Reparación de Tejido Óseo:

“Biopolímeros en regeneración ósea”

Jonathan Castro Roaa.

a
Universidad Nacional Autonoma de México, Facultad de Ingeieria,Crcuito Interior 3000, Ciudad de México CP 04510, México.

RESUMEN

El hueso, como tejido vital, tiene una gran resistencia mecánica debido a los compuestos de su matriz extracelular. La
matriz ósea, con compuestos orgánicos e inorgánicos, es el punto de partida para toda la gama de biomateriales aplicados
en los procedimientos de injerto. Los biomateriales ahora se producen a nano-escala para funcionar como un andamio y
facilitar la reparación ósea. Es una opción al injerto autógeno o al xenoinjerto. En este articulo veremos dos diferentes
Biopolímeros para aplicar en el tratamiento de diversos defectos óseos. El primer biopolímero es la suma de Fibrina más
células madre de ratas: Se logra obtener un biopolímero compatible y estable para aplicar. El Segundo biopolímero es
hueso ovino perfectamente limpio, granulado y tamizado, más extracto de agua de Lipidium savitum y dihidrato de fosfato
de calcio como agente mineral.
Palabras Clave: Matriz extracelular, injerto, xenoinjerto y mineral.

ABSTRACT

Bone, as vital tissue, has great mechanical resistance due to the compounds of its extracellular matrix. The bone matrix
with organic and inorganic compounds is the starting point for the entire range of biomaterials applied in grafting
procedures. Biomaterials are now produced at the nanoscale to function as a scaffold and facilitate bone repair. It is an
option to autogenous graft or xenograft. In this article we will see two different Biopolymers to apply in the treatment of
various bone defects. The first biopolymer is the sum of Fibrin plus rat stem cells; It is possible to obtain a compatible and
stable biopolymer to apply. The second biopolymer is perfectly clean, granulated and sieved sheep bone plus Lepidium
savitum water extract and calcium phosphate dihydrate as a mineral agent.

Keywords: Extracellular matrix, grafting, autogenous graft, xenograft and mineral..

