Comparación de la reticulación del colágeno corneal

(PACK ‐ CXL) y los tratamientos con voriconazol en

queratitis fúngica experimental

Objetivo
Comparar la eficacia antifúngica de la reticulación del colágeno corneal con riboflavina
fotoactivada (PACK-CXL) y voriconazol en modelos experimentales de queratitis por Fusarium
solani y Candida albicans .

Métodos
64 córneas de 32 conejos de Nueva Zelanda fueron incluidas y divididas en dos grupos
principales. Se realizó una inyección intraestromal
de las suspensiones de Fusarium y Candida , y se observó que la queratitis se formó al tercer
día. Ambos grupos se separaron al azar en los siguientes cuatro grupos: control, PACK-CXL,
voriconazol y PACK-CXL combinados con voriconazol. PACK ‐ CXL se aplicó usando
riboflavina al 0,25% en un protocolo de Dresden acelerado (dosis total de ultravioleta A 5,4 J /
cm²). El voriconazol se aplicó tópicamente como 7x1 / día con una dosis del 1% (10 mg /
ml). Los botones corneales se extirparon el décimo día y se realizaron exámenes
microbiológicos y patológicos.

Resultados
El PACK-CXL y el PACK-CXL combinados con grupos de voriconazol tenían cada uno 100
unidades formadoras de colonias (UFC / ml) de microorganismos reproducidos en
comparación con 500 UFC / ml en el grupo de voriconazol y 1500 UFC / ml en el grupo de
control (p <0.001) en el modelo de queratitis por Fusarium . El grupo PACK-CXL combinado
con voriconazol tenía 100 UFC / ml, el grupo PACK-CXL tenía 150 UFC / ml y el grupo
voriconazol tenía 200 UFC / ml de microorganismos reproducidos en comparación con 4000
UFC / ml en el grupo control ( p <0.002) en el modelo de queratitis por Candida . (p
<0,001). Se observaron menos hifas y cambios estromales inespecíficos en las secciones
transversales patológicas examinadas en subgrupos que usaron CXL.

Conclusión
Hubo menos reproducción de hongos y una puntuación de queratitis más baja para Fusarium
solani y Candida albicans en los grupos de tratamiento en comparación con los grupos de
control, especialmente en los grupos que usaron PACK ‐ CXL. Estos resultados sugieren que
es útil combinar el tratamiento con PACK-CXL con el tratamiento médico en el algoritmo de
queratitis micótica en la etapa temprana de la enfermedad.

Introducción
La queratitis micótica constituye una causa importante de ceguera tanto en países
desarrollados como en desarrollo (Ou y Acharya 2007 ). Los estudios clínicos muestran
que Fusarium y Aspergillus (ambos mohos) y Candida (una levadura) son los organismos
más comunes que causan queratitis micótica (Kalkanci y Ozdek 2011 ). Aunque el
tratamiento de la queratitis fúngica es difícil y costoso, hay casos en los que la perforación
corneal o la endoftalmitis no se pueden prevenir a pesar de que se proporcione un
tratamiento óptimo (Richoz et al. 2014 ). El tratamiento médico se elige principalmente
empíricamente. El tratamiento quirúrgico se aplica a pacientes que ya tienen o están a punto
de tener perforación corneal.

El efecto positivo de la combinación de riboflavina y ultravioleta A (UVA) sobre las

infecciones corneales se mostró en 2008, por primera vez, por Iseli et al. ( 2008 ) en cinco
pacientes con queratitis resistente al tratamiento conservador. Los estudios retrospectivos y
prospectivos sobre la queratitis humana mostraron que la reticulación del colágeno corneal
(CXL) puede tener un papel importante en el tratamiento de la queratitis microbiana
(Vazirani y Vaddavalli 2013 ; Khater et al. 2014 ; Said et al. 2014 ; Shetty et al. 2014 )
. Más tarde, hubo muchas publicaciones que muestran que CXL puede ser eficaz en el
tratamiento de la queratitis según muchos informes de casos (Alio et al. 2013) En Alio et
al. artículo, 'Cromóforo fotoactivado para la queratitis infecciosa', se sugirió por primera
vez la terminología de la reticulación del colágeno corneal (PACK-CXL), y la terminología
se aceptó más tarde en el Noveno Congreso Internacional Anual de Cruce de Corneales en
Dublín en 2013 (Hafezi & Randleman 2014 )

