Marques AnaMaria M

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ANA MARIA MARQUES
Estimativa da idade da mutação Cys433Arg no gene

MYOC em pacientes com glaucoma primário de ângulo
aberto
CAMPINAS
2017
ANA MARIA MARQUES
Estimativa da idade da mutação Cys433Arg no gene

MYOC em pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto
Dissertação apresentada ao Instituto de

Biologia da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do Título de
Mestra em Genética e Biologia Molecular,
na área de Genética Animal e Evolução.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA
PELA ALUNA ANA MARIA MARQUES E
ORIENTADA PELA PROFª. DRª. MÔNICA
BARBOSA DE MELO.
Orientadora: PROFª. DRª. MÔNICA BARBOSA DE MELO
CAMPINAS
2017
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de Biologia
Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Marques, Ana Maria, 1991-

M348e MarEstimativa da idade da mutação Cys433Arg no gene MYOC em pacientes
com glaucoma primário de ângulo aberto / Ana Maria Marques. – Campinas,
SP : [s.n.], 2017.
MarOrientador: Mônica Barbosa de Melo.

MarDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Mar1. Mutação (Biologia). 2. Gene MYOC. 3. Glaucoma primário de ângulo

aberto. I. Melo, Mônica Barbosa de,1968-. II. Universidade Estadual de
Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Estimating the age of the Cys433Arg mutation in the MYOC gene
in patients with primary open-angle glaucoma
Palavras-chave em inglês:
Mutation (Biology)
MYOC gene
Primary open angle glaucoma
Área de concentração: Genética Animal e Evolução
Titulação: Mestra em Genética e Biologia Molecular
Banca examinadora:
Mônica Barbosa de Melo [Orientador]
Edi Lúcia Sartorato
Cláudia Vianna Maurer Morelli
Data de defesa: 23-02-2017
Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Campinas, 23 de fevereiro de 2017.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.ª Dr.ª Mônica Barbosa de Melo (Orientadora)
Prof.ª Dr.ª Edi Lúcia Sartorato
Prof.ª Dr.ª Cláudia Vianna Maurer Morelli
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se

encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
5
Aos meus pais, pelo apoio, amor e confiança.

6
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Mônica Barbosa de Melo por todo o
conhecimento científico transmitido, pela ajuda, conselhos e pela paciência ao longo
de mais de quatro anos.
Agradeço ao Profº Drº José Paulo Cabral de Vasconcellos pelo conhecimento
clínico transmitido e pela ideia do projeto.
Agradeço à minha co-orientadora, Dr.ª Galina Ananina que além do
conhecimento genético também me transmitiu um pouco da sua experiência com a
carreira acadêmica que com certeza ajudou e ajudará na minha formação. Obrigada
pela paciência e pelos conselhos que foram cruciais para a finalização deste projeto.
Agradeço aos amigos de laboratório, Bruno, que me ensinou todas as técnicas
quando estava na Iniciação Científica e continuou me ajudando durante o mestrado,
Pedro, pelas ajudas em genética de populações e as piadas de todos os dias e Paulo,
pela ajuda essencial durante a execução do projeto e pelas conversas na cantina para
descontrair. Agradeço também às amigas do lab pelo companheirismo e pela troca de
conhecimentos durante esse tempo, Ana Luiza, Gabi, Mirta, Sueli, Gi e Milena.
Agradeço em especial à técnica do laboratório, Danizinha, que estava sempre
disposta a ajudar com o que fosse preciso e por todas as conversas sobre os mais
variados assuntos. Obrigada pela amizade e ensinamentos.
Agradeço às amigas da graduação, minha querida Turma da Catequese, em
especial à Mari, Carla e Sín que sempre estavam dispostas ouvir minhas dificuldades
e acima de tudo, me apoiarem. Obrigada pela amizade.
Agradeço ao meu companheiro, Alex, pelo suporte de todos os dias, pelas
conversas sobre ciência, por sempre acreditar na minha capacidade e sempre me
incentivar.
Agradeço aos meus pais, Fátima e José Luís pelo imenso apoio em todas as
etapas, carinho e compreensão. Obrigada por sempre acreditarem em mim e
embarcarem nos meus sonhos junto comigo, sem vocês jamais teria conseguido em
chegar até aqui.
Por fim, agradeço à Capes pelo apoio financeiro, ao CBMEG e ao Instituto de
Biologia.
7
RESUMO
O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível, afetando mais de 60

milhões de pessoas e com perspectiva de atingir 76 milhões em 2020. O glaucoma
primário de ângulo aberto (GPAA) é a forma mais comum da doença, com padrão de
herança complexo e que se caracteriza como uma neuropatia ótica crescente
causando a perda de células ganglionares da retina. O principal fator de risco é a
pressão intraocular elevada, além do histórico familiar positivo, idade avançada e etnia
negra. Vários loci já foram associados ao GPAA, e o mais reprodutível e representativo
é o locus GLC1A no gene MYOC. A mutação Cys433Arg no gene MYOC foi observada
apenas na população brasileira e os poucos estudos sobre essa mutação revelam
uma alta penetrância em portadores de GPAA juvenil (GPAA-J), variando de 28 a
100%, de acordo com a idade do paciente. Estudos do tipo caso/controle apontam
que, no Estado de São Paulo, aproximadamente 30% dos pacientes com GPAA-J
portadores de alterações no gene MYOC apresentam a mutação Cys433Arg. O
objetivo desse estudo foi estimar a idade da mutação Cys433Arg por meio da
comparação dos genótipos dos indivíduos afetados e não afetados pelo GPAA-J. A
genotipagem foi realizada por meio de sequenciamento de Sanger para SNPs e
eletroforese automatizada para microssatélites. A determinação dos haplótipos e a
estimativa da idade foram realizadas por meio do software DMLE+. Com base neste
estudo é possível sugerir que esta mutação foi trazida para o Brasil pelos
colonizadores europeus, e aqui sua frequência foi aumentada.
8
ABSTRACT
Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness, affecting more than 60

million people and projected to reach 76 million by 2020. Primary open-angle glaucoma
(POAG) is the most common form of the disease, with a complex inheritance pattern,
which is characterized as a growing optic neuropathy causing the loss of retinal
ganglion cells. The main risk factor is elevated intraocular pressure (IOP), in addition
to positive family history, advanced age and black ethnicity. Several loci have already
been associated with POAG, and the most reproducible and representative is the
GLC1A locus in the MYOC gene. The Cys433Arg mutation in the MYOC gene was
observed only in the Brazilian population, and the few studies on this mutation reveal
a high penetrance in patients with juvenile POAG, ranging from 28 to 100% depending
on the age of the patient. Case-control studies report that, in the state of São Paulo,
approximately 30% of the patients that harbor mutations in the MYOC gene have the
Cys433Arg mutation. The aim of this study was to estimate the age of the Cys433Arg
mutation by comparing the genotypes of the individuals affected and not affected by
the JOAG. Genotyping wasperformed using Sanger sequencing for SNPs and
automated microsatellite electrophoresis. The determination of haplotypes and age
estimation were performed using DMLE+ software. Based on this study it is possible
to suggest that this mutation was brought to Brazil by European colonizers, and here
their frequency has been increased.
9
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 – Escavação do nervo óptico. A. Escavação normal do nervo óptico. B.

Escavação do nervo moderada. C. Grande escavação do nervo óptico com
consequente perda das fibras nervosas (modificado de http://cvi.med.br/)................18
Figura 2 – A. Representação de um olho com ângulo aberto (entre a córnea e a

íris). As setas verdes indicam o fluxo normal do humor aquoso, que é produzido no
corpo ciliar na câmara posterior e escoa até a câmara anterior onde é drenado através
da malha trabecular. Em B, há a representação de um olho com ângulo fechado,
onde o fluxo do humor aquoso é dificultado, devido a posição adjacente da íris e da
córnea, elevando o nível da pressão intraocular (modificado de
http://www.rajaneyecare.com/blog)...........................................................................19
Figura 3 – Representação da perda do campo visual periférico conforme o

desenvolvimento do glaucoma. A. Visão de um indivíduo sem glaucoma. B e C. Visão
com início de perda do campo visual periférico. D. Glaucoma extremo com grande
perda do campo visual e acometimento da visão (modificado de
http://cvi.med.br/).......................................................................................................22
Figura 4 – Características estruturais do domínio Olfactomedina. A. Representação

da vista superior e lateral da hélice do MYOC-OLF. B. Sítio de ligação do cálcio
interno e pontes dissulfeto na face inferior para a manutenção da estrutura de
algumas proteínas. C. Região de fecho molecular. D. Algumas regiões onde ocorrem
mutações que estão envolvidas com o desenvolvimento do glaucoma, como T377,
K423, P370, D378 (modificado de Donegan et al., 2015)...........................................27
Figura 5 – Heredograma da família 1 com 6 indivíduos analisados. Os indivíduos

preenchidos representam aqueles afetados por GPAA, enquanto que os circulados
representam aqueles selecionados para o estudo......................................................44
10


Figura 8 – Localização dos marcadores moleculares e da mutação no cromossomo 1

região q23-q24, compreendendo uma região de 5Mb.................................................46
Figura 9 – Eletroferogramas dos genótipos de uma amostra do conjunto 1 dos

marcadores microssatélites. A. Heterozigoto para rs3219828. B. Heterozigoto para
rs3221612. C. Homozigoto para rs3219958................................................................56
Figura 10 – Eletroferograma dos sequenciamentos dos SNPs. A. Homozigoto para o

SNP rs6133 B. Homozigoto para o SNP rs2255782 e C. Heterozigoto para o SNP
rs2255782...................................................................................................................56
Figura 11 – Representação dos haplótipos determinados para os indivíduos com a

mutação Cys433Arg. Os haplótipos são formados pelos marcadores rs3219828
(microssatélite), rs2266782 (SNP), rs2266780 (SNP) e rs2234708 (microssatélite). O
rs74315338 corresponde a mutação de interesse. A primeira coluna indica a
quantidade de cada haplótipo construído...................................................................60
Figura 12 – Gráfico das trajetórias das amostras MCMC gerado pelo programa
DMLE+, sendo que os primeiros dois milhões de iterações correspondem ao burn-in
e os dois milhões seguintes às iterações reais. Cada ponto no gráfico representa uma
iteração.......................................................................................................................62
11
Figura 13 – Histograma representando a idade da mutação em gerações, de acordo

com a frequência de cada uma, resultante das iterações realizadas pelo programa
DMLE+.......................................................................................................................63
Tabela 1 – Relação mutação-fenótipo de variantes do gene MYOC. Em destaque, a

mutação Cys433Arg, foco deste estudo, que exibe um fenótipo intermediário entre
uma mutação com efeitos mais brandos (por exemplo a Gln368Stop) e uma mutação
com efeitos mais severos (por exemplo a Pro370Leu) (modificado de Hewitt et al.,
2008)..........................................................................................................................29
Tabela 2 – Conjuntos de iniciadores utilizados para amplificação dos microssatélites

e respectivas temperaturas de anelamento e tamanho do fragmento amplificado......47
Tabela 3 – Conjuntos de iniciadores utilizados para amplificação dos SNPs e

respectivas temperaturas de anelamento...................................................................48
Tabela 4 – Programas das reações de PCR para a amplificação dos

microssatélites........................................................................................................... .49
Tabela 5 – Programas das reações de PCR para a amplificação dos SNPs............50
Tabela 6 – Programa das reações de sequenciamento dos SNPs...........................51
Tabela 7 – Caracterização dos marcadores microssatélites para os indivíduos não

aparentados (n=16). A: Número de alelos em cada locus. PIC: Polymorphism
Information Content ou Conteúdo de Informação Polimórfica. He: heterozigosidade
esperada. Ho: heterozigosidade observada...............................................................57
Tabela 8 – Caracterização dos marcadores SNPs para os indivíduos não aparentados

