CLASE: 7 Diagnóstico virológico por laboratorio.

Eyder R. Las áreas clínicas donde tiene relevancia el diagnóstico virológico son principalmente las listadas
en la imagen, porque en la mayoría de los virus no existe tratamiento específico, ya que en general la
respuesta inmune es la que elimina el virus.

Sin embargo, en ciertas entidades es necesario hacer un diagnóstico virológico para hacer un diagnóstico
diferencial con bacterias u otros microorganismos que tienen síntomas similares.

Pacientes inmunocomprometidos: En estos es muy importante saber si se trata de un virus o una bacteria,
porque si es una bacteria hay que emplear antibióticos.

Infección respiratoria aguda: El manejo es diferente si se trata de una infección bacteriana o de una
infección respiratoria viral, que tiene un tiempo de hospitalización mucho más corto. Así se evita también el
uso indiscriminado de antibióticos.

Enfermedad febril aguda: Principalmente porque existen muchas enfermedades que cursan con fiebre y se
podría confundir el diagnóstico.

Hepatitis aguda o crónica: En el caso de hepatitis también es importante saber si se trata de infección aguda
o crónica, no es lo mismo la hepatitis A que es aguda, en cambio la hepatitis C permite entrar en lista de
espera para recibir un trasplante de hígado, porque este paciente tiene el riesgo de desarrollar un carcinoma
hepatocelular en 20 o 30 años.

Infecciones oculares: Por ejemplo una conjuntivitis bacteriana, que se trata con antibióticos y
antiinflamatorios esteroideos. Pero si se trata de una conjuntivitis viral y le damos esteroides al paciente se
reduce la respuesta inmune y esto es lo único que tenemos para defendernos de un virus. Entonces el
tratamiento para las bacterias en este caso está contraindicado para los virus. De ahí lo importante de saber si
cuando se trata de infección por virus o por bacterias. Camilo A. Infecciones congénitas: Esta población
(niños) puede ser afectada por infecciones congénitas virales, bacterianas o parasitarias.
En salud pública es importante el diagnóstico confirmatorio de una infección viral, en el caso de
infecciones respiratorias, las cuales son de reporte obligatorio.

También en enfermedades prevenibles por vacunación. Si hay brotes de enfermedades que son
prevenibles por una vacunación significa la vacunación no está sirviendo, para esto debemos confirmar
que de verdad se trata de una infección viral.

O en el caso de brotes de enfermedades transmitidas por mosquitos, como artrópodos vectores,

como por ejemplo virus de la fiebre amarilla, que puede ser de zonas selváticas más que de urbanas,
ya que controlar una epidemia de fiebre amarilla es costoso, y para esto es importante confirmar si de
verdad se trata de un caso de fiebre amarilla que está apareciendo en una ciudad por ejemplo.

En conclusión para salud pública es importante hacer un diagnóstico de una infección viral.

Tenemos dos objetivos para hacer el diagnóstico por infección viral:

1. Saber que tiene el paciente, resolver el problema (enfermedad).

2. Soporte de vigilancia de salud pública, para saber si se está iniciando una epidemia por
virus, si estos están circulando en áreas nuevas (p.e. dengue serotipo II que no circulaba
en un área y ahora sí) y también para hacer estudios de sero-prevalencia.

¿Cuáles son la condiciones para tener éxito en realizar el diagnóstico de un virus en el

laboratorio?
Es importante saber el tiempo de colección de la muestra de acuerdo al tipo de infección que se
tenga. Los tipos de infección son:
1. Aguda.
2. Crónica: latente y persistente.

Por ende es importante saber que tipo de infección estamos buscando, el tipo de muestra y las
condiciones de transporte de laboratorio.

Andrés M. Si se trata de una infección aguda, debemos tener en cuenta que si vamos a detectar el virus (es
el gold standard), el virus infeccioso solamente se detectará durante la primera semana de síntomas, después
de la primer semana, ya no se encontrará el virus después de este tiempo, así que no vale la pena hacerla
porque la prueba no será sensible.

En las infecciones latentes, si no tiene síntomas y el virus está latente, nunca se le encontrará porque el
virus no se está replicando.
En las infecciones persistentes siempre lo vamos a encontrar, si usted no sabe que tiene el paciente y le
manda prueba para todo, y el paciente anteriormente se ha infectado con citomegalovirus o Epstein Barr (pero
no están enfermos), usted los detectarán pero ellos no serán los que están causando la sintomatología del
paciente, simplemente son virus que están persistentes pero no están causando enfermedad.