1. Introducción 1.1. Defectos en el sistema óseo

El hueso es un material compuesto natural, que en peso
contiene aproximadamente 60% de minerales, 30% de
matriz y 10% de agua; La matriz del hueso está compuesta
principalmente de colágeno tipo I que está altamente
alineado, produciendo una estructura muy anisotrópica.
Este componente orgánico del hueso es el principal
responsable de su resistencia a la tracción. Un hueso se
compone de dos partes principales, el hueso cortical y el
hueso trabecular El hueso cortical también se llama hueso
compacto, mientras que el trabecular a veces se llama
hueso esponjoso.
La fase mineral del hueso está compuesta
principalmente por hidroxiapatita natural (HA). Por lo
tanto, los cementos basados en HA sintético y otras sales
de calcio, fosfatos y sulfatos, se encuentran entre los
materiales más investigados para aplicaciones dentales y
ortopédicas en cirugía reconstructiva. Los principales
involucrados en el éxito de los injertos óseos incluyen la
osteoconducción, la osteoinducción y la osteogénesis; las
desventajas del sulfato de calcio son su efecto citotóxico
transitorio que conduce a reacciones inflamatorias, se
reabsorbe completamente después de la implantación y no
tiene resistencia a la compresión in vivo
Un defecto óseo se define como el defecto de menor
tamaño que no se reparará sin intervención médica.
Dependiendo del hueso involucrado, el " tamaño crítico "
de un defecto no sindical puede variar: antebrazo (3 cm),
fémur y tibia (5 cm) y húmero (6 cm).
Esto ha llevado a una amplia investigación sobre
materiales alternativos de injerto óseo, como polímeros,
metales y cerámica. Su función no es solo llenar la fisura
ósea sino también proporcionar soporte estructural y
mecánico. Se está desarrollando un número cada vez
mayor de materiales de injerto naturales y sintéticos,
favoreciendo los compuestos ya que combinan todas las
propiedades ventajosas de los biomateriales monolíticos
individuales.
Una investigación de la literatura ha demostrado que a
pesar de que los polímeros sintéticos se han utilizado
ampliamente en la investigación ósea en los últimos diez
años, no se puede decir lo mismo de los polímeros
derivados de forma natural
1.2. Problema de la fracturas óseas
Los huesos sostienen los cuerpos humanos durante toda
su vida. Y desde la antigüedad, las personas se están
rompiendo los huesos debido a accidentes que resultan en
lesiones graves, deportes extremos, accidentes de tránsito,
envejecimiento y enfermedades óseas (baja densidad
ósea, la osteoporosis debilita los huesos y hace que sea
más fácil romperlos, la osteogénesis imperfecta hace que
los huesos se vuelvan frágiles, la enfermedad de Paget los
hace débil, cáncer, infecciones y otras enfermedades óseas
causadas por problemas de nutrición, genética o
crecimiento óseo o reconstrucción insuficientes.
1.3. Métodos y tratamientos de fracturas óseas
Los huesos, a diferencia de muchos otros tipos de
tejidos, pueden regenerarse. En vista de esto, el injerto
óseo es posible para el tratamiento de fracturas óseas.
Existen cuatro tipos de injertos óseos:
1) El injerto óseo autólogo (o autógeno) es usar
hueso tomado de la misma persona que recibe el
injerto
2) El injerto óseo de aloinjerto es un hueso obtenido
de cadáveres
3) Los xenoinjertos son sustitutos óseos extraídos
de un donante que no sea humano y se injertan
en un cuerpo humano (hueso bovino y porcino,
coral natural).Los xenoinjertos se aplican
comúnmente como una matriz calcificada. Tanto
los aloinjertos como los xenoinjertos excluyen
las complicaciones del sitio donante, pero
algunas propiedades biológicas (osteogénicas y
osteoinductoras) pueden reducirse.Y un