(n=16).........................................................................................................................58
12
Tabela 9 – Haplótipos determinados dos indivíduos não aparentados e das famílias

com a mutação Cys433Arg. Cada coluna indica um marcador e cada linha um
haplótipo. Cada número representa um alelo diferente de cada marcador, sendo
reiniciada a contagem para os diferentes marcadores. O valor -1 indica a falta de
informação sobre o alelo naquela posição. Os marcadores estão ordenados de acordo
com a posição no cromossomo...................................................................................59
13
LISTA DE ABREVIATURAS
AR alelo raro
ASB10 ankyrin repeat and SOCS box containing 10
ATOH7 atonal BHLH Transcription Factor 7
CAAE certificado de apresentação para apreciação ética
CAV1 caveolin 1
CAV2 caveolin 2
CDKN2B cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2B
CEP comitê de ética em pesquisa
cM centimorgan
cSNP polimorfismo de base única em região codificadora
DMRI degeneração macular relacionada à idade
DNA ácido desoxirribonucleico
dNTP didesoxinucleotídeos
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
FAM 6-carboxifluoresceína
GCP glaucoma congênito primário
GLC1A primeiro locus associado ao GPAA
GLC1E quinto locus associado ao GPAA
GLC1F sexto locus associado ao GPAA
GLC1G sétimo locus associado ao GPAA
GLC1O décimo quinto locus associado ao GPAA
GLC1P décimo sexto locus associado ao GPAA
GPAA glaucoma primário de ângulo aberto
GPAA-J glaucoma primário de ângulo aberto juvenil
GWAS estudo de associação genômica em larga escala
HCl ácido clorídrico
He heterozigosidade esperada
14
HEX hexacloro-fluoresceína
Ho heterozigosidade observada
KCl cloreto de potássio
kDA quilodaltons
M Morgan
MCMC Markov Chain Monte Carlo
MgCl2 cloreto de magnésio
mM milimolar
mmHg milímetro de mercúrio
mRNA ácido ribonucleico mensageiro
MYOC myocilin
NF-Kb factor nuclear kappa B
NTF4 neutrophin-4
OLF domínio olfactomedina
OPTN optineurin
pb pares de bases
PCR reação em cadeia da polimerase
PIC conteúdo de informação polimórfica
PIO pressão intraocular
pmoles picomoles
RGC célula ganglionar da retina
rpm rotações por minuto
SIX1 sineoculis homeobox homolog 1
SNP polimorfismo de base única
TBK1 TANK-binding kinase
Tm temperatura de anelamento
WDR36 WD repeat domain 36
ηg nanograma
μL microlitro
15
SUMÁRIO
Introdução ................................................................................................................ 17
1. Glaucoma ........................................................................................................ 18
1.1 Definição .................................................................................................. 18
1.2 Classificação ............................................................................................ 19
2. Glaucoma Primário de Ângulo Aberto (GPAA) ................................................ 21
2.1 Definição .................................................................................................. 21
2.2 Fatores e risco ......................................................................................... 22
2.3 Epidemiologia ........................................................................................... 23
2.4 Fatores genéticos do GPAA ..................................................................... 24
3. O gene MYOC e a miocilina ............................................................................ 25
3.1 Identificação do gene ............................................................................... 25
3.2 Estrutura do gene ..................................................................................... 26
3.3 Variantes e expressão do gene ................................................................ 27
3.4 Miocilina ................................................................................................... 30
4. Mutação Cys433Arg ........................................................................................ 30
5. Marcadores moleculares ................................................................................. 32
5.1 Polimorfismo de base única (SNP) ........................................................... 33
5.2 Microssatélites ......................................................................................... 34
Justificativa .............................................................................................................. 36
Objetivos .................................................................................................................. 38
1. Geral ............................................................................................................... 39
2. Específicos ...................................................................................................... 39
Casuística e Métodos ............................................................................................... 40
1. Pacientes ........................................................................................................ 41
1.1 Critérios de inclusão ................................................................................ 43
1.2 Critérios de exclusão ............................................................................... 43
1.3 Grupo controle ......................................................................................... 44
2. Heredogramas ................................................................................................ 44
3. Iniciadores e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) .................................. 45
4. Sequenciamento de Sanger e eletroforese automatizada ............................... 50
5. Controle de qualidade da genotipagem ........................................................... 52
5.1 Genótipos improváveis ............................................................................ 52
16
6. Determinação dos haplótipos .......................................................................... 53

7. Estimativa da idade da mutação ..................................................................... 53
Resultados e Discussão ........................................................................................... 55
1. Análises .......................................................................................................... 56
2. Haplótipos ....................................................................................................... 59
3. Estimativa da idade da mutação ..................................................................... 61
Conclusão ................................................................................................................ 68
Referências Bibliográficas ........................................................................................ 70
Anexos ..................................................................................................................... 81
ANEXO I .................................................................................................................. 82
ANEXO II ................................................................................................................. 84
ANEXO III ................................................................................................................ 85
ANEXO IV ................................................................................................................ 86
ANEXO V ................................................................................................................. 87
ANEXO VI ................................................................................................................ 89
17
Introdução
18
1. Glaucoma
1.1 Definição
O glaucoma é um grupo heterogêneo de neuropatias ópticas progressivas

(Sarfarazi, 1997) com base genética complexa (Weinreb et al., 2004) que se
caracterizam pela degeneração crescente de células ganglionares da retina e de seus
axônios, levando a danos no disco óptico que podem acarretar na cegueira
irreversível se não tratada corretamente (Ray et al., 2003). Essas neuropatias
reduzem a visão gradualmente e são praticamente assintomáticas, fazendo do
glaucoma a maior causa de cegueira irreversível no mundo (Sacca et al., 2011). Por
essa razão o diagnóstico precoce é muito importante (Bayat et al., 2008).
O nervo óptico é constituído por cerca de um milhão e duzentos mil axônios
que constituem as fibras nervosas, mas existe uma região sem fibras que é
denominada escavação do nervo óptico. Conforme a doença progride a escavação
aumenta, o que corresponde a perda das fibras, o que pode levar a cegueira (Varma
et al., 1992) (Figura 1).
A B C
Figura 1 - Escavação do nervo óptico. A. Escavação normal do nervo óptico. B. Escavação

do nervo moderada. C. Grande escavação do nervo óptico com consequente perda das fibras
nervosas (modificado de http://cvi.med.br/).
19
1.2 Classificação
No olho normal, o humor aquoso, líquido incolor responsável pela nutrição da

córnea e do cristalino e manutenção da tonicidade ocular, é produzido pelo corpo
ciliar, atrás da íris e flui através da pupila para ser drenado na malha trabecular que
fica em torno da circunferência entre a face anterior da íris e do endotélio da córnea,
na câmara anterior (Weinreb et al., 2004), caracterizando um ângulo entre os dois. A
diferença entre a produção do humor aquoso e sua drenagem determina a pressão
intraocular (PIO), que em indivíduos sem glaucoma varia entre 10 e 20 mmHg. Cerca
de 90% da drenagem do humor aquoso ocorre no ângulo da câmara anterior. Esse
ângulo é classificado a partir do exame de gonioscopia em: a) ângulo aberto,
visibilizando-se pelo menos 270 graus da malha trabecular, característica
anatômica mais comum entre os glaucomas b) ângulo fechado, quando a íris se
torna adjacente à malha trabecular, podendo assim dificultar a drenagem do humor
aquoso (Ritch et al., 1996) (Figura 2).
A B
Figura 2 – A. Representação de um olho com ângulo aberto (entre a córnea e a íris). As

setas verdes indicam o fluxo normal do humor aquoso, que é produzido no corpo ciliar na
câmara posterior e escoa até a câmara anterior onde é drenado através da malha trabecular.
Em B, há a representação de um olho com ângulo fechado, onde o fluxo do humor aquoso
é dificultado, devido a posição adjacente da íris e da córnea, elevando o nível da pressão
intraocular (modificado de http://www.rajaneyecare.com/blog).
20
O glaucoma é classificado também quanto ao fator preliminar que leva ao

desenvolvimento da doença, podendo ser: a) primário, quando as causas da doença
são desconhecidas ou b) secundário, quando há outras condições oculares ou
sistêmicas de causas conhecidas que levaram ao desenvolvimento da doença
(Leske et al., 1983).
A terceira forma de classificação é quanto à idade, podendo ser: a) congênito,
quando a doença se manifesta entre o nascimento e até 3 anos de idade; b) juvenil,
quando o glaucoma aparece entre 3 e 40 anos de idade e c) adulto, quando a doença
se instala depois dos 40 anos (Sarfarazi, 1997).
O glaucoma primário é dividido em três tipos: a) glaucoma congênito primário
ou infantil (GCP), b) glaucoma primário de ângulo fechado (GPAF), c) glaucoma
primário de ângulo aberto. O GCP (a) é uma anormalidade herdada no
desenvolvimento da malha trabecular e no ângulo da câmara anterior (Anderson et
al., 1983). Esse tipo de glaucoma acomete crianças até 3 anos de idade e cujo
aumento da PIO conduz a sinais clínicos clássicos, como o aumento do globo ocular
(buftalmo), alta miopia com astigmatismo, edema da córnea a opacificação, além de
lesão no nervo óptico. No caso de GPAF (b), alguns pacientes podem apresentar
pressões intraoculares elevadas devido a dificuldade de drenagem do humor aquoso,
pupila dilatada, olho vermelho, náuseas e/ou vômitos, enquanto que em outros casos,
os pacientes podem não ter queixas ou podem se queixar de dor de cabeça, dor nos
olhos, ou a visão de anéis em torno de luzes (Coleman, 1999). O glaucoma primário
de ângulo aberto (c) juvenil (GPAA-J) é uma doença que cursa com PIO elevada e
neuropatia óptica glaucomatosa progressiva associada com a perda do campo visual
característico, acometendo pacientes entre 3 e 40 anos. O glaucoma primário de
ângulo aberto (c) adulto (GPAA), afeta pacientes depois dos 40 anos, associado com
o aumento da PIO mas podendo também ocorrer em indivíduos com a PIO normal
(Khan, 2011).
O glaucoma secundário, diferentemente do GPAA, é mais comum na idade juvenil,
porém a lesão causal ofusca, muitas vezes, os sintomas da doença e por isso o
diagnóstico é tardio (Sihota et al., 1991). Dentre os tipos de glaucoma secundário
estão o glaucoma cortisônico que é causado pela terapia com corticoesteroides que
levam ao aumento da PIO e dano ao nervo óptico (Kersey et al., 2006) e o glaucoma
pigmentar, cujo dano glaucomatoso está associado com a síndrome de dispersão
pigmentar, caracterizada pela dispersão de pigmento proveniente do epitélio da íris
21
que se acumula no trabeculado, levando ao aumento da PIO (Niyadurupola et al.,

2008). O glaucoma pseudoexfoliativo, que é o mais comum dentre os glaucomas
secundários (Jeng et al., 2007), se desenvolve no contexto da síndrome pseudo-
exfoliativa, caracterizada pela produção e depósito progressivo de material
microfibrilar de forma anormal e generalizada na matriz extracelular por vários tecidos
do corpo, sendo que nos olhos pode levar ao aumento da PIO e danos no disco óptico
acarretando em glaucoma secundário (Schlötzer-Schrehardt et al., 2006; Borrás,
2014).
2. Glaucoma Primário de Ângulo Aberto (GPAA)
2.1 Definição
O glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA) é a forma mais comum com

que a doença se manifesta, caracterizada pela ausência de fatores oculares ou
sistêmicos para sua instalação. É detectada clinicamente pela perda da rima neural
com consequente aumento da relação escavação/disco e perda de campo visual
periférico correspondente, assim como ângulo aberto ao exame gonioscópico (Figura
3) (Quigley, 1993; Sarfarazi, 1997; Weinreb et al., 2004).
Apesar de o GPAA ser a forma mais diagnosticada da doença, existe o
subgrupo dos casos de GPAA-J que geralmente apresentam um padrão de herança
autossômico dominante e sinais clínicos mais agressivos, usualmente, necessitando
de intervenção cirúrgica (Johnson et al., 1996). Já para o GPAA nenhum padrão de
herança mendeliano pode descrever adequadamente a doença, por isso foi proposto
que a doença tenha uma etiologia complexa ou multifatorial (Weinreb et al., 2004).
22
A B
C D
Figura 3 – Representação da perda do campo visual periférico conforme o desenvolvimento

do glaucoma. A. Visão de um indivíduo sem glaucoma. B e C. Visão com início de perda do
campo visual periférico. D. Glaucoma extremo com grande perda do campo visual e
acometimento da visão (modificado de http://cvi.med.br/).
2.2 Fatores de Risco
Existem diversos fatores considerados de risco para o desenvolvimento do

GPAA. O principal fator associado com a doença é a PIO elevada, acima de 21mmHg
(Liu et al., 2011). Dentre os demais fatores de risco para o glaucoma estão a idade,
sendo que quanto maior a idade do indivíduo maior é o risco de desenvolver a doença
(Leske et al., 1994); a etnia, sendo que a doença é mais diagnosticada em pessoas
negras; indivíduos com alta miopia também tem maior incidência da doença
(Tomlinson et al., 1970; Quinn et al., 1995; Mitchell et al., 1999), e finalmente a
presença de história familiar (Leske et al., 1994), sendo que a relação de risco para
o desenvolvimento de glaucoma primário de ângulo aberto é de 9,2 para indivíduos
com histórico familiar positivo para a doença (Wu et al., 2006).
23
2.3 Epidemiologia
O glaucoma é a segunda maior causa de cegueira no mundo, atrás apenas da

catarata (Goldberg, 2000) e a maior causa de cegueira irreversível. Dados da
Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2010 mostram que cerca de 8% da
cegueira mundial foi causada pelo glaucoma, seguida pela degeneração macular
relacionada a idade (DMRI) com 5%
(http://www.who.int/blindness/GLOBALDATAFINALforweb.pdf; acessado em:
15/01/2017).
Estima-se que cerca de 64,3 milhões de pessoas foram afetadas pelo GPAA
até o ano de 2013, sendo que na Ásia estavam cerca de 60% dos casos de
glaucoma no mundo, seguido pela África com 13% (Tham et al., 2014). Para esse
mesmo ano, foi previsto que a cegueira bilateral atingisse cerca de 8,4 milhões de
pessoas no mundo (Quigley et al., 2006).
Perspectivas para o ano de 2020 indicam que 76 milhões de pessoas terão
glaucoma no mundo, sendo 52,7 milhões GPAA e 23,4 milhões GPAF. A
probabilidade de cegueira bilateral é de 11,1 milhões de pessoas (Tham et al., 2014).
Graças ao aumento da expectativa de vida, principalmente na Índia, o número
de pessoas com glaucoma deve aumentar 74% entre os anos de 2013 e 2040,
atingindo 111,8 milhões de pessoas afetadas por essa doença em 2040 (Quigley et
al., 2006). A Ásia ainda será o continente com o maior número de pessoas afetadas
pelo GPAA e GPAF com crescimento de 18,8 milhões (79,8%) e 9 milhões (58,4%),
respectivamente (Tham et al., 2014; Chan et al., 2016).
No Brasil, por meio de um estudo retrospectivo realizado no Setor de
Glaucoma do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP) com pacientes atendidos pela primeira vez, verificou-se um elevado dano
glaucomatoso com alta taxa de cegueira unilateral (51,8%) e bilateral (33,3%) (Gullo
et al., 1996).
Existem alguns tratamentos que podem amenizar os efeitos do glaucoma, mas
é necessário que o diagnóstico precoce e tratamento contínuo sejam aplicados
para minimizar a cegueira causada pelo glaucoma (Quigley et al., 2006) .
24
2.4 Fatores genéticos do GPAA
A Organização do Genoma Humano propõe uma classificação para a

