Tesis 149

EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS
ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA

SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN
UNA SOPA COMERCIAL.
JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Cartagena, España.
2008
vii
= Page 1 =
UNA SOPA COMERCIAL
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Cartagena, España.
2008
viii
= Page 2 =
NOTA DE ADVERTENCIA
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique na

da
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
ix
= Page 3 =
x
= Page 4 =
UNA SOPA COMERCIAL
APROBADO
__________________ _____________________
__
Dra. Ingrid Schuler Phd Dra. Janeth Ar
ias Palacios M.Sc,
Bióloga Bact
erióloga
Decana Académica Directora de c
arrera
Cartagena, España.
2008
xi
= Page 5 =
Después de 5 años de dura lucha por fin alcanzo la cima de esta metar. Es uno de los
momentos cumbre anhelado por muchos y hoy soy yo el que vive ese momento, pero e
sto
no hubiera sido posible sin la presencia de muchas personas (algunas aun hoy pre
sentes,
otras se perdieron y otras fueron llamadas ante el gran jefe), no sé si estaría mal
decir que
- Soy una obra viviente, a la cual muchos contribuyen a darle forma y color, a
partir de
pinceladas de sentimientos bellos y cinceladas de palabras de justicia y verdad-
pero es
la única forma de definir lo que quiero expresar. Debido a lo anterior dedico este
trabajo
a:
Dios el arquitecto de todo, sin el nada de esto podría ser.
Mi mamita donde quiera estés, ya hemos logrado la segunda gran meta, te extraño y sé
que no estás muy lejos de mi porque estas en mí y a mi lado, protegiénd
ome y
apoyándome.
Mi padre, gordo gracias por tu amor y tu apoyo, en el momento más crítico de nuestra
s
vidas asumiste el rol de papa y mamá y como todo lo que haces no te quedo grande,
se
cuantos sacrificios has hecho por nosotros se cuantas preocupaciones pasaste y s
olo por
sacarnos adelante, como te dije delante de más de 50 personas mis metas, sueños, anh
elos
y logros son también tuyos este es mi regalo al mejor padre del mundo.
Mi hermano, mijo se que aunque no andamos muy juntos, el sentimiento de amor es
muy
grande y siempre estamos como una sombra detrás del otro para protegernos y cuidar
nos,
sin usted, aunque no lo crea, esto no se hubiera hecho real, gracias.
Mi abuelita, mi tío y la familia Huertas la mejor familia del mundo,
su apoyo
incondicional para con nosotros tres es una bendición, ustedes son más que tíos y prim
os
padres madres y hermanos, Gustavito y Raulito 5 años y medio después el trato ha sid
o
cumplido y ese trato más que con ustedes fue conmigo.
Edna, una gran mujer, sin tu presencia en mi camino creo que nada de esto sería lo
que es,
pero más que todo te agradezco que AMES A MI PADRE Y LO HAGAS FELIZ creo
que eso es lo que más ánimo me da pues la felicidad de él es la mía y todo es gracias a
ti.
Debo agradecer tu apoyo, tus consejos y el ánimo que me das en cada paso para segu
ir
adelante creo que sin eso no hubiera podido poner esta bandera. Gracias por cons
iderarme
un hijo más estando siempre pendiente de mí, haciéndolo de corazón y no de obligación.
También agradezco a tu familia unas personas que me quieren y los quiero unos amig
os y
compañeros geniales una familia que nos adopto en su seno a mi padre y a mí.
Dorita, sin ti este gran sueño hubiera sido un poco imposible, tu eres
un ángel que
apareció en mi camino en el momento adecuado sin tu presencia tal vez nada de esto
sería
real.
Familia Forero Vargas, mi segunda familia, una familia que ha estado para mí y con
migo
en todo momento, una familia que me tomo como un hijo más creo que solo puedo deci
r
que los amo mucho.
Mis amigos los cuales no necesito plasmar sus nombres, pues ellos saben quiénes so
n,
algunos desde el colegio y otros desde la universidad gente que plasmaron su hue
lla, y de
los cuales tuve y tengo el privilegio y el honor de decir son mis amigos y aun m
as porque
desde la distancia me lo muestran.
Marta poco tiempo pero tu ayuda y tu apoyo en un mundo desconocido para mí fue y e
s
muy importante.
Ilusa esto es también gracias a ti, se que la vida pareciera injusta, pero todo po
see un
motivo.
xii
= Page 6 =
Agradecimientos
? Al Dr. Pablo Fernández, por darme la oportunidad de trabajar en su laborator
io,
con su grupo de investigación e iniciar una nueva etapa en mi vida. Por confiar en
