27/05/2020

TECNICAS DE AISLAMIENTO
MICROBIANO

SEMANA 5

1
 INTRODUCCION(1)
 En la naturaleza, la mayoría de los
microorganismos no se encuentran
aislados, sino integrados en poblaciones
mixtas. Para llevar a cabo el estudio de
estos microorganismos y de sus
propiedades, es necesario separar unos
de otros y trabajar con especies aisladas,
obteniendo cultivos axénicos o puros.
 Un cultivo axénico o puro es aquel que
contiene un sólo tipo de microorganismo
y que procede generalmente de una sola
célula; el crecimiento de ésta origina, en
medio sólido, una masa de células
fácilmente visible que recibe el nombre
de colonia.
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 INTRODUCCION(2)
 Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población
microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento,
que fueron desarrolladas durante el siglo XIX.
 En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta
finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de
microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento.
 La escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados
con agar, y las placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la
separación física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o
en el interior del mismo.
 El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies
microbianas

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 METODOS DE AISLAMIENTO
• Para aislar células individuales, los microorganismos han de ser
diluidos, debido al gran numero en que normalmente están
presentes.
• La dilución se realiza, normalmente, por uno de los siguientes
sistemas:
 Agotamiento en asa
 Estrías escocesas
 Extensión en placa.

Para que se pueda contar el número de

colonias en la placa debe estar entre 30 y 300.

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 TECNICAS DE AISLAMIENTO
 Se realiza un aislamiento de los microorganismos
presentes en un cultivo mixto en caldo ordinario, sobre
agar nutritivo. Se siembran dos placas de agar nutritivo,
una mediante la técnica del agotamiento de asa y otra
mediante la de estrias escocesas.
 Estas técnicas pretenden diluir la carga microbiana que
se deposita sobre el medio de cultivo de forma que, en
los últimos trazos de la siembra, haya tan pocas células
que queden suficientemente separadas unas de otras y
puedan desarrollar colonias independientes.

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 Tipos de siembras microbiología

Video 1

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 Técnica del agotamiento de asa
 Tomar el tubo con el cultivo mixto, agitar para homogeneizar
su contenido. Flamear el asa bacteriológica y tomar una
muestra del cultivo. Flamear la boca del tubo tanto al abrirlo
como antes de cerrarlo.
 En una placa con agar nutritivo y tocando con suavidad la
superficie del medio, extender la muestra siguiendo el
esquema de la figura. El recorrido del asa debe ser lo más
largo posible con el fin de conseguir al final del mismo
células aisladas que darán lugar a colonias. Al destapar la
placa de Petri mantener la tapa en la mano, abriéndola sólo
lo necesario para realizar la siembra. Después de sembrar
cerrar la placa y dejar en posición invertida para llevar a
incubar a 37ºC.
7 MICROBIOLOGIA 27/05/2020
 Técnica del agotamiento de asa

https://www.youtube.com/watch?v=X_0e9
WuFTrQ

https://www.youtube.com/watch?v=-
TnHCd4sY24

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 Técnica del agotamiento de asa
 Tras 24 horas de incubación podemos observar las colonias formadas
por los distintos tipos de microorganismos del cultivo mixto con sus
diferentes características Se observa una mayor densidad de
crecimiento al principio del agotamiento sin poder diferenciar
colonias, sin embargo, al final de éste las colonias están mejor aisladas
y se aprecian las diferencias entre ellas como son el tamaño, color y
forma.

Crecimiento de colonias bacterianas

MICROBIOLOGIA
mediante la técnica
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del agotamiento de asa
 Técnica de las estrías escocesas (1)
 El procedimiento es igual al del agotamiento de asa pero la muestra de
cultivo se siembra siguiendo el esquema de la figura. Después de realizar
la primera descarga se cierra la placa y se flamea el asa. Sin cargarla de
nuevo, se gira la placa unos 45º y arrastrando del final de las estrías
realizamos la segunda fase de las mismas, se repite el procedimiento dos
veces más hasta la última estría que finaliza con un pequeño
agotamiento en el centro de la superficie del medio de cultivo. La placa se
cierra y se invierte para llevar a incubar a 37ºC.