identificação de loci candidatos que poderiam estar envolvidos com o
desenvolvimento do glaucoma por meio de nomenclatura específica onde a sigla
“GLC” diz respeito aos genes associados ao glaucoma. Os números “1”, “2” e “3”
indicam, respectivamente, ângulo aberto, ângulo fechado e glaucoma congênito. E
por fim, as letras “A”, “B” ou “C”, se referem, respectivamente, ao primeiro, segundo
ou terceiro gene mapeado em cada subgrupo (Raymond, 1997).
Até o momento foram identificados 6 genes que estão envolvidos com o
desenvolvimento do GPAA, são eles: myocilin (MYOC/GLC1A; MIM 601652),
optineurin (OPTN/GLC1E; MIM 137760), WD repeat domain 36
( WDR36/GLC1G; M I M 609669), n e u r o t r o p h i n -4 ( NTF4/GLC1O; M I M 162662),
TANK-binding kinase 1 (TBK1/GLC1P; MIM 604834) e ankyrin repeat and SOCS box
containing 10 (ASB10/GLC1F; MIM 603383) (Crawford et al., 2014).
O gene OPTN está presente no cromossomo 10p14 e alterações na sua
sequência foram identificados em 16,7% das famílias com GPAA. A proteína
codificada por esse gene, denominada optineurina está envolvida em várias funções
celulares, como a regulação de NF-kB, autofagia e transporte de vesículas (Minegishi
et al., 2016). A optineurina é expressa na malha trabecular, no epitélio ciliar não
pigmentado, na retina e no cérebro, e especula-se que desempenhe um papel
neuroprotetor (Souzeau et al., 2013).
Variações no gene WDR36, localizado na região 5q22.1, foram identificadas
pela primeira vez em associação ao glaucoma por Monemi e cols (2005). Este gene
codifica uma proteína da família de repetição WD. Os componentes dessa família
estão envolvidos em vários processos celulares, como o avanço do ciclo celular,
transdução de sinal, apoptose e regulação de genes. A expressão de WDR36 também
foi detectada em diversos tecidos oculares incluindo lente, íris, corpo ciliar, malha
trabecular, retina e nervo óptico. (Kumar et al., 2016). Foram observadas 24
alterações nesse gene relacionadas ao glaucoma apresentando um fenótipo grave da
doença (Sakurada et al., 2015).
O gene NTF4 está localizado no cromossomo 19q13.33 e codifica a proteína
neurotrofina 4 (NTF-4). Foram reportadas 7 mutações heterozigóticas diferentes que
representam cerca de 1,7% dos pacientes com GPAA de origem europeia. Estudos
25
tem relatado um papel protetor das neurotrofinas nas células ganglionares da retina
(RGCs) (Shimizu et al., 2000; Craig et al., 2001), especialmente, em casos de aumento
da PIO em testes com camundongos. Desta forma, mutações nesse gene
prejudicariam a sinalização das neurotrofinas em pacientes com GPAA (Nguyen et al.,
1998).
O gene TBK1 está localizado no cromossomo 12q14.1 e sua expressão foi
detectada em RGCs, na camada de fibras nervosas e microvasculatura da retina
humana. O gene TBK1 codifica uma serina/treonina quinase que regula a expressão
de genes nas vias de NF-kB. Esta via de sinalização regula processos importantes
que têm sido implicados na patogênese de glaucoma, como apoptose e modulação
do sistema imune (Skuta et al., 1996).
Mais recentemente, o gene ankyrin repeat and SOCS box containing 10
(ASB10/GLC1F) foi descoberto também como um possível gene causador de
glaucoma. No estudo de Pasutto e cols (2012) foram identificadas 26 trocas de
aminoácidos em 70 pacientes dos Estados Unidos da América e da Alemanha. Essas
variantes missense alteram a estrutura do gene ASB10 prejudicando a formação do
mRNA e da proteína que estão presentes na malha trabecular, nas células
ganglionares da retina e no corpo ciliar (Stone et al., 1997).
3. O gene MYOC e a miocilina
3.1 Identificação do gene
O locus GLC1A foi associado ao GPAA por Sheffield et. al. (1993) e por outros
autores de forma independente (Richards et al., 1994; Wiggs et al., 1994; Morissete
et al., 1995; Johnson et al., 1996; Belmouden et al., 1997), por meio de análises de
ligação em famílias afetadas pela doença. A análise de ligação pode ser usada para
identificar genes causadores de doenças sem um conhecimento prévio de seu
mecanismo patogênico (Sheffield et al., 1993).
O gene localizado nesse locus, denominado MYOC (conhecido também por TIGR
- trabecular meshwork-induced glucocorticoid receptor), foi o primeiro gene associado
ao glaucoma, por meio de análise de ligação genética no cromossomo 1q23-q24.
(Stone et al., 1997). Nesse estudo foram observados 3,9% dos pacientes
glaucomatosos com mutações relevantes para a progressão da doença que são
26
herdadas de forma autossômica dominante (Tamm, 2002). Desde então muitos

estudos têm feito estas associações e mostrado que as frequências de mutações
nesse gene variam de 1,4 a 4,6% em indivíduos com GPAA-adulto em diferentes
populações (Kumar et al., 2016). Nos pacientes com GPAA-J, as mutações nesse
gene estão envolvidas em cerca de um terço dos casos da doença (Khan, 2011).
3.2 Estrutura do gene
O gene MYOC é composto por 3 éxons com 606, 126 e 718 pb (Kubota et
al., 1997). À montante das regiões codificadoras do gene localiza-se o promotor, que
contém sequências de DNA q u e re g u l a m a e x pr e ss ã o d a mi oc il i n a e m
n í v e l d e transcrição (Fingert et al., 2002). O g e n e M YO C compreende dois
domínios de homologia, um domínio de miosina do tipo N-terminal (éxon 1) que
contém fechos de leucinas, um motivo estrutural tridimensional comum em uma
variedade grande de proteínas, importantes para as suas interações intracelulares,
extracelulares e de superfície celular (Rao et al., 2011) e possuem habilidade para
formar complexos homo e heteroméricos, sendo muito importantes na regulação da
função da proteína miocilina. O segundo domínio é semelhante a olfactomedina C-
terminal (éxon 3), onde a maioria das variantes causadoras do glaucoma foram
detectadas. Entre espécies, o domínio olfactomedina da miocilina é altamente
conservado, com mais de 80% de identidade de sequência de aminoácidos em
muitos mamíferos, e com identidade maior que 60% na sequência em diversas
espécies, tais como zebrafish (Danio rerio) e baiacu (Diodon hystrix), sugerindo que
esta região seja importante para a função estrutural da proteína (Goldwich et al.,
2003; Resch et al., 2009; Rao et al., 2011).
O domínio olfactomedina está presente em proteínas que desempenham
papéis fundamentais em processos celulares e têm sido implicadas em doenças que
vão desde o glaucoma, câncer e doença inflamatória do intestino, a desordem do
déficit de atenção e obesidade infantil. A importância do domínio olfactomedina é
realçada pela presença de mais de 90% das mutações identificadas associadas ao
glaucoma (Figura 4).
27
Figura 4 – Características estruturais do domínio Olfactomedina. A. Representação da vista

superior e lateral da hélice do MYOC-OLF. B. Sítio de ligação do cálcio interno e pontes
dissulfeto na face inferior para a manutenção da estrutura de algumas proteínas. C. Região
de fecho molecular. D. Algumas regiões onde ocorrem mutações que estão envolvidas com
o desenvolvimento do glaucoma, como T377, K423, P370, D378 (modificado de Donegan et
al., 2015).
3.3 Variantes e expressão do gene
Um estudo de Fingert et. al. (1999) analisou mutações no gene MYOC em

1703 pacientes representantes de 3 grupos étnicos: caucasianos, americanos
descendentes de africanos e asiáticos e encontraram 61 variantes no gene, sendo
que 21 foram associadas a causa da doença; destas, 16 (76%) foram observadas
apenas em uma população. A mutação Gln368Stop foi a mais comum e constatada
em 27 pacientes (1,6%), exceto nos asiáticos (Fingert et al., 1999). Esta mutação,
além de ser a mais comum no gene MYOC e estar associada com o início mais tardio
da doença (Allingham, 2009), tem sido detectada em quase todas as populações com
GPAA estudadas, incluindo afro-americanos e caucasianos dos Estados Unidos da
América, Canadá, Austrália, Europa e América do Sul (Kumar et al., 2016).
28
Até o momento foram reportadas 277 variantes nesse gene

(http://www.myocilin.com/, última atualização dia 11 de janeiro de 2017), e destas,
cerca de 30% são associadas com a causa da doença. Das mutações causadoras da
doença, cerca de 84% são do tipo missense (codificação de um aminoácido
diferente), enquanto que aproximadamente 6% são mutações nonsense (codificação
de um códon de terminação).
A variabilidade fenotípica é geralmente observada associada as variantes do
gene MYOC que exibem fenótipos diferentes de acordo com o genótipo associado.
Algumas variantes estão associadas a um fenótipo mais grave, incluindo PIO mais
elevada e/ou idade mais precoce do diagnóstico (Pasutto et al., 2012). Como
exemplo, o diagnóstico da mutação mais comum, a Gln368Stop, ocorre entre os 30
e 80 anos de idade, com proporção variada de pacientes com necessidade de
cirurgia para controlar a PIO (Craig et al., 2001) em comparação com outra mutação,
a Pro370Leu, cujo diagnóstico é mais comum em pacientes entre 5 e 30 anos de
idade com a maioria dos indivíduos necessitando de cirurgia (Shimizu et al., 2000).
Para comprovar, Hewitt e cols (2008) calcularam a relação mutação-fenótipo das
principais mutações do gene MYOC relacionadas ao glaucoma, por meio de banco
de dados de estudos com famílias (Tabela 1).
29
Tabela 1: Relação mutação-fenótipo de variantes do gene MYOC. Em destaque, a mutação

Cys433Arg, foco deste estudo, que exibe um fenótipo intermediário entre uma mutação com
efeitos mais brandos (por exemplo a Gln368Stop) e uma mutação com efeitos mais severos
(por exemplo a Pro370Leu) (modificado de Hewitt et al., 2008).
PIO Proporção de
Idade média de
Variantes da miocilina Desvio máxima Desvio submetidos a
n diagnóstico
causadoras da doença Padrão registrada Padrão intervenção
(anos)
(mmHg) cirúrgica (%)
Gln368Stop 138 54,4 10,7 29,8 4,4 34,4
Thr377Met 61 39,9 13,1 32,2 10,1 53,1
Cys433Arg 8 38,6 15,1 33,9 10,5 64,7
Gly367Arg 21 34,3 8,1 41,1 10,3 69,2
Asn480Lys 78 33,2 4,9 39,0 10,6 65,4
Lys423Glu 156 28,8 15,4 31,6 5,7 66,7
Gly367_Gln368delinsVal 20 28,2 12,6 38,1 10,0 80,0
Val426Phe 29 25,0 13,9 41,2 8,1 50,0
Ile477Asn 73 20,8 5,8 41,3 12,1 91,3
Pro370Leu 67 13,0 6,1 42,2 8,5 74,1
Nos humanos, o RNAm do gene MYOC é expresso em diversos tecidos, dentre

eles tecidos oculares e não oculares, sendo que a malha trabecular exibe o maior
nível de expressão, seguido pela esclera, corpo ciliar, coroide, córnea, íris, retina e
nervo óptico. Os tecidos não oculares incluem glândula mamária, intestino delgado,
timo, próstata, testículo, cólon, estômago, tireoide, traqueia, medula óssea e cérebro
(Rao et. al., 2011).
A expressão do gene MYOC pode ser induzida por glicocorticoides,
especialmente a dexametasona, como observado por Nguyen e cols (1998), que são
comumente utilizados para o tratamento de diversas doenças inflamatórias (Overby
et al., 2015). Já está elucidado que o uso de corticoides pode aumentar a PIO e
futuramente, levar ao desenvolvimento do glaucoma (Skuta et al., 1996). Sabe-se
também que a dexametasona administrada em culturas de células da malha
trabecular induz a regulação positiva de várias proteínas, dentre elas a miocilina (Joe
et al., 2011). A expressão elevada do MYOC nas células da malha trabecular resulta
na acumulação intracelular de agregados do gene, que são deletérios para as células
30
da malha trabecular, resultando na deterioração da sua função e consequentemente

elevação da PIO (Yam et al., 2007).
3.4 Miocilina
O polipeptídio codificado pelo gene MYOC, a mioclina, é formado por 504

aminoácidos e expresso com 55 kDa em uma variedade de tecidos oculares, incluindo
malha trabecular, córnea, retina, nervo óptico e nervos ciliares (Kumar et al., 2016),
encontrando-se tanto no meio intra como extracelular dependendo do tecido a ser
considerado. A proteína foi a primeira vez isolada quando houve sua produção a partir
de culturas de células da malha trabecular expostas a glicocorticoides por três
semanas (Polansky et al., 1988).
O MYOC está co-localizado com proteínas da matriz extracelular, indicando
que desenvolva um papel no meio extracelular (Gobeil et al., 2004) através da
organização do citoesqueleto e do remodelamento da matriz extracelular (Fautsch
et al., 2006). No meio intracelular a miocilina pode influenciar a função das
mitocôndrias. A superexpressão da proteína em células da malha trabecular reduz a
respiração mitocondrial levando a eventos apoptóticos das células da malha
trabecular, que causam a alteração da sua função e consequentemente elevação da
PIO (Alvarado et al., 1984; Sakai et al., 2007).
4. Mutação Cys433Arg
Primeira vez descrita por Vasconcellos e cols (2000), a mutação Cys433Arg