Se debe escoger siempre la prueba de laboratorio y la muestra de acuerdo a qué tipo de infección creemos
que está ocurriendo en el paciente, y también de acuerdo a la fase de la infección en la que está el paciente.

En una infección aguda, por ejemplo en un síndrome febril agudo; mientras tengamos fiebre, vamos a
tener viremia y vamos a detectar el virus, ya sea cultivando, haciéndole prueba molecular de PCR,
detectando los antígenos del virus; mientras hay fiebre se detecta el virus.
Después de la primer semana ya no se detecta, y tendremos que hacer uso de otras herramientas, allí es
cuando aparece la respuesta inmune, tanto IgM como IgG, que se detectarán con pruebas de ELISA. Hay que
saber en qué fase de la infección está el paciente y cuantos dias lleva enfermo para saber qué pruebas se
deben enviar para diagnosticar.

Se debe tener en cuenta que la IgM se eleva después de que el virus ya se ha eliminado, llega a niveles
bastantes elevados hasta 3 semanas, después del inicio de síntomas, pero puede permanecer elevada hasta
3 meses después de la infección, así que se debe tener en cuenta, que se puede detectar una IgM elevada
y tratarse de una infección vieja que ocurrió hace dos meses, el problema del diagnóstico con anticuerpos
es que es probable, no nos confirma.

Para poder confirmar una infección con anticuerpos tendríamos que hacerle una muestra acá (señala en la
gráfica cuando empiezan a aparecer las IgM) cuando apenas se está elevando Danly G.; y otra muestra una
semana después; lo que se determina es la elevación de los anticuerpos, si se eleva cuatro veces los títulos
por decir un ejemplo, eso nos dice que hay una infección activa; pero si el título de anticuerpos que se mide al
inicio es igual al que mido una semana después, quiere decir que es una infección vieja. Solo lo
confirmaremos si hacemos dos muestras al paciente, una cuando estaba enfermo y una cuando está sano, el
problema es que nadie va a volver después cuando está sano a que le tomen la muestra, entonces el
diagnóstico por anticuerpos se complica un poco, porque cuando nos dé positivos, solamente nos dice que
probablemente se trate de esa infección, pero no es 100% seguro.

Igualmente la IgG permanece elevada por el resto de la vida de un individuo, entonces si la detectamos
puede tratarse de una enfermedad de dos años atrás, y en este momento tiene otra cosa. También habría que
tomar títulos de anticuerpos al inicio y una semana después, para ver si se le han elevado.

Se deben tener en cuenta los periodos de ventana inmunológica, esto es un espacio. (la profe no lo aclara,
pero es el tiempo que transcurre desde que ingresó el virus al organismo hasta que se producen anticuerpos
detectables, aprox 2 semanas)

Vemos el ejemplo en la Infección de VIH-Sida, esta infección tiene 3 etapas:

● Etapa aguda: que puede durar unos cuantos días hasta unas semanas, donde el virus se
replica a altos títulos.
 ● Etapa crónica o asintomática de Sida: Aún no se ha progresado a Sida, puede durar por
lo general de 5-10 años, pero en algunos individuos que son progresores rápidos puede
durar hasta 1 año. El virus está controlado.
● Etapa de inmunosupresión profunda o Sida: Donde el virus empieza a replicarse.

Entonces en lo que quiero llamar la atención con la ventana inmunológica es en los anticuerpos,
los anticuerpos del virus de HIV en la fase aguda (5 a 6 semanas), no los detectamos, así la
persona esté infectada no se detectarán los anticuerpos. A este periodo Karina V. donde no los
detectamos aunque esté infectada la persona se llama ventana inmunológica.

Periodos de ventana inmunológica

Los anticuerpos para el virus del VIH se van a detectar en la fase crónica, cuando se hace una
prueba de anticuerpos en un paciente infectado por VIH es que lleva un largo tiempo en la fase
crónica de la infección, no está en la fase aguda.

Si usted envía la prueba de anticuerpos a un paciente recién infectado no se los va a detectar

porque está en periodo de ventana inmunológica, sale negativo. Hay que tener en cuenta esto en
una prueba de diagnóstico.