10 MICROBIOLOGIA https://www.youtube.com/watch?v=ONy_T3d25xU
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 Técnica de las estrías escocesas (2)
 Tras 24 horas de incubación observamos que en las primeras
descargas realizadas con el asa de siembra hay un crecimiento
mayor con pocas colonias diferenciadas, y estas van
disminuyendo en densidad en las siguientes estrías observándose
finalmente las colonias aisladas y apreciándose la diferencia entre
ellas.

Crecimiento de colonias
bacterianas mediante la técnica de estrías
escocesas
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 TECNICAS DE AISLAMIENTO Y RECUENTO
 El banco de diluciones. Se realizan una serie de diluciones
seriadas a partir del cultivo mixto Con esta técnica conseguimos
además de aislar colonias, obtener un recuento del número de
bacterias que tenemos en el cultivo

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 BANCO DE DILUCIONES (1)
Esta técnica nos permite un doble objetivo, el aislamiento de colonias y
además el recuento de los microorganismos que tenemos en el cultivo
inicial.
Se trabaja con cinco tubos con suero fisiológico estéril, uno de ellos con 10
mL y el resto con 9 mL, en el orden que se muestra en la figura.

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 BANCO DE DILUCIONES (2)
Mediante una pipeta estéril tomar 1 mL del cultivo mixto y depositarlo en el primer
tubo. Agitar hasta conseguir una suspensión homogénea.
Tomar otra pipeta estéril y de este primer tubo transferir 0,1 mL al segundo tubo,
agitar y repetir la operación transfiriendo 1mL del segundo al tercer tubo, del
tercero al cuarto y del cuarto al quinto.

Una vez realizado el banco de diluciones procederemos a sembrar de los tres

últimos tubos (diluciones 104, 105 y 106) 0,1 mL en placas de agar nutritivo,
mediante la técnica de siembra por extensión (ver video). Se depositan los 100
microlitros en la superficie del agar y se debe extender la muestra en toda la
superficie del mismo, utilizando para ello el asa de vidrio.

https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practic
as-de-microbiologia/indice/tecnicas-de-
aislamiento/banco-de-diluciones-1

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 BANCO DE DILUCIONES (3)
Ejemplo de resultados tras la realización de un banco de diluciones

Recuento del número de colonias en las placas sembradas con las

diluciones 104, 105 y 106 (para facilitar el recuento se utiliza un rotulador de
vidrio punteando una a una cada colonia)

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 Aspectos comunes de colonias microbianas

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 AISLAMIENTO A PARTIR DE TEJIDO VEGETAL
 A partir del tejido vegetal enfermo es posible aislar a los patógenos.
 Se busca tomar trozos de la zona de avance para incrementar las chances de aislar al
patógeno.
 Los trozos de tejido vegetal se someten a una desinfección superficial.
 En el caso de bacterias es posible macerar un trozo de tejido afectado y luego sembrar
 Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de avance del patógeno .
 Ej: a partir de frutos afectados

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Aislamiento a partir de trozos de tejido
vegetal
 Trozos de tejido afectado de la zona de avance son sembrados en medio de cultivo
(ej. Madera)

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 Aislamiento a partir de tejido vegetal

 Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de avance del patógeno

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 Aislamiento de bacteria a partir del
tejido infectado
 Tocando con el ansa en la zona de avance de la infección es posible aislar la
bacteria.

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 Aislamiento directo a partir del signo.
 Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible tomar una pequeña
porción del mismo y sembrar en una placa con medio de cultivo.

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 Aislamiento de microorganismos del suelo

 Esquema de la metodología utilizada para aislar a partir de suelo.

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 Macro y micronutrientes

Los nutrientes se pueden clasificar (según las cantidades en que son

requeridos) como:
• micronutrientes o elementos traza
• macronutrientes
En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte
de sustancias organices o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán
incorporados para construir macromoléculas y estructuras celulares; otros solo
sirven para la producción de energía, y no se incorporan directamente
como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles.