resulta na substituição de uma timina por uma citosina no nucleotídeo 1361 levando
a troca do aminoácido cisteína por arginina no códon 433, localizada no domínio
olfactomedina do éxon 3 do gene MYOC. Nesse estudo, 25 pacientes não
aparentados provenientes do Serviço de Glaucoma da Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP) foram submetidos a exames oculares para detecção de
glaucoma do tipo juvenil. A média de idade desses pacientes foi de 25,52 anos,
variando entre 10 e 35 anos e a média da pressão intraocular registrada foi de
29,96mmHg. Desses pacientes, sete (28%) apresentaram a mutação pontual,
ausente em 130 indivíduos controle sem a doença. Os pacientes apresentavam a
31
média de idade de 27 anos, variando entre 15 e 35 anos e o valor médio da pressão

intraocular foi de 39,13mmHg. Além disso, seis (85%) desses indivíduos com a
mutação contavam com um histórico familiar positivo para a doença. Posteriormente,
durante o seguimento destes pacientes observou-se a presença de glaucoma nos pais
destes dois probandos (Vasconcellos, comunicação pessoal).
Com a análise de quatro marcadores microssatélites nos indivíduos portadores
da mutação Cys433Arg observou-se que a mesma está associada com um haplótipo
comum, sugerindo que a mutação foi herdada de um mesmo ancestral (Vasconcellos
et. a., 2000).
Em um estudo também realizado por Vasconcellos e cols (2003), 48 membros
de uma família proveniente da região Sudeste do Brasil com quatro gerações foram
analisados, e observou-se que 17 (35%) apresentaram a mutação e desses, 9 (53%)
eram glaucomatosos, sendo que destes, cinco tiveram que ser submetidos a cirurgia
para controle da pressão intraocular, enquanto que nenhum dos pacientes que não
apresentavam a mutação exibiam a doença. A mutação não foi observada em
nenhum indivíduo menor de 10 anos (0/4), para a idade entre 11 e 30 anos a
penetrância foi de 40% (2/5) e entre 31 e 40 anos a penetrância foi de 75% (3/4). A
penetrância foi de 100% (4/4) em pacientes maiores de 40 anos, associando-se a um
fenótipo glaucomatoso grave, no qual os pacientes tiveram que ser submetidos a pelo
menos um procedimento cirúrgico para aumentar o controle da PIO.
Povoa e cols. (2005) estudaram mutações no éxon 3 do gene MYOC que estão
relacionadas ao desenvolvimento do glaucoma, e observaram que a mutação
Cys433Arg foi a mais prevalente nos pacientes estudados provenientes do estado de
São Paulo. Esse estudo mostrou que a mutação foi identificada em três de 96 (3,1%)
pacientes inicialmente analisados. Em duas famílias com 56 indivíduos para estudo,
oito portavam a mutação Cys433Arg e tinham GPAA, cinco pacientes que portavam
a mutação eram hipertensos oculares e oito apresentaram a mutação, mas não
haviam manifestado a doença, com média de idade entre 17 e 58 anos. A mutação foi
encontrada em cinco pacientes com idade entre 0 e 10 anos, em quatro entre 10 e 30
anos, em quatro entre 30 e 40 anos e em oito pacientes acima dos 40 anos, com
penetrâncias de 20%, 50%, 75% e 87,5%, respectivamente, nos grupos.
Para explicar o aumento da PIO em pacientes portadores da mutação há
possivelmente duas hipóteses. A primeira é de que a alteração do resíduo de cisteína
possa afetar a oligomerização do produto do gene MYOC, interferindo, em nível
32
extracelular, com a sua interação com a superfície da célula e/ou da matriz

extracelular e, potencialmente, contribuindo para a elevação da PIO. A segunda
hipótese é que, em nível intracelular, a sua localização no domínio olfactomedina
possa comprometer o processo de secreção da proteína miocilina (Yokoe et. al., 1993;
Nguyen et. al., 1998). O grupo de pesquisa do Laboratório de E s t u d o s e m
Genética Humana do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG)
da Unicamp realizou um estudo do tipo caso/controle que consistiu em 98 pacientes
portadores de GPAA-J e 92 indivíduos sem glaucoma. Na análise observou-se que
27 pacientes (27,55%) são portadores da mutação Cys433Arg e nenhum indivíduo do
grupo controle foi observado como portador dessa mutação (Vasconcellos, 2014).
Visto que, se somados os estudos já realizados na população do estado de São Paulo,
a frequência desta mutação é de aproximadamente 30% nos casos de glaucoma
do tipo juvenil, m ais estudos sobre essa variante são importantes para a melhor
compreensão da relação entre a mesma e o desenvolvimento do glaucoma,
considerando que esta mutação foi observada apenas na população brasileira até o
momento.
5. Marcadores Moleculares
Marcadores moleculares são definidos como características de DNA que

diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdadas geneticamente (Milach, 1998). Os
marcadores moleculares são amplamente utilizados em melhoramento genético,
estudos sobre clonagem e função de genes, filogenia e diversidade e estrutura
genética e populacional (Guimarães et al., 2009).
Na década de 1980, a descoberta de novas técnicas moleculares possibilitou
analisar variações no próprio DNA oferecendo um grande número de marcadores a
serem utilizados nos estudos. Os primeiros marcadores identificados foram os
polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs), definidos como
variações na sequência de DNA detectadas por meio de corte com enzimas de
restrição. Em seguida, desenvolveram-se técnicas para identificar sequências de DNA
repetidas em série, os microssatélites e minissatélites. Os minissatélites são
sequências de 6 a 100 nucleotídeos repetidos em tandem e distribuídos no genoma
(Jeffreys et al., 1985), apresentam altos níveis polimórficos e um número variável de
repetições em diferentes indivíduos em um mesmo locus, que garante a possibilidade
33
de discriminação de espécies dentro de grupos heterogêneos (Goldstein et al., 1999;

Rieger et. al., 2006). Atualmente, pode-se identificar a variação individual nos
nucleotídeos do DNA, como os polimorfismos de base única (SNPs) (Pierce, 2004).
5.1 Polimorfismos de base única (SNP)
Os SNPs são alterações em apenas um par de base no genoma humano com

ocorrência de forma natural (Brookes, 1999; Harvey et al., 2008) e são responsáveis
por variações individuais. Estas variações são as mais comuns e representam cerca
de 90% das diferenças das sequências, com frequência total de aproximadamente 1
SNP a cada 1000 bases (Wang et al., 2001; Harvey et al., 2008). De acordo com o
dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), cerca de 3 milhões de SNPs foram
identificados no genoma humano contribuindo assim, para a identificação de genes
relacionados a doenças e para estudos de associação de genes candidatos (Harvey
et al., 2008).
Os primeiros estudos sistemáticos sobre os SNPs em humanos mostraram que
cada gene contém uma média de cerca de 4 cSNPs (SNPs em regiões codificadoras)
com uma frequência superior a 1% na população (Cargill et al., 1999; Halushka et al.,
1999).
Estudos do tipo GWAS (associação em larga escala no genoma) tem sido
importantes para o melhor entendimento do glaucoma por detectarem SNPs no
genoma que estão associados a características de interesse (Hayes et al., 2009; Chen
et al., 2015), identificando muitos genes envolvidos nas diferentes formas do GPAA.
Por exemplo, um estudo que reuniu dados de meta-análise de seis outros estudos
encontrou evidências significativas de que variantes comuns dos genes CDKN2B,
ATOH7 e SIX1 estão associadas com o glaucoma primário de ângulo aberto (Ramdas
et al., 2011). Um estudo da população islandesa identificou associações significativas
entre o GPAA e SNPs próximos aos genes caveolina 1 (CAV1) e caveolina 2 (CAV2),
que mostraram que a deficiência nesses genes resulta no aumento da pressão
intraocular (Elliott et al., 2016).
34
5.2 Microssatélites
Microssatélites são repetições curtas de DNA de 1 a 6 bases repetidas em

sequência, sendo a maior parte de um, dois, três ou quatro nucleotídeos e distribuídas
ao longo do genoma tanto em regiões codificadoras como em regiões não
codificadoras (Rieger et. al., 2006; Gelsomino et al., 2016). Esses segmentos são
flanqueados por sequências únicas altamente conservadas entre espécies (Pardue et
al., 1987; Stallings et al., 1991), principalmente nos mamíferos.
Os microssatélites têm papel importante em estudos de ligação por diversos
motivos, dentre eles a grande diversidade de alelos que conduz a uma taxa de
heterozigosidade de 50% a 80%, enquanto que a média de heterozigose de SNPs é
de 30% aproximadamente. Este elevado grau de heterozigosidade leva a um
conteúdo de informação muito mais elevado quando comparado com os SNPs, são
facilmente amplificados por PCR e há um mapa genético de alta resolução criado a
partir de microssatélites (Kong et. al., 2002; Gulcher, 2012). A análise de ligação
utilizando microssatélites foi importante para o glaucoma pois o gene MYOC foi pela
primeira vez associado a doença a partir de estudos deste tipo (Stone et. al., 1997).
Os microssatélites são considerados hot spots para recombinação, sendo que
estes eventos ocorrem preferencialmente em regiões de repetições de dinucleotídeos
por conta da afinidade de enzimas de recombinação nestes locais (Jeffreys et. al.,
1998). Os motivos dinucleotídeos estão em sua maioria localizados em regiões não
codificantes do genoma (Chistiakov et. al., 2006).
Em comparação aos SNPs, os microssatélites constituem a classe de
marcadores mais polimórficos, enquanto que os SNPs são as mais frequentes formas
de variações genéticas. Enquanto os SNPs têm apenas dois alelos independentes por
locus, os microssatélites podem ter muito mais. Grande parte dos marcadores
moleculares são seletivamente neutros, ocorrendo geralmente em regiões não
codificadoras de DNA e expressos de modo co-dominante (Weinman et. al., 2015;
Grover et al., 2016).
Por meio da utilização dos microssatélites, assim como dos SNPs é possível
estimar a idade de uma mutação de interesse. Isso é possível, pois, sempre que uma
nova mutação aparece, a associação dos blocos de alelos (haplótipos) passa a ser
não aleatória, ou seja, gera um desequilíbrio de ligação (Goldstein et al., 1999). Os
descendentes diretos de um cromossomo mutado serão monomórficos (presença
35
significativa de apenas uma forma alélica com mais de 99% de frequência) para os
marcadores ligados ao locus de interesse de estudo. Ao longo do tempo, o
desequilíbrio de ligação é reduzido por recombinação, até atingir o equilíbrio
(combinação aleatória dos alelos), em que progressivamente o padrão de variação
entre os cromossomos irá demonstrar o padrão de variação na população geral. Por
meio de inferência estatística pode-se determinar a distância em gerações do
antepassado comum mais provável com base no desequilíbrio de ligação observado
em diversos marcadores genéticos próximos a mutação (Goldstein et al., 1999; Reeve
et al., 2002; Paskulin et al., 2015).
36
Justificativa
37
O glaucoma é a maior causa de cegueira irreversível que afeta milhões de

pessoas no mundo todo e esse número vem crescendo com o passar dos anos. Por
esta razão mais estudos são necessários para que seja possível entender melhor os
fatores que interferem e causam a doença com o objetivo de prevenção e até de
desenvolvimento de medicamentos ou procedimentos de tratamento para indivíduos
já afetados. Entre os vários tipos de glaucoma, o GPAA-J apresenta uma forma grave
da doença com alto número de pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos para
controle da doença.
O gene MYOC é considerado como o de maior importância no desenvolvimento
do glaucoma, principalmente o juvenil, com mutações associadas a progressão da
doença. É notável que a mutação Cys433Arg esteja presente em aproximadamente
30% dos casos de GPAA do tipo juvenil e com alta penetrância nas famílias brasileiras
analisadas. Nos estudos concluídos sobre essa mutação, todos os pacientes são
brasileiros, sendo que a grande maioria é proveniente do estado de São Paulo. A
estimativa da idade da mutação Cys433Arg em número de gerações poderia ajudar
na compreensão do histórico demográfico desta mutação na nossa população e na
projeção da prevalência e distribuição da mesma na população brasileira.
38
Objetivos
39
1. Geral
Estimar a idade da mutação Cys433Arg do gene MYOC em uma amostra de

pacientes com glaucoma e contribuir para a compreensão do histórico demográfico
desta mutação na população brasileira
2. Específicos
- Escolher os melhores marcadores para a determinação da idade da