El número de estudios aleatorios controlados in vitro e in vivo es limitado para PACK ‐

CXL. Aunque se demostró que PACK ‐ CXL en los estudios era efectivo contra factores
bacterianos in vitro e in vivo , hubo resultados contradictorios cuando se usó PACK ‐ CXL
contra factores fúngicos (Martins et al. 2008 ; Makdoumi et al. 2010 ; Sauer et al. 2010 ;
Galperin et al. 2012 ). También hay publicaciones que detallan que el tratamiento con
PACK-CXL aplicado a cepas de hongos in vitro no tiene un efecto fungicida satisfactorio
(Martins et al. 2008) Esta falta de eficacia puede explicarse por la inadecuación de los
parámetros en el tratamiento con PACK ‐ CXL para los factores fúngicos. Además, en
el estudio in vitro realizado por Bilgihan et al., Se usaron concentraciones de riboflavina al
0.1% y 0.25% durante el tratamiento con PACK ‐ CXL y mostraron que el tratamiento con
PACK ‐ CXL combinado con una concentración de riboflavina al 0.25% tenía una tasa
fungicida más alta ( Bilgihan et al. 2016 ). No se dispone de estudios experimentales
previos adicionales en animales que comparen el efecto del tratamiento con PACK-CXL y
el tratamiento antifúngico en la queratitis micótica.
El objetivo de nuestro estudio fue investigar la eficacia del tratamiento con PACK-CXL
con una concentración de riboflavina al 0.25% y comparar con el tratamiento tópico con
voriconazol en modelos de queratitis por Fusarium solani y Candida albicans formados
experimentalmente en ojos de conejo basados en análisis clínicos, microbiológicos y
patológicos.

Materiales y métodos
Este estudio fue aprobado por la Junta Ética Local de Experimentos con Animales (G.Ü.ET
‐ 15.039) en la Universidad de Gazi (Ankara, Turquía). El estudio se realizó en el Centro de
Investigación Experimental y de Crianza de Animales del Laboratorio de la Universidad de
Gazi y en el Departamento de Enfermedades de los Ojos.

En el estudio se utilizaron treinta y dos conejos adultos de Nueva Zelanda con un peso de
2.5 a 3 kg cada uno. Ambos ojos de todos los conejos fueron incluidos en el estudio. Las
operaciones se realizaron bajo anestesia general usando ketamina intramuscular y
xilazina. Se aplicó proparacaína HCl tópica al 0,5% (Alcaine; Alcon Pharmaceuticals Ltd.,
Puurs, Bélgica) antes de cada operación. Los conejos se dividieron en dos grupos (grupo 1
para Fusarium solani y grupo 2 para Candida albicans ). Suspensiones fúngicas con una
concentración de 10 5 unidades formadoras de colonias (UFC / ml) (de Fusarium
solani y Candida albicanscepas preparadas por el Departamento de Microbiología de la
Universidad de Gazi y adquiridas de pacientes con queratitis humana en su clínica) se
inyectaron intraestromalmente en la córnea en ambos ojos de los conejos con una dosis de
0.1 ml. En el examen del tercer día, se observó la formación de queratitis en todas las
córneas de conejo. Se aislaron agentes fúngicos a partir de muestras de raspado corneal de
casos de queratitis clínicamente sospechosos. Tanto F. solani como C. albicans se
identificaron morfológicamente. La morfología de la colonia y la morfología de los
conidios se utilizaron para la identificación de F. solani . Para la identificación de C.
albicans se utilizaron perfiles de positividad de prueba de tubo de germen y asimilación de
carbohidratos .