Para poder saber que prueba mandar al paciente tener en cuenta:

★ De qué tipo de infección se trata

★ En qué momento de la infección está el paciente para saber si le busco el virus o los
anticuerpos.
 Algo muy importante es el tipo de muestra clínica, ¿donde se pueden detectar virus? los virus
se pueden detectar de acuerdo a donde se está replicando: si es un virus que causa viremia (está
en la sangre y se replica) vamos a poderlo detectar en el suero o en el plasma.

¿Qué es el suero y el plasma?

Suero: en el ha ocurrido todo el proceso de coagulación, se centrifuga y la parte líquida

corresponde a todos los anticuerpos y demás proteínas sin el complemento y sin las proteínas de
la coagulación.

Plasma: Es cuando se separan los eritrocitos de la sangre y queda el líquido plasmático con las
proteínas de coagulación, y no se coagula porque se centrifuga pero se adicionan
anticoagulantes; la muestra de sangre se recoge con anticoagulantes (es una muestra de
sangre completa) que tiene todos los factores de coagulación porque no se ha coagulado la
muestra.

En ambos (suero y plasma) se pueden detectar virus, tienen anticuerpos también.

La ventaja de tomar la muestra con anticoagulantes es que tenemos la sangre completa en

donde podemos centrifugar y tomar el plasma que es la parte líquida pero también podemos aislar
leucocitos y linfocitos y allí podemos buscar virus o podemos estudiar la respuesta inmune.

LCR: Es la muestra que se toma cuando hay sospecha de un cuadro neurológico viral, por
ejemplo meningitis o encefalitis Allison E. entonces se toma el líquido cefalorraquídeo para
buscar los virus. La muestra de LCR es fastidiosa para buscar virus; si uno quiere buscar virus
infeccioso pocas veces los encuentra, porque no se sabe por qué pero una vez se ha sacado el
líquido, se ha hecho la puncion lumbar empieza a ocurrir un proceso de degradación de proteínas
allí en ese líquido cefalorraquídeo, por lo tanto, cuando uno va a detectar virus en el líquido
cefalorraquídeo lo debe hacer por pruebas moleculares porque es mucho más sensible; o sea no
buscar el virus infeccioso sino buscar los ácidos nucleicos de los virus.

Fluido vesicular: Se puede usar cuando se trata de una lesión eruptiva tipo herpes, donde se forman
vesículas, el virus está en las vesículas entonces uno lo puede detectar.

Una muestra ideal para detectar virus respiratorios es el aspirado nasofaríngeo, porque los virus están en las
células, las bacterias están extracelulares y las encontramos en el moco, pero los virus están dentro de las
células; si yo voy a detectar los virus por fluorescencia por ejemplo debo tomar células, entonces el aspirado
nasofaríngeo se toma introduciendo una sonda hasta la nasofaringe y con una jeringa succiona para arrastrar
la mayor cantidad de células posible, y allí puede detectar entonces a los virus.

Los virus también se pueden detectar en materia fecal si son infecciones virales asociadas a problemas
gastrointestinales.

La muestra se debe transportar rápidamente al laboratorio, se debe almacenar y transportar a 4º C, si quiere

detectar virus infeccioso y no es posible mandar la muestra al laboratorio las primeras 24 - 48 horas lo mejor
es congelar a una temperatura de -70 o -80º celsius, y después se transporta al laboratorio en hielo seco o
congelado.

Hay dos formas de hacer el diagnóstico: uno es la detección directa del virus o las pruebas de anticuerpos
que nosotros la llamamos serología, es detectar anticuerpos específicos contra los virus; y para detectar virus
podemos hacer cultivos virales, o sea podemos cultivar el virus infeccioso de la muestra clínica, aislarlo en
células, en cultivos, podemos hacer la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) si se trata de un
virus RNA, tenemos que convertir ese RNA a un DNA. Jessica G.

(…) Si se trata de un virus RNA tenemos que convertir ese RNA primero a un DNA y eso se llama
transcripción reversa PCR (RT-PCR); pero también podemos detectar antígenos virales, proteínas virales, o
si tenemos tejidos podemos hacer Inmunohistoquímica utilizando anticuerpos para detectar el virus
infectando esos tejidos.

