUMINISTRADO POR EL INSTRUCTOR), pudiendo ser
ayudada por sus compañeros de equipo. Los restantes equipos tomarán nota de
aquellas ideas o detalles importantes que no hayan sido incluidos en el trabajo
expuesto, lo cual servirá de enriquecimiento para el mismo.

C. Una vez concluida la exposición se iniciará un debate en el que el resto de los

aprendices y el Instructor pueden y deben intervenir exponiendo:
- Las ideas que no han sido desarrolladas.
- Las ideas que estén en contraposición con las del equipo propio
- Las ideas ajenas al tema o de escasa importancia.

D. Desarrollo de las ideas clave sobre el tema (breve exposición del Instructor).

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