Ambos modelos de queratitis (grupo 1 para el modelo de queratitis por Fusarium y el grupo
2 para el modelo de queratitis por Candida ) se dividieron en cuatro subgrupos, cada grupo
con ocho ojos. Los primeros subgrupos (grupos 1A y 2A) se seleccionaron como grupos de
control y no se administró tratamiento. Los otros subgrupos fueron PACK-CXL (grupos 1B
y 2B), voriconazol (grupos 1C y 2C) y PACK-CXL combinados con grupos de voriconazol
(grupos 1D y 2D). El tratamiento con PACK-CXL se realizó al tercer día para los grupos
1B, 1D, 2B y 2D. El tratamiento tópico con gotas de voriconazol al 1% (10 mg / ml) 7x1 /
día entre el tercer y décimo día se aplicó a los ojos en los grupos 1C, 1D, 2C y 2D.

Se usó riboflavina a una concentración de 0.25% para PACK ‐ CXL. Al aplicar riboflavina
a una concentración de 0,25% una vez cada 5 min durante 30 min, se proporcionó
penetración de riboflavina en la córnea. La luz ultravioleta A (UVA) de longitud de onda de
365 nm (CCL-Vario; Peschke Meditrade GmbH, Hünenberg, Suiza) se calibró a 9 mW /
cm 2 y se aplicó a la córnea desde una distancia de 10 mm durante 10 min. La dosis total fue
de 5,4 J / cm 2 con este procedimiento de irradiación.

El tercer día (antes del tratamiento con PACK ‐ CXL) y el décimo día (el séptimo día
después del tratamiento con PACK ‐ CXL) después de la inyección intraestromal de la cepa
fúngica, se realizó el examen biomicroscópico en todos los ojos de conejo después de la
anestesia descrita anteriormente. La inyección intraestromal, los hallazgos del examen del
tercer y décimo día de todos los ojos se registraron con imágenes tomadas con una cámara
de microscopio. El grado de queratitis se evaluó modificando la escala desarrollada por
Schreiber et al. ( 2003) La opacidad corneal, la neovascularización corneal (NV), la
hiperemia conjuntival, el infiltrado corneal y el grado de hipopion se evaluaron con esta
escala. La turbidez corneal se calificó como sigue: sin edema, 0; edema menor, 1; edema
corneal en dos cuadrantes, 2; y edema corneal total, 3. Corneal NV se calificó como 0,
córnea clara; 1, NV hasta 2 mm del limbo; 2, NV a más de 2 mm del limbo; y 3, NV que
avanzó al centro de la córnea. La hiperemia conjuntival se calificó de la siguiente manera:
sin hiperemia, 0; hiperemia leve, 1; hiperemia moderada, 2; e hiperemia severa, 3. El nivel
de hipopion y el tamaño del diámetro del infiltrado corneal se midieron en
milímetros. Usando estos criterios, las puntuaciones de queratitis fueron calculadas por un
examinador (HBO).

Al final del estudio, en cada subgrupo, se extirparon botones corneales del limbo y se
entregaron siete botones corneales al Departamento de Microbiología de la Universidad de
Gazi para el cultivo. Los botones corneales se cultivaron en condiciones estériles. Las
muestras de córnea se cultivaron en agar dextrosa Sabouraud, agar sangre y placas de agar
lactosa sacarosa azul de metileno y eosina, y las colonias reproducidas se siguieron en el
laboratorio de microbiología. Se registró el número de colonias. Las colonias reproducidas
fueron redefinidas y nombradas como Candida albicans y Fusarium solani .

Uno de los botones corneales en cada subgrupo fue entregado al Departamento de Patología
de la Universidad de Gazi para su examen patológico. Cuatro- μSe tomaron secciones
transversales de tejido de espesor m (detectadas con 10% de formaldehído) en portaobjetos
con carga positiva. La tinción se realizó en un dispositivo Ventana Benchmark Special
Stain BSS (F. Hoffmann ‐ La Roche AG, Basilea, Suiza) utilizando kits de tinción
instantánea PAS, Giemsa y hematoxilina y eosina. El examen fue realizado por dos
patólogos (PUG, BO), y se evaluaron tres parámetros principales: inflamación, edema
estromal y densidad de levaduras / hifas. La inflamación se clasificó de la siguiente manera:
densidad de células inflamatorias inferior al 25% del grosor corneal, baja; densidad de
células inflamatorias entre 25% y 50% del grosor corneal, moderada; y densidad de células
inflamatorias más del 50% del grosor corneal, intenso. El edema estromal se clasificó de la
siguiente manera: edema inferior al 25% del grosor corneal, bajo; edema entre 25% y 50%
del grosor corneal, moderado; y edema de más del 50% del grosor corneal, intenso. La
densidad de levadura / hifas se calificó de la siguiente manera: no se observaron levaduras /
hifas, ninguna; levadura / hifas vistas pero sin formación de masa, baja; se observa
formación de masa de levadura / hifas pero menos del 25% del grosor corneal, moderada; y
se observa formación de masa de levadura / hifas pero más del 25% del grosor corneal,
intenso.