xenoinjerto bovino puede no ser el más relevante
para la cirugía de pie y tobillo.
4) Hueso Artificial Los biomateriales óseos
artificiales comúnmente estudiados son:
aleaciones de titanio, circonia, acero,
1.4. Alternativas sinteticas
Actualmente, los injertos óseos autógenos todavía se
consideran el estándar de oro en los injertos óseos debido
a sus propiedades osteogénicas. Sin embargo, su
aplicación presenta inconvenientes, como la cantidad
limitada de tejido óseo donante y la necesidad de una
segunda cirugía para extraer el injerto, lo que provoca un
aumento en el tiempo de recuperación. En este escenario,
los injertos óseos sintéticos ofrecen una alternativa
importante debido a su disponibilidad ilimitada. Los
compuestos que contienen fosfatos de calcio comprenden
la clase principal de biomateriales utilizados en el
reemplazo y en la regeneración del tejido óseo. Sus
características principales
incluyen biocompatibilidad, bioactividad y ausencia de
toxicidad e inmunogenicidad.
La asociación entre los materiales de fosfato de calcio y
las
células madre mesenquimales presenta un buen potencial
osteogénico, ya que estas células madre tienen una
superficie adecuada para la adhesión y actividad celular,
actuando así como un estímulo para la diferenciación en
los osteoblastos
En esta investigación tenemos como objetivo analizar
dos diferentes tipos de biopolímeros utilizados para la
regeneración de tejido óseo.
2. Desarrollo
2.1. Fibrina para tartar defectos óseos en ratas.
Los selladores de fibrina son biopolímeros naturales
dotados de adhesivo, sellador y propiedades hemostáticas,
y son adecuados para la adhesión celular y la estabilidad
del tejido. Son ampliamente utilizados como andamios y
en sistemas de administración de fármacos, lo que permite
la aplicación precisa de biomateriales, células, enzimas o
factores de crecimiento. Este biomaterial, en condiciones
excepcionales, puede transmitir enfermedades
transmitidas por la sangre.
Investigadores de la Universidad Estatal de São Paulo
(UNESP), Brasil, propusieron la producción de un nuevo
biopolímero de fibrina (FBP), previamente identificado
como sellador de fibrina heterólogo, que no usa productos
derivados de la sangre humana. Por lo tanto, una enzima
serina proteasa similar a la trombina aislada de “Crotalus
durissus terrificus” veneno de serpiente y un
crioprecipitado rico en fibrinógeno extraído de Bubalus
bubalis fueron empleados. Este producto fue patentado,
probado a través de varios experimentos con animales y
aprobado por la Agencia Reguladora de Salud de Brasil
(ANVISA) para ensayos clínicos de fase I / II en el
tratamiento de pacientes con úlceras venosas crónicas, en
los cuales el producto demostró ser seguro.
Se demostró que el biopolímero de fibrina producido
por CEVAP tiene una excelente interacción con las
células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea
de las ratas. Forma una estructura tridimensional que
permite la adhesión celular, la diferenciación y la
proliferación, propiedades también observadas en
polímeros comerciales. Además, se obtuvieron resultados
satisfactorios asociando FBP con hidroxiapatita sintética
en el tratamiento de defectos craneales en ratas.
El biopolímero de fibrina (FBP) (Fig. 1A) fue
suministrado por CEVAP. Los componentes y la fórmula
del producto están cubiertos por patentes (números de
registro: BR1020140114327 y BR1020140114360). Los
componentes se mezclaron con el uso de la siguiente
manera: 10 µl de fracción 1 (girosina), 25 µl de fracción 2
(crioprecipitado de fibrinógeno) y 15 µl de fracción 3
(diluyente); resultando en un volumen final de 50 µL de
sellador y manteniendo la concentración estándar.