En las infecciones virales agudas esto se puede lograr siempre que se esté durante los primeros cinco días o
la primera semana de síntomas, después ya no lo vamos a detectar. Las infecciones persistentes ya duran
más días así que no se pueden detectar.

Pruebas serológicas

Con las pruebas serológicas vamos a detectar los anticuerpos después de que ya no haya virus. Existen
diferentes metodologías como:
● Inmunoensayo Enzimático ELISA: con ella se pueden detectar IgM o IgG.
● Pruebas cromatográficas: se llaman “pruebas rápidas”. Son menos sensibles que las pruebas
de ELISA.
● Ensayos de neutralización.
Estas son las tres principales pruebas de anticuerpos que tenemos en el laboratorio.
Sin embargo, la confiabilidad está en relación inversa a la facilidad de hacer la prueba. Tenemos
los métodos directos (en donde están la detección del virus, la detección del genoma o la
detección de un antígeno del virus) que son altamente confiables porque estoy detectando al
virus, al causante de la infección, es decir el Gold Standard entonces es muy confiable, pero la
accesibilidad es baja porque son más difíciles de hacer y no en todas partes tienen la experiencia.

Las pruebas más fáciles de hacer son las pruebas de anticuerpos (que son la cromatográfica o el
ELISA). Entonces la accesibilidad de las pruebas está inversamente relacionada con la
confiabilidad que nos da.

Aislamiento viral en cultivos celulares

En el laboratorio debemos tener líneas celulares y lo que observamos en la imagen es una

monocapa de células a la cual vamos a exponer la muestra del paciente. Por ejemplo, si el
paciente tiene una infección respiratoria entonces tomamos el aspirado nasofaríngeo y le
colocamos esto a la monocapa de células, esperamos 10 días y el virus va a tener un efecto
denominado Efecto Citopático sobre esas células, es decir le va a cambiar la morfología y, en
este caso, va a formar sincitios: masas multinucleadas gigantes formadas a partir de la fusión de
células infectadas con células no infectadas. Esto lo hace por ejemplo el Virus Respiratorio
Sincitial. Lina Sin embargo, hay otros virus que podrían tener el mismo efecto citopático, por
ejemplo Sarampión. Cuando uno tiene un paciente menor de un año, con bronquiolitis, se puede
pensar que se trata de VRS, pero de todas formas para descartar un Sarampión, hay que hacer
pruebas de inmunofluorescencia, donde se usan Ac monoclonales específicos para VRS y
determino si este efecto era producido por este virus.
Este proceso de aislamiento se demora de 10 a 14 días, pero no sirve para realizar el diagnóstico
del paciente ya que este no se va a esperar todo este tiempo, entonces la prueba se utiliza más
que todo en salud pública, para confirmar si hay una epidemia, qué virus es, caracterizarlo,
tipificarlo, buscarle los genotipos, pero no para solucionarle la situación al paciente porque no voy
a esperar de 10 a 14 días para resolverle.

También podemos aislar los virus utilizando ratones lactantes, hoy en día ya casi no se utilizan
animales de experimentación, la única entidad viral donde todavía se utilizan, porque no ha habido
otra forma de aislar el virus, es en el Virus de la Rabia. Para determinar si un cerebro está
infectado por el virus, se hace el macerado de cerebro, se inocula en el ratón lactante y se espera
que el ratón tenga los síntomas y se le hace inmunofluorescencia de cerebro para buscar el Virus
de la Rabia, esto se llama prueba biológica.

Las desventajas del aislamiento de virus son:

 ● Ofrecer un diagnóstico retrospectivo, es decir que diez días después nos damos cuenta
qué virus tenía el paciente.
● Cuando ya no hay virus después de la primera semana de infección, la sensibilidad es muy
pobre, precisamente por la ausencia del virus.
● Las pruebas de cultivo o aislamiento de virus han ido reemplazándose por la detección de
Ag por inmunofluorescencia que son pruebas mucho más rápidas. Algunas de ellas se
realizan directamente en la muestra clínica, por ejemplo los virus respiratorios se pueden
buscar utilizando Ac directamente en el aspirado nasofaríngeo, en las células de la
nasofaringe Victor buscamos los antígenos virales por inmunofluorescencia, para esta
prueba se necesitan los anticuerpos marcados con fluoróforos, se necesita un microscopio
de fluorescencia y es una prueba bastante sensible para hacer ese diagnóstico.