Los datos se analizaron con IBM SPSS Statistics 17.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, EE.
UU.). Las estadísticas descriptivas se mostraron como la mediana (mínimo - máximo) para
variables numéricas y graduables constantes. La importancia de la diferencia de valores
medianos entre los subgrupos se examinó con Mann-Whitney Uprueba cuando había dos
subgrupos independientes y con la prueba de Kruskal-Wallis para más de dos subgrupos
independientes. La prueba de rango con signo de Wilcoxon se usó para examinar si había
una diferencia estadísticamente significativa entre las puntuaciones de Schreiber del tercer
y décimo día entre los subgrupos. A menos que se indique lo contrario, los resultados en p
<0.05 fueron aceptados como estadísticamente significativos. Sin embargo, la corrección de
Bonferroni se realizó para poder controlar los errores de Tipo I en todas las comparaciones
múltiples posibles.
Resultados
Hallazgos biomicroscópicos
No se observaron diferencias estadísticamente significativas en los puntajes de Schreiber
modificados promedio entre el tercer día y el décimo día entre los subgrupos en ambos
ensayos de queratitis de acuerdo con la corrección de Bonferroni (p> 0.00625)
(Tabla 1 ). El puntaje Schreiber modificado promedio fue menor en los grupos 1B, 1C y
1D en comparación con el grupo 1A y fue estadísticamente significativo (p <0.006)
(Tabla 2 ). El puntaje de Schreiber modificado promedio fue significativamente menor en
el grupo 2B, el grupo 2C y el grupo 3D en comparación con el grupo 2A (p <0.002).

Tabla 1. Puntuaciones de Scheiber modificadas en el tercer y décimo día entre subgrupos

 Las estadísticas descriptivas se muestran como la mediana (mínimo - máximo). La prueba utilizada
para el análisis estadístico entre grupos en los modelos de queratitis por Fusarium solani y Candida
albicans fue la prueba de Kruskal-Wallis con una corrección de Bonferroni, y los resultados con p
<0.0125 fueron aceptados como estadísticamente significativos. La puntuación de Schreiber
modificada fue significativamente menor en los grupos de tratamiento en comparación con el
grupo de control en ambos modelos de queratitis.

Hallazgos microbiológicos
Hubo una diferencia estadísticamente significativa en los recuentos de CFU medias entre
los subgrupos en el Fusarium queratitis modelo (p <0,001), y. La mediana corneal CFU
recuento disminuido en los grupos 1B, 1C y 1D en comparación con 1A grupo (p <0,001),
Fig 1 . Se encontraron recuentos de UFC más bajos en el grupo 1B y en el grupo 1D en
comparación con el grupo 1C (p <0.001) (Tabla 3 ).

Tabla 3. Recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) (UFC / ml) de microorganismos

según los grupos
 Las estadísticas descriptivas se muestran como la mediana (mínimo - máximo). Para las
comparaciones realizadas entre Fusarium solani y Candida albicans entre los grupos, los
resultados con p <0.0125 fueron aceptados como estadísticamente significativos según
la prueba U de Mann-Whitney y la corrección de Bonferroni. Los recuentos de UFC fueron
significativamente menores en los grupos de tratamiento, especialmente en los grupos con
PACK ‐ CXL, en comparación con los grupos de control en ambos modelos de queratitis.

Hubo una diferencia estadísticamente significativa en los recuentos medios de UFC entre
los subgrupos en el modelo de queratitis por Candida (p = 0.002), y el recuento medio de
UFC corneal disminuyó en los grupos 2B, 2C y 2D en comparación con el grupo 2A (p
<0.001) (Tabla 3 ) . Se encontraron recuentos de UFC más bajos en el grupo 2B y el grupo
2D en comparación con el grupo 2C (p = 0.009 y p = 0.002).