Figura 1A: Vial de biopolímero de fibrina.
2.2. Aislamiento y expansión en Células madre
mesenquimales
Para recolectar las células de la médula ósea, las ratas se
sacrificaron por sobredosis de isoflurano a una
concentración alveolar mínima (MAC> 5%) y, después de
que se confirmó la inconsciencia de los animales,
dislocación cervical. Las células de la médula ósea se
obtuvieron por centrifugación de los fémures y tibias, que
se colocaron verticalmente en tubos cónicos que
contenían 1000 µl de medio Eagle modificado de
Dulbecco (DMEM®, Gibco-Invitrogen, EE. UU.) De
glucosa alta, y se centrifugaron a 2.500 rpm durante cuatro
minutos[4]. Cuando las células alcanzaron
aproximadamente el 90% de confluencia, se realizó el
paso celular. Para este proceso, se desechó el medio de
cultivo en el matraz; Se añadieron 2 ml de solución salina
tamponada con fosfato (PBS) para lavar y se descartó
posteriormente.
2.3. Asociación de FBP con células madre
mesenquimales y fosfato de calcio
En el sitio del defecto óseo y según el grupo, 50 µL de
FBP, 15 mg de fosfato de calcio bifásico y 10 µL de medio
de cultivo completo se añadieron células previamente
caracterizadas. En el grupo en el grupo que solo se
implantó el fosfato de calcio bifásico (G2), los gránulos se
colocaron directamente en el sitio del receptor de la lesión
/ implante, agregando y compactando los gránulos con la
ayuda de una espátula. Para la asociación de BCP y FBP
(G3), las fracciones 2 y 3 de este último se
homogeneizaron en una placa de cultivo celular, se añadió
fosfato de calcio y, finalmente, se añadió la fracción 1. El
coágulo formado se transfirió luego al sitio del defecto.
Después de contar las células madre mesenquimales y
asociarlas solo con FBP (G4) o FBP y con BCP (G5), se
transfirió un volumen de 2 ml a microtubos y se
centrifugó.
A continuación, las células se resuspendieron en
microtubos de 2 ml, que comprenden un volumen medio
completo de 10 µl, y luego se agrega a un microtubo que
contiene el biomaterial a base de calcio y las fracciones de
FBP como se describió previamente. El coágulo formado
se transfirió luego al sitio de la lesión.
• Grupo 1 (G1): defecto óseo sin relleno de material
(grupo control).
• Grupo 2 (G2): defecto óseo lleno de BCP.
• Grupo 3 (G3): defecto óseo lleno de FBP + BCP.
• Grupo 4 (G4): defecto óseo lleno de FBP + MSC.
• Grupo 5 (G5): defecto óseo lleno de FBP + BCP + MSC.
2.4. Procedimiento quirúrgico de defectos de fémur
Los animales fueron anestesiados con isoflurano a una
MAC del 3% para inducción y 1,5% para mantenimiento,
sin necesidad de ventilación mecánica. Después de la
confirmación de la inducción anestésica, los animales se
colocaron en decúbito lateral y se realizó una tricotomía
en la región anterior del muslo derecho. Se realizó una
incisión longitudinal medial en la piel del tercio distal
anterior de la región. Se retiró la piel lateralmente y luego
se separó el músculo cuádriceps femoral, dejando al
descubierto el periostio, que se seccionó transversalmente
y se desunió de la superficie del hueso.
Después de la exposición del tejido óseo, se indujo un
defecto óseo de 5 mm de diámetro y 2 mm de ancho
utilizando una broca acoplada a un micro motor dental
a aproximadamente 3000 rpm, promoviendo así un
defecto óseo en la proximidad tercio de la diáfisis del
fémur derecho (Fig. 2). A lo largo del procedimiento de
inducción de defectos, el sitio de la lesión se regó
continuamente con solución fisiológica para evitar el
sobrecalentamiento en la región. Según el grupo, la
mezcla de componentes se agregó al defecto óseo
promovido.
Después de estabilizar el injerto, se realizó la sutura. En el
postoperatorio, los animales recibieron comida y agua. No
fueron inmovilizados en ningún momento. Las ratas
recibieron analgesia postoperatoria que consistía en
clorhidrato de tramadol a 5 mg / kg, ketoprofeno a 5 mg /
kg e hidrocloruro de enrofloxacina a 8 mg / kg por vía
subcutánea a intervalos de 12 horas durante tres días.
A los 30 y 60 días después de la cirugía se procedió a la
eutanasia de 4 roedores por grupo con anestesia 5% mayor
procurando no presentar inconvenientes en la parte de la
cirugía, se mandaron estos huesos a diferentes pruebas de
análisis para ver cual obtuvo mejores resultados.
Figura 2: Sitio
de defecto óseo
femoral 5mm.
 por 14 dias despues de esto las piezas se lavaron, se
secarón , se molieron y se Tamizaron al tamaño de
2.5. Analisis de Resultados. particulas de 90,125 y150 Micro metros.[3]