mutação.
- Determinar os haplótipos que são essenciais para a identificação da
idade da mutação.
- Estimar o tempo, em gerações, a partir do ancestral comum mais recente
da mutação.
40
Casuística e Métodos
41
1. Pacientes
Este estudo foi composto por pacientes afetados pelo glaucoma primário de
ângulo aberto do tipo juvenil nos quais a mutação Cys433Arg no gene MYOC já foi
identificada.
Os critérios de inclusão dos pacientes não aparentados e das famílias
portadores de GPAA foram:
- Ângulo aberto no exame de gonioscopia com pigmentação da malha
trabecular até grau 2;
- Lesão característica de disco óptico, definida como a presença de pelo menos
dois dos seguintes critérios: razão escavação/disco >0,6, perda localizada da rima
neural, hemorragia de disco óptico ou assimetria da razão escavação/disco >0,2 entre
os dois olhos;
- Presença de pelo menos dois exames de campo visual confiáveis revelando
perda glaucomatosa característica, definida como o agrupamento de três ou mais
pontos não periféricos no gráfico do Pattern Deviation, todos deprimidos a p < 5%,
com pelo menos um ponto a p < 1% ou pior, Glaucoma Hemifield Test Outside Normal
Limits e corrected pattern standard deviation (CPSD) ocorrendo em menos de 5% dos
exames perimétricos normais.
Os critérios de exclusão destes pacientes foram: 
- Pacientes que apresentaram alterações de segmento anterior compatíveis
com glaucomas secundários (ou de desenvolvimento) e/ou alterações de disco óptico
e campo visual que mimetizassem lesões glaucomatosas; 
- Pacientes com glaucoma primário de ângulo fechado; 
- Pacientes com GPAA onde não foi possível avaliação oftalmológica e genética
também foram excluídos do estudo.
O grupo controle foi composto por 200 indivíduos atendidos no Ambulatório de
Oftalmologia do Hospital das Clínicas, Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP) que não apresentassem nenhuma forma de glaucoma. Pertenceram a
este grupo, indivíduos com idade superior a 60 anos, ausência de antecedente familiar
de glaucoma ou cegueira ocular de causa desconhecida, PIOs menores do que 15
mmHg e escavações do disco óptico menores do que 0,4.
42
Os exames oftalmológicos aos quais todos os pacientes foram submetidos

foram:
- Medida da acuidade visual com correção, utilizando a tabela de optotipos de
Snellen, localizada a seis metros de distância do paciente;
- Medida do erro refracional em dioptrias com refrator Topcon VT-10 (Tóquio,
Japão), seguido do cálculo do equivalente esférico (EE). Este valor foi obtido a partir
da fórmula: EE = DE + DC/2, sendo DE correspondente ao grau em dioptrias esféricas
e DC correspondente ao grau em dioptrias cilíndricas;
- Biomicroscopia do segmento anterior realizada em lâmpada de fenda Haag-
Streit, modelo 900  (Haag Streit, Berna, Suíça);
- Tonometria de aplanação com tonômetro calibrado de Goldmann (modelo R-
500) – Haag  Streit, Berna Suíça). Medida da espessura central da córnea por meio
de paquímetro ultrassônico;
- Gonioscopia com lente de Posner (Ocular Intruments Inc., Belleuue, E.U.A.);
- Biomicroscopia de fundo de olho: retina, com a lente 2.2 (Volk Optical Inc.,
Mentor, E.U.A.) e disco óptico com a lente asférica Volk + 78 dioptrias ( Volk Optical
Inc., Mentor, E.U.A) após midríase obtida com a instilação de 1 gota de tropicamida
1%;
- Retinografia (Topcon TRC 50X) digital realizada após midríase: aspectos do
disco óptico e da razão escavação/disco (escavação) incluindo área do disco óptico,
área da escavação, área da rima neural e razão escavação/ disco vertical foram
avaliadas por meio de dois examinadores independentes.  Perimetria
computadorizada branco no branco relizada no perímetro Humphrey Field Analyzer
II, modelo 750, software versão A-10 (Zeiss Humphrey Systems, Califórnia, E.U.A)
estratégia 24.2 SITA Standard. Os indivíduos receberam orientações prévias de como
proceder durante a realização do exame.
Os pacientes foram atendidos no Serviço de Glaucoma do Ambulatório de
Oftalmologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP e tiveram amostras de sangue
periférico coletadas em quantidades de 6 a 18mL em frascos estéreis VACUETTE®
contendo 10,8 mg do anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para que
fosse realizada a extração do DNA pelo método fenol/clorofórmio. Os indivíduos
coletados foram informados sobre os objetivos e métodos da pesquisa, podendo ou
não aceitar participar da mesma, sem constrangimento ou modificação de sua
43
assistência médica. Os mesmos DNAs já foram utilizados em tese de mestrado sob o

Parecer CEP: Nº 1224/2009, CAAE: 0945.0.146.000-09. Este estudo está contido no
projeto de pesquisa Aspectos Genéticos de Doenças Oftalmológicas aceito no Comitê
de Ética em Pesquisa (CAAE: 49120615.4.0000.5404).
Em seguida, foram realizadas reações de PCR com iniciadores específicos que
possibilitam a amplificação dos 3 éxons do gene. Os produtos das PCRs foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% para verificar se os fragmentos de
DNA desejados foram amplificados. Em seguida as amostras foram submetidas ao
sequenciamento de Sanger em sequenciador automático ABI PRISM 3500 DNA
Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e os resultados analisados pelo
programa FinchTV (Geospiza - http://www.geospiza.com/ftvdlinfo.html), com o
objetivo de verificar se os pacientes possuíam alterações na sequência codificadora
do gene MYOC.
Os materiais biológicos dos pacientes estão armazenados em biorrepositório
no Laboratório de Estudos em Genética Humana no Centro de Biologia Molecular e
Engenharia Genética (CBMEG) – UNICAMP.
Para este estudo foram selecionados 35 indivíduos de três famílias, 16
indivíduos não aparentados e mais 32 indivíduos controles.
1.1 Critérios de inclusão
Foram incluídos os indivíduos com as seguintes características: a) ângulo

aberto ao exame de gonioscopia; b) alteração glaucomatosa do disco óptico; c) lesão
glaucomatosa do disco óptico acompanhada por perda de campo visual
correspondente; d) idade de diagnóstico inferior a 40 anos; e) portadores da mutação
Cys433Arg no gene MYOC.
1.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos do estudo, pacientes que apresentaram alterações de

segmento anterior compatíveis com GPAA-J mas que não fossem portadores da
mutação Cys433Arg no gene MYOC.
44
1.3 Grupo controle
O grupo controle foi constituído por indivíduos sem parentesco entre si para
compor um grupo representante da população sem a doença. Esses indivíduos além
de não serem afetados por nenhuma forma de glaucoma, também não apresentavam
antecedentes familiares com a doença ou cegueira de causa desconhecida,
apresentavam PIOs e escavações dos discos ópticos normais e idade superior a 50
anos.
2. Heredogramas
Os heredogramas das três famílias analisadas neste estudo estão

apresentados nas figuras 5, 6 e 7 abaixo. Foram numerados apenas os indivíduos que
fizeram parte deste estudo (circulados) enquanto que os indivíduos que não foram
analisados não tiveram seus números correspondentes nos heredogramas
apresentados.
Figura 5 – Heredograma da família 1 com 6 indivíduos analisados. Os indivíduos preenchidos

representam aqueles afetados por GPAA, enquanto que os circulados representam aqueles
selecionados para o estudo.
45

representam aqueles selecionados para o estudo.
Figura 7 – Heredograma da família 3 com 9 indivíduos analisados. Os indivíduos preenchidos

representam aqueles afetados por GPAA, enquanto que os circulados representam aqueles
selecionados para o estudo.
3. Iniciadores e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Para estimar a idade da mutação foram selecionados todos os marcadores

moleculares (entre microssatélites e SNPs) que compreendem uma região de 5Mb em
torno da mutação de interesse num total de 12 marcadores, sendo que 9
correspondem a regiões de microssatélites e 3 SNPs. As localizações dos marcadores
e da mutação no cromossomo podem ser observadas na figura 8, a qual mostra o
cromossomo e a posição relativa dos marcadores selecionados. As regiões
correspondentes aos marcadores foram amplificadas por PCR, com iniciadores
46
desenhados no software Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) (Tabela

2 e 3).
Figura 8 – Localização dos marcadores moleculares e da mutação no cromossomo 1 região

q23-q24, compreendendo uma região de 5Mb.
Os fragmentos que compreendem os marcadores microssatélites foram

marcados com fluoróforos HEX (exibe padrão visível na cor verde) ou FAM (exibe
padrão visível na cor azul) na extremidade 5’ do iniciador direto. Esta marcação com
fluoróforos atrelada a diferentes tamanhos de amplificação dos fragmentos possibilitou
a montagem de reações multiplex formando três conjuntos com três marcadores em
cada (Tabela 2).
As amplificações das amostras foram realizadas em aparelhos termocicladores

(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). As condições de amplificações estão
especificadas a seguir para cada marcador.
47
Tabela 2: Conjuntos de iniciadores utilizados para amplificação dos microssatélites e

respectivas temperaturas de anelamento e tamanho do fragmento amplificado.
Tabela com os marcadores microssatélites

Conjuntos
Temperatura de Tamanho do
(reação Nome Fluoróforos Iniciadores (direto e reverso 5’-3’)
anelamento (Tm) amplificado (pb)
multiplex)
TGCCTCAGTTCATTCCCCAT
rs3219828 FAM 57ºC 155 a 177
ACTCAATGTTCAAGTTCTCCCTG
GCCCAGCAAAGAGACCTTCA
1 rs3221612 HEX 57ºC 179 a 250
CTTCGAACACGTCTTCCCAC
rs3219958 TGTAAAAGCAAACTGTAGACGAT
FAM 57ºC 266 a 286
(D1S218) TTTATGTTATCACCAAGGCTTCT
ACATCCCAATTTATGCACCCA
rs2234708 FAM 59ºC 190 a 207
CACAGTGCAGGTTCTCAATGA
CTGACATGGAATACCTCTATGATGC
2 D1S2815 HEX 59ºC 210 a 237
CTCCAAATCTAGTCACACTGGAAG
rs3223566 GTGCTAGCCACCTGCCTTAC
FAM 59ºC 243 a 253
(D1S2790) GCACAATGGCCAATGTTTTCA
AGGCAACAGAGTGAGACTC
D1S1165 FAM 58ºC 117 a 210
CTTCCATAGCTGATACTGCT
CAGGAGGTGGAAGTTGCAG
3 rs3220994 HEX 58ºC 196 a 224
AGTTGATGGGTAGGGGTGTG
CTCTCTACCACTTGAATTCCTGT
rs3220452 FAM 62ºC 215 a 249
GAGCCACCACTCCAGTTTGA
48
Tabela 3: Conjuntos de iniciadores utilizados para amplificação dos SNPs e respectivas

temperaturas de anelamento.
Temperatura de
Nome Iniciadores (direto e reverso 5’-3’)
anelamento (Tm)
ACTGCTGTCCATTGTCCTGA
rs6133 59ºC
ACAGGCATAGCATCACTTCCT
TGCTGTAATGGTTTGTTCCGG
rs2266782 59ºC
GCGACCTTGTGAATAGATGCA
TGGCATTGTTCCGTAAAGC
rs2266780 59ºC
TGGACAAAGCCAATCACTGC
Para a amplificação dos microssatélites foram utilizados de 50 a 80 ηg de DNA

genômico, 1,25 μL de tampão da enzima (Tampão 10X: Tris-HCl 200 mM pH 8,4; KCl
500 mM), 0,75 μL de MgCl2 50mM, 0,75 μL de didesoxinucleotídeo (dNTP) 10 mM, 1
μL de cada iniciador (direto e reverso, 5 pmoles), 0,3 μL da enzima Taq DNA
polimerase (5 U/μL) e H20 ultrapura em quantidade suficiente para completar 15 μL
de reação.
Para as amplificações dos microssatélites D1S1165 e rs3220994 do conjunto 3
foram adicionados a cada reação 0,75 μL de formamida (Applied Biosystems, Foster
City, CA, USA) e o volume de enzima Taq DNA polimerase 5 U/μL foi reduzido para
0,2 μL. Os programas das reações de PCR para os conjuntos de iniciadores dos
microssatélites estão descritos na Tabela 4.
49
Tabela 4: Programas das reações de PCR para a amplificação dos microssatélites.
Conjunto 3 (D1S1165
Conjunto 1 Conjunto 2 Conjunto 3 (rs3220452)
e rs3220994)
Desnaturação
1 ciclo 94ºC a 5 min 1 ciclo 94ºC a 5 min 1 ciclo 94ºC a 5 min 1 ciclo 94ºC a 5 min
inicial
Desnaturação 30 ciclos 94ºC a 1 min 45 ciclos 94ºC a 1 min 45 ciclos 94ºC a 1 min 45 ciclos 94ºC a 1 min
Anelamento
dos 57ºC a 1 min 59ºC a 1 min 58ºC a 45 s 62ºC a 45 s
inciadores
Extensão 72ºC a 1 min 72ºC a 1 min 72ºC a 15 s 72ºC a 25 s
Extensão final 1 ciclo 72ºC a 5 min 1 ciclo 72ºC a 5 min 1 ciclo 72ºC a 3 min 1 ciclo 72ºC a 5 min
15ºC ∞ 15ºC ∞ 15ºC ∞ 15ºC ∞
Para a amplificação dos SNPs foram utilizados de 50 a 80 ηg de DNA

genômico, 2,5 μL de tampão da enzima (Tampão 10X: Tris-HCl 200 mM pH 8,4; KCl
500 mM), 4 μL de MgCl2 50 mM, 0,5 μL de didesoxinucleotídeo (dNTP) 10 mM, 0,25
μL de cada iniciador (direto e reverso a 20 pmoles), 0,1 μL da enzima Taq DNA
polimerase (5 U/μL) e H20 ultrapura em quantidade suficiente para completar 25 μL
de reação. Os programas das reações de PCR para os conjuntos de iniciadores dos
SNPs estão descritos na Tabela 5.
50
Tabela 5: Programas das reações de PCR para a amplificação dos SNPs.
SNPs
Desnaturação inicial 1 ciclo de 95ºC a 5 min
Desnaturação 35 ciclos de 95ºC a 1 min
Anelamento dos inciadores 59ºC a 1 min
Extensão 72ºC a 1 min
Extensão final 1 ciclo de 72ºC a 7 min
4ºC ∞
Após a realização das reações de PCR, as amplificações foram confirmadas