Hallazgos patológicos
Los resultados del examen patológico se muestran en la Tabla 4 (Figs. 2 y 3 ). Cuando se
compararon estos resultados con el grupo de control, se observó que la inflamación y el
edema estromal habían disminuido levemente en todos los subgrupos. También se observó
que la relación de disminución de levadura e hifas fue mayor en los subgrupos aplicados
con PACK-CXL (grupos 1B, 1D, 2B y 2C) en comparación con los grupos en los que solo
se aplicó el tratamiento con voriconazol.

Tabla 4. Resultados del examen patológico.

La inflamación se clasificó de la siguiente manera: densidad de células inflamatorias

inferior al 25% del grosor corneal, baja; densidad de células inflamatorias entre 25% y
50% del grosor corneal, moderada; y densidad de células inflamatorias más del 50% del
grosor corneal, intenso. El edema estromal se clasificó de la siguiente manera: edema
inferior al 25% del grosor corneal, bajo; edema entre 25% y 50% del grosor corneal,
moderado; y edema de más del 50% del grosor corneal, intenso. La densidad de levadura
/ hifas se calificó de la siguiente manera: no se observaron levaduras / hifas,
ninguna; levadura / hifas vistas pero sin formación de masa, baja; se observa formación
de masa de levadura / hifas pero menos del 25% del grosor corneal, moderada; y se
observa formación de masa de levadura / hifas pero más del 25% del grosor corneal,
intenso.
Las secciones transversales patológicas del grupo experimental en el que se formó la
queratitis por Fusarium solani están disponibles en la figura. (A) Grupo 1A para el grupo
control de F. solani - H&E × 40, (B) Grupo 1B para el grupo PACK ‐ CXL de F. solani -
H&E × 200, (C) Grupo 1C para el grupo voriconazol de F. solani - H&E × 100, (D) Grupo
1D para el PACK ‐ CXL combinado con el grupo voriconazol de F. solani - H&E × 40.

Las secciones transversales patológicas del grupo experimental en el que se formó la

queratitis por Fusarium solani están disponibles en la figura. (A) Grupo 1A para el grupo
control de F. solani - H&E × 40, (B) Grupo 1B para el grupo PACK ‐ CXL de F. solani -
H&E × 200, (C) Grupo 1C para el grupo voriconazol de F. solani - H&E × 100, (D) Grupo
1D para el PACK ‐ CXL combinado con el grupo voriconazol de F. solani - H&E × 40.

figura 3
Abrir en el visor de figuras PowerPoint
Las secciones transversales patológicas del grupo experimental en el que se formó la
queratitis por Candida albicans están disponibles en la figura. (A) Grupo 2A para el grupo
control de C. albicans - H&E × 100, (B) Grupo 2B para el grupo PACK ‐ CXL de C. albicans -
H&E × 100, (C) Grupo 2C para el grupo voriconazol de C. albicans - H&E, × 40, (D) Grupo 2D
para el PACK ‐ CXL combinado con el grupo voriconazol de C. albicans - H&E × 40.
Discusión
La queratitis micótica es una causa importante de morbilidad debido a la dificultad
del tratamiento, la frecuencia de los diagnósticos tardíos y la progresión a pesar
del tratamiento. Fusarium y Aspergillus son los mohos, y Candida son las
levaduras que más comúnmente causan queratitis micótica (Kalkanci y
Ozdek 2011 ). Por lo tanto, en nuestro estudio, se formó queratitis experimental
con hongos Fusarium solani y Candida albicans y se compararon los grupos de
tratamiento. El voriconazol se seleccionó para su uso en nuestro estudio debido a
su alta penetración corneal cuando se administra por vía tópica y su éxito en el
tratamiento de la queratitis micótica en los últimos años (Hariprasad et
al. 2008) Se encontró que PACK-CXL combinado con una concentración de
riboflavina al 0.25% tenía un alto efecto fungicida en 10 4 UFC / ml y contra
concentraciones fúngicas más bajas, y se observó que el efecto fungicida de
PACK-CXL con una concentración de riboflavina al 0.1% tenía una menor efecto
fungicida (Bilgihan et al. 2016 ). Por esta razón, las soluciones que contienen una
concentración de riboflavina 0,25% fueron utilizados en nuestro estudio cuando se
aplica PACK-CXL, y un total de 5,4 J / cm 2 se aplicó UVA como estándar.