La adición del material de fosfato de calcio y las células

madre mesenquimales al andamio FBP durante la cirugía
mejoró el manejo y la aplicación de la asociación debido
a la formación de un compuesto moldeable, reduciendo
así el tiempo del procedimiento quirúrgico. Esto se debió
a la maleabilidad de la densa red de fibrina formada
durante la estabilización del coágulo.
Los parámetros cualitativos observados en las imágenes
indicaron una pobre proliferación celular y remodelación
en el grupo de control, lo que indica que las asociaciones
aplicadas actuaron como una guía para el proceso de
reparación, y la aplicación de las combinaciones probadas
mejoró el nivel de migración celular al sitio de la lesión.
3.3. Preparación de compuestos óseos
Los grupos compuestos óseos se prepararon mezclando
minerales de hueso de vaca y medio (agua) con CSD y LS
de acuerdo con la Tabla (1). El medio líquido se preparó
con agua desmineralizada destilada. La proporción de
humectación, es decir, la cantidad de medio a añadir al
cemento, se decidió en función de la trabajabilidad de la
masilla formada.

La baja proliferación celular dentro de los gránulos de

fosfato de calcio indicó reabsorción granular lenta. La
reabsorción del material depende de variables como el
tamaño de partícula y la porosidad, y en el caso de los
compuestos bifásicos, también en la proporción de sus
componentes. La porosidad de este material permite la
vascularización, la difusión de fluidos y la migración
celular y su reabsorción gradual por osteoclastos.
Tabla 1: Los grupos compuestos de hueso probado Compuesto I Hueso
Esto nos indica que si bien en todos los grupos no se logró y sulfato de calcio, Compuesto II Hueso y sulfato de calcio y LS,
la regeneración por la fibrina, esta agilizo la migración de Compuesto III Hueso y LS.
células para n pronta recuperación.
Se realizarón diferentes pruebas entre ellas: Medición
3. Dihidrato de Sulfato de Calcio+ Agua de Lipidium Infrarroja (FTIR), Microscopía electronica de Barrido
savitum + Mineral de hueso de Vaca. (SEM), Cromatografía de gas (GC) y Espectometro de
Masa (MS).
Los cementos a base de Dihidrato de sulfato de calcio
(CDS) tienen grandes aplicaciones en cirugía 3.4. . Resultados desacados de las pruebas.
reconstructiva pero este tiene el defecto de la citotoxicidad
como bien ya lo mencionamos arriba; en este metodología En la medición Infrarroja de la Transformada
se agregó polvo de extracto de agua Lipidium savitum deFourier (FTIR) el espectro de mineral de hueso de vaca
(LS) y se mezcla con mineral de hueso de vaca(BM). (BM), CDS, LS, fuerón obtenidos y tabulados en la Fig 2.
Se probó con CSD y LS para formar diferentes Todo los espectros fueron normalizados en base a una
compuestos óseos. Se comparó y evaluó la cristalinidad
de los minerales óseos, el tamaño del cristal, la sustitución
de carbonato tipo B, la variación en la relación de
carbonato a fosfato y el contenido de fosfato ácido entre
todos los compuestos en investigación.

3.1. Preparación de extracto de agua de lepidium

sativum.

Las semillas se limpiaron manualmente para eliminar

todas las materias extrañas, como polvo, suciedad,
piedras, semillas inmaduras y rotas. Se examinó su color,
longitud y forma y el extracto acuoso se preparó de
acuerdo con la Fitoterapia tradicional marroquí [3]. Se
mezcló exactamente 1 g de semillas en polvo con 100 ml línea de corrección.
de agua destilada.

3.2. Recolección Ósea y desprottección.

Se tomó la parte media del femur y se cortó en pedazos; FIG2: Espectro superpuestos de FTIR de mineral de hueso
de vaca (BM), BM + Di hidrato de sulfato de calcio (CSD), BM
las piezas óseas pusierón en solución de NaOH 0.6N (2%) + CSD + Extracto de agua de Lepidium savitum (LS), y
usando tres temperaturas diferentes a 20°, 60° y 80°, así BM+LS.