● Inmunofluorescencia directa
Tenemos un anticuerpo que nos va a detectar un antígeno viral, ese anticuerpo está marcado con un
fluoróforo y a esto se le llama conjugado. Cuando se utiliza un solo anticuerpo marcado con un fluoróforo, se
llama una inmunofluorescencia directa.

● Inmunofluorescencia indirecta
También se tiene otra modalidad que es la inmunofluorescencia indirecta, en la cual se utiliza un anticuerpo
primario, que no está marcado con ningún fluoróforo y ese anticuerpo primario va a ser específico por el
antígeno viral que vamos a detectar, este anticuerpo primario se obtiene de un animal inmunizado, por
ejemplo, de un conejo anti virus de influenza, es decir, ese conejo fue inmunizado contra el virus de influenza
y de él se extrajeron los anticuerpos específicos para el virus de influenza; luego se utiliza un segundo
anticuerpo que es específico contra el anticuerpo primario, es decir, para el anticuerpo de conejo, por ejemplo,
se utiliza anticuerpo de cabra, que está marcado con fluoróforo, anti anticuerpo de conejo.

Uno creería que la directa es más sencilla que la indirecta, "¿para qué hacer la prueba con dos anticuerpos, si
uno lo puede hacer de una vez con uno sólo marcado?", sin embargo, en la inmunofluorescencia directa el
anticuerpo marcado puede detectar sólo dos sitios antigénicos, en realidad no son dos sitios antigénicos, si
recordamos inmunología, las regiones complementarias de las inmunoglobulinas en cada región variable hay
tres sitios (regiones hipervariables), por lo tanto, un anticuerpo podría detectar seis sitios antigénicos, pero
para efectos de la clase y de visualización, este anticuerpo marcado puede reconocer dos antígenos; por otro
lado en la inmunofluorescencia indirecta, el anticuerpo primario, como en la directa, reconoce dos antígenos,
pero el anticuerpo marcado con sus regiones variables reconoce dos anticuerpos primarios y otra región
variable puede unirse a otros dos, de esta forma, la inmunofluorescencia indirecta termina detectando cuatro
antígenos, mientras que la directa detecta solo dos.

Ahora, de acuerdo a lo anterior, ¿cuál es más sensible?, la inmunofluorescencia indirecta porque detecta
cuatro sitios antigénicos, es decir, el anticuerpo marcado reconoce dos anticuerpos primarios, donde cada uno
de ellos ha reconocido dos sitios antigénicos, por lo que esta prueba termina reconociendo cuatro sitios
antigénicos, siendo así mucho más sensible que la inmunofluorescencia directa.

Además, la inmunofluorescencia indirecta es mucho más barata que la inmunofluorescencia directa porque si
yo necesito detectar siete antígenos, Luis O estos anticuerpos marcados con fluoróforos son mucho más
caros que los anticuerpos sin marcar. Entonces, lo que se hace es comprar siete anticuerpos sin marcar
obtenidos, por ejemplo, del conejo: uno para influenza, otro para virus respiratorio sincitial, adenovirus, etc.,
para los diferentes virus específicos. Y solo se compra un anticuerpo anti-conejo marcado con el fluoróforo,
que es un Ac cabra anti-conejo. Un fluoróforo sirve para detectar a todos los demás, lo que es mucho más
barato que comprar siete anticuerpos marcados con el fluoróforo.

Por lo tanto, es más sensible y más barato hacer la prueba indirecta de fluorescencia. Por esa prueba se
puede detectar antígenos virales en células, por ejemplo, estas son células del sistema respiratorio y están
marcadas con anticuerpos monoclonal contra el VSR, que es un virus RNA y se replica en el citoplasma y no
en el núcleo: esto en negro es el núcleo y este es el citoplasma, todo lo que ven azul son núcleos que están
teñidos con DAPI, y el citoplasma está todo en verde fluorescente porque allí está el VSR. Esta es un prueba
para detectar influenza; el virus de influenza se replica en el núcleo y se van a ver los núcleos fluorescentes.
Por ejemplo, el citomegalovirus (CMV), le podemos detectar una proteína que se llama p65 que se
detecta directamente en los neutrófilos de las personas infectadas. Aquí se ven los núcleos lobulados
de los neutrófilos, fluoresciendo, porque el CMV se replica en los núcleos de esos neutrófilos,
permitiendo determinar que esa persona tiene neutrófilos infectados por CMV, y la prueba se demora
alrededor de una hora o dos horas.