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 Nutrientes
Agua
Desde el punto de vista de sus posibles
papeles, el agua es:
- El principal componente del protoplasma
bacteriano;
- El medio donde suceden las reacciones
químicas
- Un reactante en exceso (producto resultante
de algunas reacciones bioquímicas)
• Los microorganismos necesitan grandes
cantidades de agua.
Requieren cierto grado de humedad para
crecer.
La disponibilidad se mide por un parámetro
denominado: actividad de agua (aw) o
potencial de agua. Valores normales entre
24
Ingenieria de los Bioprocesos 0.90- 27/05/2020
0.99.
 Carbono

 Elemento mas abundante en las macromoleculas. Constituye el

50% del peso seco de las celulas.
 Muchos procariotas son heterotrofos- necesitan algun tipo de
compuesto organico como fuente de carbono para hacer nuevo
material celular. Los aminoacidos, los acidos grasos, los acidos
organicos, los azucares, las bases nitrogenadas, los compuestos
aromaticos y otros, pueden ser utilizados por las bacterias.
 Algunos procariotas son autotrofos- capaces de construir todas
sus estructuras organicas a partir del CO2 con la energia obtenida
de la luz o de compuestos inorganicos.

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 Fósforo

El fósforo se usa para la sintesis de los acidos nucleicos y los

fosfolipidos, pero aparece tambien en coenzimas y en proteinas.
Suele requerirse en forma de fosfatos, sea organicos o inorganicos.
Las bacterias que pueden usar los fosfatos organicos (poseen
fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden
recurrir igualmente a los fosfatos inorganicos. Los fosfatos organicos
son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-
negativas) periplasmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina)

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 Nitrógeno y Azufre

 Los elementos N y S son requeridos por todos los seres vivos.

 Se encuentran en la celula en estado reducido: el radical -NH2
forma parte de los aminoacidos y de las bases nitrogenadas el
radical -SH interviene en determinados aminoacidos y en
coenzimas como la CoA.

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 En que formas químicas entran el N y S a las
bacterias?

 La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterótrofas asimilan

estos elementos en forma combinada inorgánica oxidada:
 como NO3
 como SO4
 Muchas bacterias heterotrofas pueden usar alguna forma reducida
 de N inorganico: amonio (NH4+)
 de S inorganico: sulfuros (S2-, SH-)
 de N organico: aminoacidos, peptidos
 de S organico: cisteina
 Algunas bacterias pueden usar el N2 de la atmosfera mediante la fijación
biológica del N

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 Sales minerales
 Son la fuente de aniones y de cationes para la célula. Los siguientes
cationes, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++,
Ca++, Fe++.
 El ión potasio (K): interviene en la activacion de una variedad de enzimas,
incluyendo las que participan en la sintesis de proteinas.
 En Gram-positivas esta asociado con los acidos teicoicos de la pared.
 El ión magnesio (Mg): estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos;
como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican
transferencia de grupos fosfato. Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas
de bacterias fotosinteticas.
 El ión calcio (Ca): es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.
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 El hierro (Fe)

Participa en muchas moleculas implicadas en procesos de

respiracion, como citocromos y ferroproteinas no hemicas (proteinas
con Fe-S); interviene como cofactor en ciertas enzimas.
El hierro (principalmente como ion ferroso, Fe++) suele estar
acomplejado en la naturaleza, formando sales insolubles. Las
bacterias disponen de una serie de moleculas, denominadas
sideroforos, capaces de captar ese hierro

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 MICRONUTRIENTES O ELEMENTOS TRAZA

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 Factores de crecimiento.

Son moléculas orgánicas especificas que, en pequeñas

cantidades, algunas bacterias necesitan para crecer.
• Ejemplos
– Vitaminas,
– Aminoácidos,
– Purinas,
– pirimidinas.
La mayoria de los microorganismos son capaces de
sintetizarlos.

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