por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5% por meio da apresentação de
bandas no gel correspondentes aos tamanhos dos amplificados determinados.
4. Sequenciamento de Sanger e eletroforese automatizada
As reações de sequenciamento para os SNPs foram realizadas com os

mesmos iniciadores utilizados nas PCRs, seguindo o método de Sanger e cols (1975)
e em seguida purificadas para a eliminação dos nucleotídeos não incorporados.
Para a realização das reações de sequenciamento foram utilizados de 40 a 80
ηg de produto da PCR purificado, 4 μL do tampão Save Money (6 mL Tris-HCl 1M
pH9,0, 150 μL MgCl2 1M, água ultrapura suficiente para 30 mL), 0,5 μL Big Dye
Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Austin, TX, USA), 1 μL de
iniciador direto ou reverso (5 pmol/μl) e H2O ultra-pura em quantidade suficiente para
completar 20 μL de reação. O programa das reações de sequenciamento para os
SNPs está descrito na Tabela 6.
51
Tabela 6: Programa das reações de sequenciamento dos SNPs.
Sequenciamento - SNPs
Desnaturação inicial 96ºC a 1 min e 30 s
Desnaturação 96ºC a 12 s
Anelamento dos inciadores 30 ciclos de 50ºC a 6 s
Extensão 60ºC a 4 min
4ºC ∞
Após a reação de sequenciamento as amostras foram precipitadas com 80 μL

de etanol 80% e centrifugadas a 4000 rpm por 45 minutos. O sobrenadante foi
descartado, e em seguida foram adicionados 150 μL de etanol 70%. Uma nova
centrifugação foi realizada com as amostras, desta vez por 10 minutos a 4000 rpm.
Por fim, o sobrenadante foi descartado e realizado um spin invertido seguido por
secagem das amostras em termociclador por 3 minutos a 64ºC. Os produtos das
reações de sequenciamento purificados foram ressuspendidos em 10 μL de
formamida (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). O sequenciamento foi
realizado em sequenciador automático ABI PRISM 3500 DNA Analyzers (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) e as sequências obtidas foram analisadas com o
auxílio do programa FinchTV (Geospiza - http://www.geospiza.com/ftvdlinfo.html).
As eletroforeses automatizadas foram realizadas para os marcadores
microssatélites em ABI PRISM 3500 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City,
CA, USA). Em cada reação multiplex foram adicionados 1 μL do produto da PCR, 8,7
μL de formamida e 0,3 μL do size standard LIZ 500 que possui 16 fragmentos que
variam de 35 a 500 pb. O software Geneious (Biomatters - http://www.geneious.com/)
foi utilizado para a análise das genotipagens que utiliza o size standard para criar
uma curva para cada amostra analisada, gerando uma análise individual e precisa.
52
5. Controle de qualidade da genotipagem
Na análise de microssatélites deve ser identificado o pico correspondente a

cada alelo, porém é comum que sejam gerados outros picos adjacentes denominados
“fantasmas”. Esses picos são gerados por diversos fatores, como a adição de uma
adenina no final dos fragmentos durante a PCR pela enzima polimerase e artefatos
gerados pela própria amplificação dos microssatélites (picos stutters). Além desse
fator, o próprio capilar do equipamento pode afetar a velocidade do movimento do
fragmento de DNA se não passar por constante manutenção; por isso é utilizado o
size standard como uma referência com tamanhos de picos conhecidos.
Para a correção desses efeitos gerados pela genotipagem foi empregado o
processo de binning utilizando o software Tandem
(http://evoinformatics.eu/tandem2.htm) e também por correção manual. A marcação
dos alelos produz tamanhos de alelos com duas casas decimais, porém os programas
de genotipagem arredondam esses números para valores inteiros podendo gerar
erros. O binning consiste em arredondar os tamanhos dos alelos para números
inteiros válidos, dependendo das unidades de repetição dos microssatélites. A
correção manual foi feita no próprio software de análise das genotipagens (Geneious)
e em seguida foi realizada a correção no software Tandem.
5.1 Genótipos improváveis
Para assegurar que as análises das genotipagens foram realizadas de forma

correta foi utilizado o software Merlin (http://csg.sph.umich.edu/abecasis/Merlin/).
Esse programa mostra possíveis erros nos dados, como erros mendelianos e
genótipos impróprios. Os genótipos impróprios são descobertos pois o programa
consegue verificar quando deve ter acontecido uma dupla recombinação para que
seja possível determinada combinação de alelos entre os marcadores muito próximos,
acusando então, os genótipos improváveis. Os genótipos acusados como improváveis
formam reanalisados e corrigidos.
53
6. Determinação dos Haplótipos
Os haplótipos dos indivíduos não aparentados foram inferidos a partir do

software Arlequin (http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin35/) utilizando o algoritmo
ELB, um método bayesiano para reconstruir a fase gamética (desconhecida) dos
genótipos.
Para a determinação dos haplótipos das famílias foi realizada a análise dos
heredogramas e determinados os haplótipos associados a mutação.
7. Estimativa da idade da mutação
A idade da mutação foi estimada por meio do software DMLE+

(http://dmle.org). O método se baseia no desequilíbrio de ligação entre a mutação
causadora da doença e os marcadores adjacentes. O desequilíbrio de ligação, ou
seja, a associação não aleatória de alelos, é gerado sempre que ocorre uma nova
mutação. Os descendentes diretos de um cromossomo mutante serão monomórficos
para um conjunto de marcadores ligados ao locus de interesse até o momento em
que uma nova mutação ou recombinação desfaçam esse padrão. Ao fazer uma
avaliação quantitativa da extensão em que o desequilíbrio de ligação foi desfeito, por
recombinação, e utilizando-se dados e parâmetros necessários, é possível estimar
um intervalo, em gerações, para o ancestral comum mais recente dessa mutação.
O programa implementa a simulação de Monte Carlo via cadeias de Markov
para fazer a estimativa Bayesiana da idade da mutação e se baseia nos seguintes
parâmetros: frequência dos haplótipos observados em indivíduos afetados e não
afetados, distâncias genéticas entre os marcadores e sua posição relativa à mutação,
taxa de crescimento populacional, proporção dos cromossomos mutantes na
população. Estes parâmetros foram especificados no arquivo de entrada. Os
haplótipos foram identificados conforme explicado acima (veja detalhamento em
anexo). As distâncias genéticas (centimorgans) foram extrapoladas a partir das
distâncias físicas (pares de bases) usando o conhecimento que em humanos a taxa
média de recombinação está em torno de 1cM per 1Mbp (BNID 107023:
http://bionumbers.hms.harvard.edu//bionumber.aspx?id=107023&ver=3). A taxa de
crescimento populacional usada para análise foi de 0,095 (www.ibge.gov.br;
54
acessado em: 01/12/1016) com base na média da taxa de crescimento brasileira de

300 anos. A proporção de cromossomos mutantes foi estimada como a relação entre
os cromossomos com a mutação na amostra analisada e o total de cromossomos
com a mutação na população brasileira (detalhamento do cálculo em anexo), o que
resultou em 0,0392.
O método de Monte Carlo via cadeias de Markov implementado pelo programa
se baseia em amostragens aleatórias massivas para a obtenção de resultados
numéricos, isto é, repetindo sucessivas simulações em grande número para calcular
as probabilidades de cada caso aleatório acontecer. Como são simulações
aleatórias, é comum que as primeiras sejam descartadas pois há pouca probabilidade
de serem verdadeiras, e conforme as iterações acontecem a probabilidade aumenta.
Essas iterações são denominadas burn-in e para esse estudo foram determinadas
dois milhões de simulações a partir da convergência dos resultados obtidos para as
duas análises independentes. Em seguida, determina-se o número de iterações reais,
que já passaram pelo burn-in e, portanto, existe um grau maior de confiabilidade, as
quais foram de 2 milhões também.
55
Resultados e Discussão
56
1. Análises
Após a conclusão dos sequenciamentos de Sanger e eletroforeses

automatizadas, os resultados foram analisados a fim de se determinar os genótipos
de cada indivíduo para cada marcador utilizado. As figuras 9 e 10 apresentam
exemplos de eletroferogramas de genotipagens e sequenciamentos de
microssatélites e SNPs, respectivamente.
A B C
Figura 9 - Eletroferogramas dos genótipos de uma amostra do conjunto 1 dos marcadores

microssatélites. A. Heterozigoto para rs3219828. B. Heterozigoto para rs3221612. C.
Homozigoto para rs3219958
A B C
Figura 10 - Eletroferograma dos sequenciamentos dos SNPs. A. Homozigoto para o SNP

rs6133 B. Homozigoto para o SNP rs2255782 e C. Heterozigoto para o SNP rs2255782.
Nas tabelas abaixo estão apresentados dados acerca dos marcadores

utilizados no estudo, para os microssatélites (Tabela 7) e para os SNPs (Tabela 8).
57
Tabela 7 – Caracterização dos marcadores microssatélites para os indivíduos não

aparentados (n=16). A: Número de alelos em cada locus. PIC: Polymorphism Information
Content ou Conteúdo de Informação Polimórfica. He: heterozigosidade esperada. Ho:
heterozigosidade observada.
Microssatélite Repetição A PIC He (%) Ho (%)
rs3219828 (CA) 6 0,6359 66,8 87,5
rs3219958 (TG) 6 0,5915 60,8 68,7
rs3221612 (TG) 9 0,7635 76,9 81,2
rs2234708 (AC) 19 0,9274 96,2 87,5
rs3223566 (TG) 12 0,8439 77,8 68,7
D1S2815 (CA) 14 0,8953 81,9 7,58
D1S1165 (GGAA) 7 0,7891 84.1 100
rs3220994 (CA) 11 0,8535 89,5 100
rs3220452 (TG) 5 0,7341 79,4 100
O número de alelos em cada locus apresenta o grau de polimorfismo de cada

marcador, evidenciando que alguns marcadores são mais polimórficos, como por
exemplo, o rs2234708 com 19 alelos encontrados, enquanto que outros marcadores
são menos polimórficos como o rs3220452 com 5 alelos encontrados na amostra
analisada. O número de alelos encontrados e suas frequências refletem no valor do
PIC (Polymorphism Information Content ou Conteúdo de Informação Polimórfica) que
varia de 0 a 1, sendo que quanto maior o valor, mais polimórfico é o marcador. Um
mesmo marcador pode ter valores de PIC diferentes dependendo da população
estudada, pois o número de alelos e a frequência podem ser diferentes em cada
58
população (Guo et al., 1999). Para este estudo, a maior parte dos marcadores
utilizados apresentou valores altos de PIC, revelando o alto grau polimórfico. Isto é
uma vantagem nas avaliações envolvendo análise de ligação para identificação de
genes assim como neste estudo para estimativa da idade da variante Cys433Arg.
Tabela 8 – Caracterização dos marcadores SNPs para os indivíduos não aparentados (n=16).
SNP AR He (%) Ho (%)
rs6133 - 0 0
rs2266782 A 37,0 37,5
rs2266780 G 22,4 25,0
AR: alelo mais raro. He: heterozigosidade esperada. Ho: heterozigosidade observada.
Na amostra avaliada o SNP rs6133 apresentou-se monomórfico manifestando

apenas o alelo C. Segundo o banco de dados Ensembl (http://www.ensembl.org/;
acessado em: 17/01/2017), esse alelo é mais frequente em populações de origem
asiática do sul (98%) e do leste (100%), europeia (88%) e americana (87%), enquanto
que nas populações de origem africana o alelo A é o mais frequente (66%). Na análise
dos indivíduos controle para este marcador, o alelo C foi predominante (74%),
enquanto que o alelo A esteve presente em apenas 26% dos cromossomos
analisados. Para o marcador rs2266782 a mesma situação acontece, sendo o alelo
mais frequente encontrado nessa amostra (G) observado também nas populações
asiáticas do sul (69%) e do leste (81%), europeias (63%) e americanas (68%),
enquanto que nas populações africanas, os alelos A e G aparecem na mesma
proporção. Para o marcador rs2266780 foi identificado o alelo A como mais frequente,
assim como nas outras populações do banco de dados.
59
2. Haplótipos
Os haplótipos determinados para os indivíduos não aparentados e para os

indivíduos das famílias estão apresentados na tabela 9. O marcador rs74315338
representa a mutação de interesse Cys433Arg.
Tabela 9 – Haplótipos determinados dos indivíduos não aparentados e das famílias com a
mutação Cys433Arg. Cada coluna indica um marcador e cada linha um haplótipo. Cada
número representa um alelo diferente de cada marcador, sendo reiniciada a contagem para
os diferentes marcadores. O valor -1 indica a falta de informação sobre o alelo naquela
posição. Os marcadores estão ordenados de acordo com a posição no cromossomo.
Haplótipos – Famílias
rs6133 rs3221612 rs3219828 rs2266782 rs2266780 rs74315338 rs2234708 D1S2815 D1S1165 rs3223566 rs3220994 rs3220452 rs3219958
C 1 2 G A C 1 1 1 1 1 2 1
C 1 1 G A C 1 1 1 1 1 1 1
C 2 1 G A C 1 1 1 1 1 1 1
Haplótipos – Não aparentados
C 1 2 G A C 1 5 5 2 1 2 1
C 1 2 G A C 1 4 1 3 1 1 3
C 7 2 G A C 1 1 1 2 1 1 4
C 1 2 G A C 1 6 6 5 1 5 1
C 1 2 A A C 1 -1 3 -1 1 1 1
C 4 2 A A C 1 3 3 4 4 1 6
C 1 2 A A C 1 3 3 -1 3 1 5
C 8 1 -1 A C 1 4 4 1 1 2 1
C 1 2 G A C 2 6 5 2 1 2 1
C 3 1 G A C 3 4 1 3 1 2 1
C 7 3 G A C 5 3 4 4 1 6 5
C 3 3 G A C 5 1 3 3 2 2 2
C 7 2 G A C 5 5 1 4 4 6 1
C 8 2 A G C 1 -1 6 -1 1 3 3
C 1 4 A G C 2 6 2 2 1 2 1
C 5 1 A G C 5 6 2 5 4 5 1
60
Nas extremidades dos haplótipos determinados há divergências entre os alelos

nas extremidades, indicando que a associação não aleatória dos alelos está sendo
desfeita. Observando-se a tabela percebe-se que os haplótipos formandos pela
sequência G A C para os marcadores rs2266782, rs2266780 e a mutação
(rs74315338) é o mais estável sendo encontrado em 13 dos 19 haplótipos construídos
(68,4%). Ao considerar os marcadores rs3219828, rs2266782, rs2266780 e a
mutação, o haplótipo mais comum foi 2 G A C, presente em 8 haplótipos (42,1%).
Para os marcadores rs2266780, a mutação e rs2234708 o haplótipo A C 1 foi o mais
comum, presente em 11 haplótipos (57,9%). Estes quatro marcadores (rs3219828,
rs2266782, rs2266780 e rs2234708), destacados na tabela 9, formam os haplótipos
associados a mutação Cys433Arg (Figura 11).
Figura 11 – Representação dos haplótipos determinados para os indivíduos com a mutação