Hay otra modalidad que es un mezcla entre cultivo y fluorescencia. Que se llama Shell Vial para
antígenos virales de expresión temprana, que se denominan tempranos porque se expresan en las
primeras 24-48 horas posteriores a la infección viral de la célula, es decir, no hay que esperar 10 o
más días a que crezca todo el virus, sino que puede detectar en 12, 24 o 48 horas esos antígenos de
expresión temprana.

La prueba Shell Vial consiste en que tenemos un vial (vaial), en cuyo fondo tenemos una laminilla
redonda de vidrio con una monocapa de células,David O. la cual se va a poner en contacto con la
muestra clínica que se cree tiene el virus, por ejemplo, citomegalovirus. Entonces se coloca la sangre,
orina o LCR y se expone a las células. Si en la muestra clínica hay virus infeccioso, este infectara las
células que antes no estaban infectadas, y después de 24 a 48 horas se realiza una
inmunofluorescencia, para saber si la célula se infectó y ya expresó los antígenos de expresión
temprana. Lo que se observa, es que los núcleos están fluorescentes porque el virus que estaba en la
muestra clínica del paciente, infectó las células y se puede ver que están expresadas las proteínas
tempranas del virus. De esta manera, de 24 a 48 horas, se puede saber si había virus infeccioso en la
muestra clínica o no.
Principio de la prueba Cromatográfica NS1 para dengue

Existen otras pruebas que se llaman pruebas cromatografías rápidas, donde en 15 o 30 minutos
se puede determinar que la muestra clínica tiene un antígeno viral. El ejemplo típico, es la proteína
no estructural NS1 del virus dengue, la cual se puede detectar por esta prueba que se llama el
DUO, la cual detecta, en un lado de la prueba el antígeno y en el otro lado los anticuerpos IgM o
IgG; también hay otra modalidad en la que se usan tiras similares a las de toma de pH, la cual
solo detecta el antígeno NS1 (Antígeno dengue).

La prueba consta de un casete, el cual tienen varios módulos Nathalie T. y aca abajo esta la que
me va a dar negativa y arriba esta la que me va a dar positiva.

1. En la parte de abajo de la prueba está el paño donde vamos a colocar la muestra de suero del
paciente, la cual va a subir por capilaridad a través de una tira.
2. Cuando la muestra empieza a ascender se encuentra primero (en la parte donde esta la primera
raya) anticuerpos con oro coloidal, estos son anticuerpos solubles (que pueden migrar con el
oro coloidal) específicos para el antígeno que se está buscando. Ej: sí lo que se busca es el virus
dengue, los anticuerpos son específicos para la proteína NS1 del virus dengue, que se encuentra
supuestamente en la muestra del paciente.
3. Los anticuerpos con oro coloidal capturan antígeno y migran hasta llegar a la segunda raya,
donde se encuentran otro tipo de anticuerpos, que son fijos (anclados en ese lugar) y estos
anticuerpos anclan el complejo de: antígeno, anticuerpo y el oro coloidal.
 4. El oro coloidal, cuando es anclado en la segunda raya, se pone de color rojo con la luz, y es la
raya roja que se observa de primera, esto solo sucede si había antígeno en el suero del paciente.
5. El sobrante sigue su camino hacia arriba. Lo que sobra básicamente son anticuerpos vacíos (sin
antígeno anclado) con oro coloidal. Estos anticuerpos vacíos se encuentran con una tercera zona
del casete donde hay antianticuerpos contra los anticuerpos de la primera raya, entonces los van
a atrapar y así se forma otra raya de color rojo. Ese es el control, nos asegura que la muestra
que colocamos abajo subió por capilaridad hasta arriba.
a. Si nos diera todo blanco, (Sin que las rayas de la prueba adquieran color) indica que la
muestra que se depositó abajo ni siquiera subió. Y no puede subir porque la tira estaba
seca, entonces la prueba esta negativa, no porque el paciente no tenga antígeno, sino
porque la muestra no subió.
b. Si da negativo pero el control da positivo, quiere decir que la muestra si corrio y subio por
capilaridad, pero el paciente no tiene el antígeno NS1 (que es lo que ocurre en el ejemplo
de abajo). La muestra del paciente no tiene antígeno aca….