En nuestro estudio, encontramos que PACK ‐ CXL es tan efectivo como el

voriconazol en la disminución de los recuentos de UFC por hongos en los modelos
de queratitis por Fusarium solani y Candida albicans . Además, PACK ‐ CXL tiene
un efecto sinérgico con voriconazol en el recuento de UFC, exhibiendo una
disminución en comparación con los grupos tratados solo con PACK ‐
CXL. Además, los resultados del examen microscópico y los resultados
patológicos mostraron que las características clínicas no mejoran a medida que
disminuyen los recuentos de hongos.

El número de estudios publicados in vivo en animales que investigan el efecto de

PACK ‐ CXL es bajo. Cosar y col. ( 2015 ) informaron que la eficacia de PACK ‐
CXL no fue satisfactoria en la queratitis por Pseudomonas por sí sola, pero tuvo un
efecto sinérgico con el tratamiento tópico con moxifloxacina. Tal y
col. Clínicamente comparado PACK-CXL tratamiento y la cantidad de disminución
en las dimensiones de la úlcera. La duración de recuperación más corta se
observó en el grupo PACK ‐ CXL en este estudio (Tal et al. 2015 ). Galperin et al.
Realizaron el único estudio in vivo en animales que investigó el efecto de PACK ‐
CXL sobre la queratitis micótica. ( 2012 ) en experimental F. solaniQueratitis
formada en conejos. El grupo control se comparó con un grupo PACK ‐ CXL en
este estudio, y la reproducción del cultivo y las puntuaciones clínicas fueron más
bajas en el grupo PACK ‐ CXL.

El tratamiento con PACK-CXL, cuando se usa solo o combinado con voriconazol,

parece ser efectivo en los modelos de queratitis por F. solani y C. albicans . La
baja disminución de la inflamación nos hace suponer que, aunque las formaciones
de levadura e hifas disminuyen en el período temprano, la regresión de la
inflamación lleva más tiempo. La solución de riboflavina a una concentración de
0.1% se usó con PACK ‐ CXL en otros estudios, y se usó 0.25% en nuestro
estudio. El aumento de las tasas de fungicidas en nuestro estudio nos hizo
considerar que el aumento de la concentración de riboflavina aumentó la eficiencia
de PACK ‐ CXL, como lo respaldan los estudios in vitro previos.

Cuando se examinan estudios clínicos de casos grandes y series de casos sobre

PACK ‐ CXL, se observa que la eficacia de este tratamiento es mayor en la
queratitis bacteriana y que las complicaciones de la queratitis ocurren con mayor
frecuencia en la queratitis micótica (Price et al. 2012 ; Said et al. 2014 ;. Shetty et
al 2014 ; Uddaraju et al. 2015 ). Se cree que el efecto de PACK ‐ CXL disminuye
con la ulceración del estroma profundo y el tratamiento tardío. Comenzamos el
tratamiento al tercer día, y considerando estudios clínicos y de laboratorio previos,
nuestro estudio confirma que la eficacia del tratamiento con PACK-CXL es mayor
en el período temprano cuando el diagnóstico de queratitis ulcerosa es seguro.

Este estudio nos hizo considerar que PACK ‐ CXL puede proporcionar un efecto
antifúngico satisfactorio a pesar de las opiniones que afirman que PACK ‐ CXL es
menos exitoso en la queratitis micótica. Se consideró apropiada la inclusión del
tratamiento con PACK ‐ CXL en el algoritmo de tratamiento de la queratitis
micótica, especialmente en combinación con medicamentos antimicóticos y
aplicado en una fase temprana. Además, aumentar la concentración de riboflavina
en PACK ‐ CXL puede mejorar el efecto antimicrobiano. Este estudio puede liderar
el camino para estudios aleatorios prospectivos adicionales con PACK ‐ CXL
fortalecido.