Cys433Arg. Os haplótipos são formados pelos marcadores rs3219828 (microssatélite),
rs2266782 (SNP), rs2266780 (SNP) e rs2234708 (microssatélite). O rs74315338 corresponde
a mutação de interesse. A primeira coluna indica a quantidade de cada haplótipo construído.
61
3. Estimativa da idade da mutação
O programa DMLE+ propõe o gráfico da idade da mutação estimada em

gerações pelo número de iterações realizadas (Figura 12).
Além da análise realizada com um total de 4 milhões de iterações, foram

também realizadas análises com 10 milhões, 20 milhões e 30 milhões de iterações no
total, a fim de verificar a consistência dos dados. Estas análises mostraram que ao
aumentar o número de iterações não foram encontradas diferenças nos resultados e
que o resultado é estável, portanto foram utilizadas 4 milhões de iterações para a
aquisição dos resultados.
62
Figura 12 – Gráfico das trajetórias das amostras MCMC gerado pelo programa DMLE+, sendo
que os primeiros dois milhões de iterações correspondem ao burn-in e os dois milhões
seguintes às iterações reais. Cada ponto no gráfico representa uma iteração.
Esses dados são mostrados também no histograma (figuras 13) gerado pelo
software DMLE+ e está reproduzido a seguir.
63
Figura 13 – Histograma representando a idade da mutação em gerações, de acordo com a

frequência de cada uma, resultante das iterações realizadas pelo programa DMLE+.
Por meio da análise do histograma, verifica-se que a moda da distribuição é

igual a 44 gerações o que corresponde à estimativa da idade da mutação com o
intervalo de confiança de 95% (barras verdes) entre 28 e 69 gerações. O que pode
ser convertido em intervalo entre 560 e 1380 anos, se considerarmos 20 anos entre
uma geração e outra (Slatkin et al., 1997; Griffiths et al., 1998; Slatkin et al., 2000;
Laitman et. al. 2013).
O estudo de Vasconcellos e cols (2000) mostrou que a mutação Cys433Arg

está associada a um haplótipo comum, e sugeriu que os indivíduos afetados pelo
glaucoma herdaram a mutação de um antepassado comum. Ao considerar os
resultados obtidos no presente trabalho, questionamos se a mutação surgiu na
população nativa que habitava o Brasil ou se estava presente em alguma população
que deu origem à população brasileira através das imigrações.
A população brasileira forma a quinta maior população do mundo e a maior

população da América Latina com mais de 204 milhões de habitantes
(http://paises.ibge.gov.br/#/pt/pais/brasil/info/populacao; acessado em: 19/01/2017),
destacando-se pelo alto grau de miscigenação entre os indivíduos nativos e os
imigrantes europeus e africanos que chegaram ao Brasil durante a colonização e o
64
tráfico de escravos, respectivamente. Sabe-se que mais de 2 milhões de nativos de

diversas etnias habitavam o território antes da chegada dos imigrantes e que, durante
o período colonial, aproximadamente 500 mil portugueses chegaram ao Brasil e nos
anos seguintes, mais de 4 milhões de imigrantes europeus de diversas
nacionalidades, como alemães, italianos, espanhóis, além dos portugueses,
chegaram ao país (Salzano et al., 1967;
http://biblioteca.ibge.gov.br/visualizacao/livros/liv6687.pdf; acessado em 03/02/2017).
Durante o período da escravidão, aproximadamente 4 milhões de africanos de
diferentes regiões da África, foram trazidos para o país. Estes dados históricos
demográficos mostram como a migração foi importante na formação da população
brasileira (Kehdy et. al., 2015).
Neste trabalho foram propostas três hipóteses para poder explicar esses
dados, são elas: 1) que a mutação Cys433Arg tenha chegado ao Brasil com o tráfico
negreiro; 2) presente na população nativa ou 3) tenha chegado ao Brasil com os
colonizadores europeus:
Hipótese 1: Tráfico negreiro
A primeira hipótese vincula a chegada desta mutação no Brasil através dos

escravos africanos trazidos para o país entre séculos XVI e XIX. Se for considerada a
idade de 20 anos (Slatkin et al., 1997; Griffiths et al., 1998; Slatkin et al., 2000; Laitman
et. al. 2013) entre uma geração e outra (idade considerada apenas para estimativa),
deveríamos encontrar o número de gerações da idade da mutação menor do que foi
encontrada para que estivesse próximo ao período do tráfico negreiro.
Ao considerar os resultados obtidos para o SNP rs6133, verifica-se que o alelo
C, menos comum em população africana, esteve prevalente na amostra analisada
neste estudo em portadores da mutação e em não portadores (74%). Isto indica que
a hipótese de que a mutação de interesse chegou ao Brasil junto com os escravos
pode não ser verdadeira.
65
Hipótese 2: Índios nativos
A segunda hipótese vincula o surgimento desta mutação nos habitantes nativos

do Brasil. Não há estudos sobre a incidência de glaucoma nos índios nativos do Brasil,
porém o estudo de Mansberger e cols (2005), mostrou que todos os nativos norte-
americanos de três tribos diferentes que apresentavam glaucoma primário de ângulo
aberto manifestavam PIO normal (abaixo de 21mmHg). No Brasil Veronesi e cols
(2016) avaliaram grupos indígenas na bacia amazônica, e constataram a presença
significativa de glaucoma primário de ângulo fechado. Porém é importante lembrar
que não existe estudo abordando a população indígena do estado de São Paulo em
relação a frequência de glaucoma.
Pacientes com a mutação Cys433Arg apresentam PIO elevada sendo que

grande parte é submetida a cirurgia para controlar a PIO por não responder aos
tratamentos clínicos, não corroborando com os estudos citados. Desta forma, a
hipótese de que a mutação tenha surgido nos nativos do Brasil pode ser inconclusiva.
Hipótese 3: Colonizadores europeus
A terceira hipótese vincula a chegada desta mutação no Brasil através dos

colonizadores europeus. Se for considerada a mesma idade entre uma geração e
outra, obteríamos uma idade muito próxima a época da chegada dos portugueses ao
Brasil. Ao sugerir que esta seja a hipótese verdadeira, então deveria ter ocorrido um
efeito fundador, corroborando com o estudo de Vasconcellos e cols (2000).
A mutação fundadora pode ter surgido pelo processo de mutação na própria

população ou pode ter sido trazida por imigrante (s). Isso acontece quando um grupo
pequeno de indivíduos migra para outro local e funda uma nova população. A nova
população pode ser composta por todos os alelos da população original com
frequências diferentes ou pode carrear apenas alguns alelos da população original.
Os processos mais complexos acontecem quando neste novo local de habitação já
existe outra população humana.
66
A mutação Cys433Arg pode ter vindo com os colonizadores europeus para o

Brasil, podendo ser extremamente rara na Europa ou até mesmo única nos colonos
que chegaram no Brasil há mais de 500 anos. Neste momento sua frequência poderia
ser ainda mais diminuída até desaparecer ou então poderia ter aumentado de
frequência, que é o que pode ter acontecido.
Mutações fundadoras apresentam um modelo interessante nos estudos da

genética humana. Testes genéticos para uma ou mais mutações fundadoras são mais
eficientes do que para outras mutações raras e existem estudos sobre a prevalência
e penetrância destas mutações (Kronn et al., 1995; Oddoux et al., 1996; Struewing et
al., 1997; Pastinen et al., 2001). Em alguns casos, a identificação das mesmas
mutações fundadoras ajudou no entendimento da relação genética entre as
populações distintas, como, por exemplo, entre as populações Ashkenazi (Ostrer,
2001).
Os estudos da distribuição das mutações raras e mutações fundadoras

conduzidas em algumas populações (Pastinen et al., 2001) mostram que mutações
introduzidas cedo na população possuíam uma distribuição relativamente uniforme
em diferentes sub-regiões. As mutações introduzidas recentemente apresentaram
aglomeração local, indicando a persistência na população isolada e o efeito de
múltiplos gargalos populacionais.
A mutação Cys433Arg não foi encontrada em outras regiões do mundo, apenas

no Brasil e conforme nossa estimativa da idade desta mutação, ela foi trazida para o
Brasil pelos imigrantes, mais provavelmente imigrantes europeus. O efeito fundador,
deriva genética e, talvez, outros processos demográficos levaram a um aumento na
frequência desta mutação na população brasileira, visto que esta está presente em
cerca de 30% dos casos de GPAA-J. Podemos ainda sugerir que a introdução desta
mutação ocorreu historicamente cedo na formação da população brasileira atual e que
houve tempo de aumentar sua frequência. Apesar de os indivíduos portadores desta
mutação analisados no presente trabalho serem provenientes de regiões urbanas do
estado de São Paulo, podemos constatar que no Brasil com altos índices de
urbanização e urbanização relativamente recente, as populações urbanas não formam
isolados locais. As populações urbanas são bastante heterogêneas, mas com as
diferenças regionais pouco acentuadas (Pena et al., 2011). Deste modo, poderíamos
esperar encontrar esta mutação em outras regiões brasileiras.
67
Embora nosso estudo contribua para o melhor entendimento da relação desta

mutação com a distribuição do glaucoma na população brasileira outros estudos
seriam necessários para a conferência das hipóteses sugeridas neste trabalho. Assim,
a avaliação de marcadores de ancestralidade pode ser utilizada a fim de compreender
a população de origem desta mutação, enquanto a triagem desta mutação em outras
regiões brasileiras poderia ajudar na compreensão da história demográfica desta
mutação no Brasil.
68
Conclusão
69
- Os marcadores rs3219828 (microssatélite), rs2266782 (SNP), rs2266780

(SNP) e rs2234708 (microssatélite) formaram o haplótipo ligado a mutação para a
estimativa da idade da mesma.
- A idade da mutação Cys433Arg no gene MYOC foi estimada em um intervalo

de 28 a 69 gerações (aproximadamente 560 e 1380 anos) por meio da utilização de
marcadores moleculares SNPs e microssatélites.
- A hipótese da chegada dessa mutação com os europeus pode ser a correta,

com a ocorrência de um efeito fundador quando esta chegou ao Brasil.
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81
Anexos
82
ANEXO I
Haplótipos e genótipos dos indivíduos sem a mutação Cys433Arg que foram utilizados
pelo software DMLE+ para a estimativa da idade da mutação. O número -1 indica a
impossibilidade de identificação do alelo naquela posição.
Haplótipos – Indivíduos sem a mutação