Henry C.

…. la muestra del paciente no tiene Ag acá, los Acs con el oro coloidal se quedan vacíos porque
no tienen que atrapar en el suero del paciente, siguen corriendo, aquí no se quedan pegados
porque aquí estos Acs son específicos para el Ag que lleva este complejo y ahora no hay nada, en
la primera figura sí lo habían, entonces no van a atrapar nada por eso no se marca la raya roja y
los Acs continúan y ahora éstos sí los atrapan y aparece la raya roja aquí. En esto consisten las
pruebas cromatográficas, las pruebas de embarazo, las pruebas que buscan Ags se basan en
esta metodología.

Metodología prueba de PCR (Prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Consiste en amplificar y sintetizar invitro un DNA, es decir aumentar el número de copias de un

DNA, pero los virus no siempre son DNA, también los hay RNA y en ese caso se debe hacer una
transcripción reversa para hacer un DNA copia para luego poder realizar la prueba de PCR, ésta
prueba se conoce como RT PCR (Transcripción Reversa de Reacción en Cadena de la
Polimerasa) y consiste en colocar en un tubo todo lo que necesita la enzima polimerasa para
copiar o construir, sintetizar o polimerizar DNA utilizando un molde de DNA que está en la muestra
clínica, en el caso de los virus sería el DNA de un virus, el cual se sintetizará in vitro para hacerlo
detectable, porque está en cantidades mínimas y lo que se busca es amplificarlo para que sea
detectable.

Se debe tener claro qué es lo que se quiere buscar, para que de esa forma se tengan disponibles
primers o secuencias cebadoras específicos. Por ejemplo, si se busca virus VIH, el en proceso se
deben usar primers para VIH, si se busca Citomegalovirus se deben poner primers para
Citomegalovirus para que se pueda amplificar la porción de DNA que se desea y producir muchas
copias para que pueda ser detectable Laura O. es muy sensible esa prueba pero también porque
es tan sensible puede tener desventajas, por ejemplo, en el ambiente de un laboratorio donde
hagan todos los días dengue por PCR están todas las partículas del PCR de la amplificación del
virus dengue, si no se tiene cuidado las muestras de los pacientes se pueden contaminar con el
aire del laboratorio y decir que tiene dengue cuando no es así, por esa sensibilidad (por amplificar
tanto el número de copias), podría convertirse en una prueba que no estaría fidedignamente
mostrando lo que el paciente tiene, hay que tener muchos controles (positivos y negativos para
poder determinar que esa muestra si tiene ese virus) y hacerlo una persona que tenga mucha
experiencia.

La muestra que amplificamos se detecta haciendo una electroforesis en agarosa y se observa un

tamaño de banda que es lo que el observador determinó o amplificó, que se compara con unos
patrones y sabe si es positivo o negativo, en este caso por ejemplo: el virus dengue tiene 4
serotipos, donde cada serotipo tiene un tamaño diferente del amplificado.

De esta prueba hay variaciones entonces tenemos:

PCR en tiempo real: que es una variación de la prueba del PCR convencional, ambos casos
tienen una cinética de amplificación y consiste en que cada vez que yo hago un ciclo de PCR
espero que se duplique la cantidad de DNA que se tiene (que se copie), entonces la fórmula es 2n
, donde 2 y n: son los números de ciclos de amplificación del PCR, teóricamente debería crecer
exponencialmente la cantidad de DNA que se tiene, pero en la vida real no es así; por que en el
tubo donde se está haciendo la prueba los componentes son finitos, se acaban los nucleótidos (
adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T)), la polimerasa, que son los que van a construir
el DNA, por ende el DNA no aumenta así se hagan muchos más ciclos, pues en la vida real el
proceso llega a una fase plato por que se agotan todos los componentes del tubo.

La prueba de PCR en tiempo real además de utilizar primers o cebadores (como la anterior),
utiliza sondas Camilo V. marcadas con fluoróforos (F / reportero).