GC / MS de extracto de agua de Lepidium sativum:
Se analizaron los diferentes componentes químicos en el
extracto de agua LS mediante el uso de GC / MS. Los
resultados revelaron que el LS es rico en muchos
compuestos importantes como a) ácido sinapico, b) silano,
c) sabineno, d) ácido butanoico, e) leucina f) escualeno, g)
ácido aspártico, los compuestos más importantes en el LS.
El extracto de agua, la estructura química y los usos más
beneficiosos en medicina, especialmente en caso de
reparación ósea, se dan en Fig 6. Los compuestos
detectados se identificaron haciendo coincidir la base de
datos NIST2008 como compuesto intacto o derivado de
trimetilsililo. Los compuestos que contienen los grupos
funcionales • OH o NH se detectaron como • O-TMS o •
N-TMS derivados (volátiles). Los compuestos derivados
de TMS se caracterizaron más por el fragmento m / z 73
que corresponde al resto O-TMS o N-TMS.
Fig. 6. Los patrones EDX muestran los abundantes elementos
encontrados en el extracto de agua LS examinado por SEM-EDX
X
El espectro de MS del ácido sinaptico (Fig 2) se
caracterizó por los picos m / z abundantes principales en
164 (100%) y 179 (30%), que se deben a la escisión de los
grupos • COOH y OCH 3. Sabinene, escualeno y leucina
fueron confirmados por 95% de coincidencia con una base
de datos correspondiente. La leucina, el ácido aspártico y
el ácido butanoico se detectaron como su derivado de
OTMS (Fig. 5 y Fig 6 ) muestra los resultados del análisis
para LS.
3.5. Analisis de Resultados.
Los compuestos de sulfato de calcio son cada vez más
importantes importancia en el campo de los biomateriales.
El dopaje de CSD con polvo de LS prueba otros tipos de
sustitución ósea en lugar de carbonato tipo B, debido a la
presencia de otros iones como Zn, Mg y aminoácidos
como el ácido aspártico en el extracto de agua de LS, y
controla el tamaño del cristal de hidroxiapatia.
El aumento del contenido de fosfato ácido (el valor
máximo se detectó en el compuesto BM + CSD + LS) se
considera ahora como una gran ventaja de estos
compuestos; Este fosfato ácido estimula la remodelación
ósea de una manera que estimula a los osteoclastos para
comenzar la reabsorción. Además, la presencia de iones
de zinc actúa para aumentar la formación de hueso,
mineralización y disminuye la resorción ósea Se
recomienda que si se prueba in vivo, el compuesto BM +
CSD + LS sería un material sustitutivo óseo muy
prometedor, que podría ser osteogénesis y también tiene
notables efectos antiinflamatorios, antifúngicos y
antibacterianos
4. Conclusion
Ambos métodos son altamente eficaces en cuanto a la
regeneración ósea sin embargo queda en el segundo
método llevarlo a pruebas en animales y una vez logrado
esto realizar pruebas mecánicas en ambos huesos, tanto en
el de las ratas del método I como en el de los animales del
método II, para saber cual es mejor y si estos resultados
son iguales a un hueso sano y en caso de que no, que tanto
varían.
Estoy satisfecho al saber que los biomateriales
aplicados son biocompatibles y presentan una buena
interacción entre ellos y el tejido adyacente, mostrando
interfaces y osteointegración. Si bien no todos los grupos
cumplieron con regenerar el tejido óseo si fomentaban la
migración de células para que el hueso lo hiciera por si
solo que también es una avance significativo en la
investigación de auto regeneración.
Tuvimos que recurrir a muchísimas pruebas tanto de
infrarrojo como de difracción de rayos x para saber que
las composiciones fueran benéficas para el tejido y para el
cuerpo a largo plazo, lomas complicado por un lado seria
mantener a las ratas bajo un mismo patrón de
comportamiento ya que el hecho de elevar el estrés o
provocarles pánico podría afectar las pruebas y por otro
lado manipular los materiales para realizar los
biopolímeros requiere de mucho cuidado y medio
ambiente controlado.

FBP demostró ser un excelente candidato de armazón

en las terapias de reparación ósea debido a su facilidad de
aplicación, biocompatibilidad, biodegradabilidad y
propiedades bioactivas.

El dopaje de CSD con polvo de LS prueba otros tipos

de sustitución ósea en lugar de carbonato tipo B y todas la
pruebas arrojan resultados positivos acerca del metodo,
queda en una investigacion posterior realizar pruebas
pertienentes para ver como se desarrolla en animales
teniendo los cuidados necesarios para saber que
comportamiento tiene.

Referencias

[1] K. Jahan un y M. Tabrizian, Biopolimeros compuestos

para mejorar la regeneración ósea en defectos óseos.
(2016).
[2] Anastasiia Kashirina, Yongtao Yao, Yanju Liu,
Jinsong Leng s, Biopolimeros para sustitutos óseos:
una revision. (2019).

[3] Gehan A. Raouf, Hana Gashlan, Alaa Khedr, Salem

Hamedy, Hind Al-jabbri. Nuevo biopolimero para
injerto de hueso y cemento de hueso. (2015).

[4] Claudia Vilalva Cassaro, Luis Antonio Justulin Jr,

Patrícia Rodrigues de Lima,Marjorie de Assis Golim,
Natália Perussi Biscola,Mateus Vidigal de Castro,
Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, Danuta Pulz
Doiche, Elenize Jamas Pereira, Rui Seabra Ferreira Jr,
Benedito Barraviera, Biopolímero de fibrina como
candidato de armazón para tratar
defectos óseos en ratas (2019).

[5] Mahendra Rai, BNanotecnologia en piel, tejido suave

e infecciones de hueso: Biologia e ingenieria en
enfermedades de hueso (PP 223-240) (2020).