rs6133 rs3221612 rs3219828 rs2266782 rs2266780 rs74315338 rs2234708 D1S2815 D1S1165 rs3223566 rs3220994 rs3220452 rs3219958
-1 2 4 A A T 4 9 3 4 2 5 7
A 1 4 A A T 4 3 3 3 2 5 8
A 1 4 A A T 4 7 7 4 1 4 7
A 1 4 A A T 4 5 2 3 4 7 5
C 4 4 A A T 4 7 8 4 1 4 4
A 6 3 A A T 4 1 -1 1 3 7 5
A 1 2 A A T 4 3 8 2 4 7 5
C 2 3 A A T 4 9 7 4 5 8 6
C 4 3 A A T 4 9 9 2 2 5 7
C 1 2 A A T 4 9 3 4 2 5 7
C 2 3 A A T 4 9 7 3 6 2 6
-1 2 1 A A T 4 7 -1 4 9 5 9
A 3 2 A A T 4 2 3 7 2 5 7
A 1 4 -1 A T 4 1 7 4 1 4 6
A 1 4 -1 A T 4 1 7 4 1 4 2
A 3 4 -1 A T 4 1 7 3 6 2 6
C 2 1 G A T 4 3 3 1 4 5 4
C 7 5 G A T 4 6 7 4 4 6 6
C 7 1 G A T 4 1 1 1 1 4 1
C 1 2 G A T 4 4 1 1 1 1 1
C 2 2 G A T 4 1 1 1 1 1 1
C 2 1 G A T 4 1 2 1 2 2 6
C 2 2 G A T 4 1 1 1 4 4 5
-1 4 2 G A T 4 4 -1 6 9 5 4
A 1 4 A -1 T 4 5 7 3 4 7 5
A 1 4 A -1 T 4 5 -1 3 3 5 8
C 1 2 A -1 T 4 3 -1 2 2 5 5
A 7 1 A -1 T 4 5 -1 6 9 -1 5
A 1 2 G -1 T 4 3 4 2 2 5 8
C 9 5 A -1 T 1 5 -1 5 9 -1 6
C 8 4 A A T 6 6 -1 3 4 9 6
C 5 2 A A T 1 -1 1 -1 1 2 1
C 9 2 A A T 3 2 8 2 1 4 5
A 3 5 A A T 7 6 9 4 2 5 7
A 3 4 A A T 2 8 3 6 2 5 2
A 4 4 A A T 2 1 2 3 3 3 8
A 5 2 A A T 3 2 5 2 5 8 6
-1 8 2 A A T 5 3 8 6 3 3 4
-1 4 4 A A T 2 8 3 5 2 5 7
A 6 4 A A T 2 1 7 3 3 2 9
A 3 5 A A T 2 9 3 6 1 4 2
A 2 4 A A T 3 6 4 2 4 7 9
C 8 2 A A T 5 3 8 6 3 3 4
83
A 9 4 A A T 2 9 3 6 2 5 6
-1 1 4 A A T 2 1 8 7 3 3 6
C 9 2 A A T 3 2 7 1 6 2 5
A 3 4 -1 A T 2 1 8 7 1 4 2
A 3 4 -1 A T 2 1 3 6 1 4 2
A 2 5 -1 A T 6 4 4 2 4 3 5
C 7 5 -1 A T 7 5 6 5 6 4 5
A 2 5 -1 A T 6 5 4 2 4 3 5
C 7 5 -1 A T 7 5 6 4 6 4 5
C 1 1 -1 A T 1 1 1 1 1 1 1
A 5 1 -1 A T 3 6 8 2 1 4 5
A 5 3 -1 A T 2 9 3 6 1 4 2
A 7 1 -1 A T 3 2 3 6 3 3 4
A 2 3 -1 A T 2 9 3 5 1 4 2
A 2 3 -1 A T 2 4 3 5 2 5 6
C 2 3 -1 A T 2 5 2 3 3 3 8
A 1 1 -1 A T 2 1 8 2 5 8 7
C 5 5 G A T 6 5 7 5 4 9 5
C 9 3 G A T 3 5 5 1 2 5 3
A 5 2 G A T 3 2 2 3 5 4 2
C 6 5 G A T 5 3 8 3 5 5 5
C 2 1 G A T 1 1 1 1 1 4 1
C 2 1 G A T 1 4 1 1 2 1 1
C 6 1 G A T 1 1 1 1 1 1 1
C 9 1 G A T 1 1 1 1 1 1 1
C 3 1 G A T 1 1 1 -1 4 1 2
C 2 1 G A T 1 1 1 1 1 1 1
C 2 2 G A T 1 -1 6 -1 1 4 1
A 9 4 G A T 2 4 3 3 1 4 8
A 1 4 G A T 2 1 7 4 1 4 6
A 3 4 G A T 2 4 3 5 2 5 6
A 1 2 G A T 3 2 1 1 6 2 5
A 6 4 G A T 2 2 6 3 8 1 3
-1 5 3 G A T 2 2 3 5 1 4 5
-1 9 2 G A T 3 6 1 4 2 5 3
-1 9 2 G A T 3 2 7 4 6 2 4
A 1 2 G A T 2 1 7 4 5 8 6
A 9 4 G A T 2 4 3 5 1 4 6
A 3 4 G A T 2 4 3 5 1 4 2
C 7 6 G A T 2 1 8 7 3 3 1
A 4 4 G A T 6 2 3 5 1 4 6
A 6 4 G A T 2 2 3 5 3 3 2
C 2 5 -1 -1 T 4 5 2 3 5 4 1
C 1 4 A G T 3 4 6 3 1 3 6
C 2 3 A G T 3 4 2 5 7 6 6
-1 9 4 G G T 2 9 3 5 2 5 6
C 6 5 -1 -1 T 6 6 3 4 5 4 5
84
ANEXO II
Cálculo da proporção de cromossomos mutantes.
População mundial: 7.465.000.000 habitantes (IBEG)

População na região Sudeste do Brasil: 80.350.000 habitantes (IBGE)
População com GPAA-J: 150.000 pessoas (OMS)
Presença da mutação Cys433Arg em indivíduos com GPAA-J: 30% = 0,3 (estudos
anteriores sobre a mutação)
150.000
= 2,00938𝑒 −05
7.465.000.000
2,00938𝑒 −05 x 0,3 = 6,02813𝑒 −06
,02813𝑒 −06 x 80.350.000 = 484,3603483 (estimativa do número de cromossomos na

população do Sudeste do Brasil portadores da mutação)
Nossa amostra era formada por 19 cromossomos com a mutação (16 de indivíduos
não aparentados e 3 das famílias)
19
= 0,039226993
645,8137977
Portanto, a proporção de cromossomos mutantes foi de 0,039226993.

85
ANEXO III
Cálculo para as distâncias genéticas.
Marcador Distância física (pb)

rs6133 169565346
rs3221612 170316964
rs3219828 170860947
rs2266782 171076966
rs2266780 171083242
rs74315338 (mutação) 171631436
rs2234708 171622065
D1S2815 171714919
D1S1165 171801282
rs3223566 (D1S2790) 173024284
rs3220994 173972524
rs3220452 174372348
rs3219958 (D1S218) 174503273
Os marcadores estão organizados de acordo com as posições no cromossomo.
Marcador Distâncias genéticas (cM)

rs6133 169565346 – 169565346 = 0 / 100000000 = 0
rs3221612 170316964 – 169565346 = 751618 / 100000000 = 0,007516
rs3219828 170860947 – 169565346 = 1295601 / 100000000 = 0,012956
rs2266782 171076966 – 169565346 = 1511620 / 100000000 = 0,015116
rs2266780 171083242 – 169565346 = 1517896 / 100000000 = 0,015179
rs74315338 (mutação) 171631436 – 169565346 = 2039887 / 100000000 = 0,020399
rs2234708 171622065 – 169565346 = 2056719 / 100000000 = 0,020567
D1S2815 171714919 – 169565346 = 2149573 / 100000000 = 0,021496
D1S1165 171801282 – 169565346 = 2235936 / 100000000 = 0,022359
rs3223566 173024284 – 169565346 = 3458938 / 100000000 = 0,034589
rs3220994 173972524 – 169565346 = 4407178 / 100000000 = 0,044072
rs3220452 174372348 – 169565346 = 4807002 / 100000000 = 0,048070
rs3219958 174503273 – 169565346 = 4937927 / 100000000 = 0,049379
86
ANEXO IV
87
ANEXO V
Universidade Estadual de Campinas

Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
Regulamento do Biorrepositório vinculado ao projeto de pesquisa
Título da Pesquisa: ASPECTOS GENÉTICOS DE DOENÇAS OFTALMOLÓGICAS
Armazenamento e uso do material biológico:
O material biológico será armazenado in natura. As amostras serão armazenadas em equipamentos de

congelação (freezer --‐20oC) específico com compartimentos utilizados somente para este fim,
presente no laboratório de Genética Humana, coordenado pela Profª Mônica Barbosa de Melo. As amostras
serão codificadas apenas por números e a chave de ligação entre números e nomes de pacientes será
armazenada em programa de computador protegido por senha. Somente 2 pessoas terão acesso a esta
chave de código (pela posse da senha) a Profa. Dra. Mônica Barbosa de Melo (matrícula UNICAMP 29195--‐
8) e a técnica em biotecnologia Daniela Stancato (matrícula UNICAMP 27152--‐7).
A guarda e a autorização do uso do referido material estará sob a responsabilidade exclusiva da Profa. Dra.
Mônica Barbosa de Melo (matrícula UNICAMP 29195--‐8), Pesquisadora do Centro de Biologia Molecular
e Engenharia Genética (CBMEG), UNICAMP.
Será assegurado a todos os participantes da pesquisa, consentidores do material, a garantia de que

resultados obtidos e que sejam de seu interesse lhes seja comunicada (e/ou ao médico responsável por seu
tratamento, quando for o caso). Para tanto, informações sobre endereço para contato e telefone serão
armazenadas em um programa de computador protegido por senha, e utilizado como descrito no item a.
Com relação ao funcionamento do Biorrepositório:
O participante da pesquisa, ou seu representante legal, a qualquer tempo e sem quaisquer ônus ou
prejuízos, pode retirar o consentimento de guarda e utilização do material biológico armazenado no
Biorrepositório, valendo a desistência a partir da data de formalização desta. A retirada do consentimento
será formalizada por manifestação, por escrito e assinada, pelo sujeito da pesquisa ou seu representante
legal, cabendo--‐lhe a devolução das amostras existentes.
O prazo de armazenamento do material biológico humano em biorrepositório deve estar de acordo com o
cronograma da pesquisa correspondente e atender às normas vigentes do CNS, com um prazo mínimo de
cinco anos após a conclusão de todas as análises planejadas para o estudo e podendo ser autorizado por
até 10 anos. Conforme a CONEP, renovações da autorização de armazenamento serão permitidas mediante
solicitação do pesquisador responsável ao CEP, acompanhada de justificativa e relatório das atividades de
pesquisa desenvolvidas com o material durante o período.
Ao final do período de realização da pesquisa, o material biológico humano armazenado deverá ser
transferido formalmente para outro Biorrepositório ou Biobanco, mediante aprovação do CEP (conforme
disposto no art. 7º da Portaria nº2.201, de 14 de setembro de 2011), ou descartado caso seja
88
89
ANEXO VI

Marques AnaMaria M

Caricato da

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

ANA MARIA MARQUES

Estimativa da idade da mutação Cys433Arg no gene

Estimativa da idade da mutação Cys433Arg no gene

Dissertação apresentada ao Instituto de

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À

Orientadora: PROFª. DRª. MÔNICA BARBOSA DE MELO

Marques, Ana Maria, 1991-

MarOrientador: Mônica Barbosa de Melo.

Mar1. Mutação (Biologia). 2. Gene MYOC. 3. Glaucoma primário de ângulo

Informações para Biblioteca Digital

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Prof.ª Dr.ª Mônica Barbosa de Melo (Orientadora)

Prof.ª Dr.ª Edi Lúcia Sartorato

Prof.ª Dr.ª Cláudia Vianna Maurer Morelli

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se

Aos meus pais, pelo apoio, amor e confiança.

O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível, afetando mais de 60

Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness, affecting more than 60

ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 – Escavação do nervo óptico. A. Escavação normal do nervo óptico. B.

Figura 2 – A. Representação de um olho com ângulo aberto (entre a córnea e a

Figura 3 – Representação da perda do campo visual periférico conforme o

Figura 4 – Características estruturais do domínio Olfactomedina. A. Representação

Figura 5 – Heredograma da família 1 com 6 indivíduos analisados. Os indivíduos

Figura 6 – Heredograma da família 2 com 20 indivíduos analisados. Os indivíduos

Figura 7 – Heredograma da família 3 com 9 indivíduos analisados. Os indivíduos

Figura 8 – Localização dos marcadores moleculares e da mutação no cromossomo 1

Figura 9 – Eletroferogramas dos genótipos de uma amostra do conjunto 1 dos

Figura 10 – Eletroferograma dos sequenciamentos dos SNPs. A. Homozigoto para o

Figura 11 – Representação dos haplótipos determinados para os indivíduos com a

Figura 13 – Histograma representando a idade da mutação em gerações, de acordo

Tabela 1 – Relação mutação-fenótipo de variantes do gene MYOC. Em destaque, a

Tabela 2 – Conjuntos de iniciadores utilizados para amplificação dos microssatélites

Tabela 3 – Conjuntos de iniciadores utilizados para amplificação dos SNPs e

Tabela 4 – Programas das reações de PCR para a amplificação dos

Tabela 5 – Programas das reações de PCR para a amplificação dos SNPs............50

Tabela 6 – Programa das reações de sequenciamento dos SNPs...........................51

Tabela 7 – Caracterização dos marcadores microssatélites para os indivíduos não

Tabela 8 – Caracterização dos marcadores SNPs para os indivíduos não aparentados

Tabela 9 – Haplótipos determinados dos indivíduos não aparentados e das famílias

ASB10 ankyrin repeat and SOCS box containing 10

ATOH7 atonal BHLH Transcription Factor 7

CAAE certificado de apresentação para apreciação ética

CEP comitê de ética em pesquisa

cSNP polimorfismo de base única em região codificadora

DMRI degeneração macular relacionada à idade

DNA ácido desoxirribonucleico

EDTA ácido etilenodiaminotetracético

GCP glaucoma congênito primário

GLC1A primeiro locus associado ao GPAA

GLC1E quinto locus associado ao GPAA

GLC1F sexto locus associado ao GPAA

GLC1G sétimo locus associado ao GPAA

GLC1O décimo quinto locus associado ao GPAA

GLC1P décimo sexto locus associado ao GPAA

GPAA glaucoma primário de ângulo aberto

GPAA-J glaucoma primário de ângulo aberto juvenil

GWAS estudo de associação genômica em larga escala

HCl ácido clorídrico

KCl cloreto de potássio

MCMC Markov Chain Monte Carlo

MgCl2 cloreto de magnésio