La sonda está marcada con un fluoróforo en un extremo y en el otro, tiene un apagador (Q /

quencher). La sonda es muy corta (~10 nucleótidos), por lo que estos dos componentes se
encuentran muy cerca, haciendo que el apagador le quite la fluorescencia al fluoróforo. Aún si se
lo ilumina, ”éste se la va a robar”.
Sin embargo, si F y Q están separados, ya sea porque se cortó o se hidrolizó la sonda, al iluminarlo la
fluorescencia se puede detectar.

Esto es lo que sucede en las pruebas de PCR en Tiempo Real (Q-PCR), donde, como se observa en la
imagen, se tienen: 2 primers, la polimerasa (Taq Pol) que está copiando un fragmento de DNA y una sonda
de DNA que se pega en la mitad, con un fluoróforo y un apagador; Cuando la TaqPol detecta la sonda
complementaria al producto de PCR destruye la sonda, puesto que esta enzima no permite la existencia
regiones de doble cadena de DNA, haciendo que se separe el reportero (fluoróforo) del apagador
generando fluorescencia. (Así, cada vez que haya una nueva amplificación, la sonda va a fluorescer).

De esta manera, se puede construir una curva, que tenga:

● En el eje X, el número de ciclos de amplificación (de 0 a 40).
● En el eje Y la fluorescencia.

Así, lo que va a mostrar la curva, es cómo aumenta la fluorescencia a medida que van aumentando la
cantidad de productos de PCR. Esta prueba se realiza en un equipo, por lo que ya no es necesario hacer
una electroforesis y observar las bandas, sino que el mismo dispositivo es el que va mostrando la curva de
amplificación y el punto en el cual, el nivel de “background” sobrepasa al ciclo Ct (ciclo umbral) y ese es
el punto en el cual se puede comparar una muestra con otra y lo que indica es cuál de ellas tiene más
material genético.
Entonces, la muestra que se amplificó o que fue detectable en un ciclo, p.ej: ciclo 22, tiene más muestra para
empezar, que la muestra cuya fluorescencia fue detectable en el ciclo 30, donde se necesitaron 30 ciclos para
poderse detectar; en cambio, la muestra que sólo necesitó 20 ciclos de amplificación para volverse detectable,
indica que tuvo más muestra. Esta es una forma de hacer cuantificable la prueba y Karol. para saber cuál de
todas las muestras tiene más DNA para empezar.

Esto es a lo que se denomina PCR en tiempo real y, a diferencia de una PCR convencional, en donde se
debe esperar todos los 40 ciclos para poder hacer la observación en un gel, en la Q-PCR se observa
cómo aumenta la fluorescencia y cómo una muestra que tenía más DNA, es detectada antes que otra muestra
que tenía menos DNA y que va a ser detectada 5 o 6 ciclos más adelante.

PCR CONVENCIONAL:
Se debe esperar todos los 40 ciclos para la observación en gel. Ejemplo:

- Una muestra que tiene 20 mil copias de DNA y se detecta en el ciclo 24,
- Una muestra que tenía 10 mil copias se detecta un ciclo más adelante,
- Una muestra que tenía 5 mil copias se detecta otro ciclo más adelante,
- Una que tiene 2.5 mil copias se detecta otro ciclo más adelante.
 Y así sucesivamente. Eso es lo que la hace cuantificable y de esta manera se mide el número de
copias de los virus que hay en muestras de sangre, en orina, en LCR.

En síntesis, la PCR en tiempo real sirve para cuantificar la cantidad de virus que yo tengo en una
muestra clínica, utilizando la anterior metodología. La PCR convencional (que es utilizando el gel) solamente
dice sí esta positiva o negativa, dependiendo si se ve o no la banda. La de PCR en tiempo real en cambio,
dice si está positiva y además cuántas copias se tiene.

VENTAJAS
- El PCR se lo puede hacer de 5 a 10 horas,
- Detecta casos negativos por serología,
- El Q-PCR es cuantitativo, detecta un bajo número de copias .

DESVENTAJAS
● Las pruebas son muy costosas porque los reactivos son importados,
● Además se exige un personal altamente entrenado, que las pueda hacer y que no contamine.
● Hay que tener muchos controles, puesto que sí yo voy a detectar una muestra como mínimo se
debe tener 4 controles positivos o negativos, lo que encarece la prueba.