5.

1 Extracción de proteínas de las células

Purificación de las proteínas
y técnicas de caracterización
CAPITULO 5
Biochemistry 6th Edition Campbell and
Farrell
 Extracción de la fuente
 Homogenización
 Remoción de impurezas
 Fraccionar la proteína
 Almacenamiento

Extracción, purificación y Diferenciación por centrifugación

caracterización de las proteínas Figura 5.1

5.2 Cromatografía de columna

 Fases
 Estacionaria
 Móvil
 Tipos
 Exclusión o de gel
 Afinidad
 Intercambio de iones

1
 CROMATOGRAFIA DE GEL O EXCLUSION

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Intercambio de iones

5.3 ELECTROFORESIS
 Definición
 Tipos
 Agarosa
 SDS-PAGE
 Isoelectric focusing
 Se basa en los diferentes puntos isoeléctricos. Según
la proteína migra se encuentra diferentes pH y la
carga de la proteína va cambiando. Cada proteína se
detiene en su punto isoeléctrico.

2
Figura 5.13 5.4 Determinación estructura primaria
 Pasos:
 Determinar la composición y la cantidad de
amino ácidos.
Electroforesis en dos  Determinar el N-terminal y el C-terminal.
dimensiones
 Determinar la secuencia de la cadena.

Pasos para secuenciar una proteína

 Determinación de la composición de amino
ácidos: tipos y cantidades.
 Identificación del N-terminal
 Método de Sanger: FDNB
 Método de Cloruro de Dansilo
 Degradación Edman: PITC
 Aminopeptidasas

DEGRADACION EDMAN

3
Pasos para secuenciar una proteína
 Rompimiento puentes de azufre: oxidación
(ácido perfórmico) o reducción (ditioeritriol o
-mercaptoetanol).

Pasos para secuenciar una proteína

 Identificación C-terminal:
 Hidrazina
 Borohidruro de litio
 Carboxipeptidasas

IDENTIFICACION C-TERMINAL
Pasos para secuenciar una proteína
 Para determinar la composición de la
cadena:
 Hidrólisis completa
 Hidrólisis parcial:
 tripsina: Lys, Arg (C)
 quimotripsina: Phe, Tyr, Trp (C)
 pepsina: Phe, Tyr, Trp (N)
 bromuro cianuro: Met (C)

4
HIDROLISIS COMPLETA