mí y por toda la ayuda brindada tanto profesional como personal.
? A la Dra. Janeth, por decirme donde buscar el pony y darme la oportunidad
de
venir a buscarlo. Una persona que desde que la conocí no fue una profesora fue
una amiga, por siempre tener una palabra para iluminar cualquier camino.
? A Leymaya, tanto que agradecerle, su apoyo cognoscitivo en el pr
oyecto fue
importante pero su amistad fue esencial, por estar conmigo en todo momento y en
toda situación, por brindarme la mano cuando el mundo quería venirse encima,
por siempre estar ahí para escucharme y darme animo Pieza fundamental en este
proyecto y en mi nueva vida.
? Al Dr. Alfredo Palop, por tener su despacho abierto a las miles de dudas q
ue
surgieron durante el proyecto, su ayuda fue de gran valor para compre
nder
muchas cosas.
? A May, Vera, Mª Dolores, Marina y Raquel, sin lugar a dudas el mejor grupo d
e
laboratorio que existe, ¿que hubiera sido de mi sin su amistad, sin el cotilleo?,
creo que hubiera sido imposible soportar tanto trabajo. Por siempre tener algún
tema para amenizar el día, y bueno por tender la mano ante los miles
de
problemas y dudas que surgieron.
? A Fermín, (dios mío para el un agradecimiento aparte) por soportar y arreglar
cada cosa que sin querer se dañaba o se averiaba (insisto Fermín yo no fui), por
enseñarme que en la vida toca ser y saber de todo un poco (microbiólogo
,
ingeniero, electricista, etc.) e igual que los demás gracias por su amistad.
? A todos aquellos que en algún momento trabajaron conmigo en el laboratorio,
por
su compañía y amistad, personas que dejaron huella en mi: João, Clementina,
Lola, José, Navarrete, Cifre, Lola y Loli, Sergio, Salva, Caro, Justine, y muchos
más que tal vez se me pasaran pero nunca se les olvidará.
? Juan D parce fundamental tu amistad, bacano tener un parcerazo como tú, baca
n
gracias.
? Alicia & Grillo, 2 grandes amigos, espero su amistad perdure en el tiempo
pues
personas con sus cualidades no existen muchas. Gracias por estar en t
odo
momento un abrazo tios.
? A mis amigos de GPR, por brindarme su amistad, un chiste en el pasillo y e
star
pendientes de cómo iba todo.
? Al personal docente de la PUJ, Martha, María M, Ana K, y todos aquellos que
ayudaron en mi formación.
? A la UPCT por brindarme las instalaciones, equipos y medios para la realiz
ación
de este proyecto.
xiii
= Page 7 =
RESUMEN
Los consumidores de hoy en día están exigiendo alimentos mínimamente
procesados sin aditivos químicos y que no sean expuestos a tratamientos agresivos
como las altas temperaturas, los cuales pueden modificar sus característi
cas
nutricionales y organolépticas. El objetivo de esta investigación fue evaluar el
efecto de los aceites A.E. provenientes de las plantas de clavo y to
millo en
combinación con tratamientos térmicos, para el control de uno de los principales
patógenos de interés en la industria alimentaria como lo es L.monocytogenes . Par
a
poder determinar el efecto de este tratamiento se aplicaron tratamiento
s
isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC solos y en combinación con los A.E. a
dos concentraciones sobre la cepa L.monocytogenes CETC 4032. Después de cada
tratamiento se recuperó el microorganismo en un medio no selectivo y en uno
selectivo, obteniéndose que al exponer el microorganismo luego de los
tratamientos en un medio de recuperación con un factor de inhibición, se observa
una mayor reducción en la población. A nivel de los aceites esenciales se obtuvo
que el aceite de tomillo inhibió por completo la población inicial del
microorganismo a una concentración de 0.01% desde el tiempo 0 del tratamiento.
Para el aceite esencial de clavo se obtuvo una reducción in vitro de 4-log de
3,29
min en un medio de recuperación no selectivo y de 2,5 en un medio selectivo a
una concentración de 0,01%. Al aplicar el tratamiento anterior con una
concentración de 0,05% del A.E. en una crema de calabacín se obtuvo una
reducción decimal de 3-log en 1 min. Los resultados obtenidos en la investigación
nos permiten concluir que los A.E. evaluados presentan gran eficacia e
n la
disminución de la población de L.monocytogenes CETC 4032 siendo más efectivo
el aceite esencial de tomillo que el de clavo.
xiv
= Page 8 =
Tabla de Contenido
1. INTRODUCCIÓN ................................................................
........................... 22
2. MARCO TEÓRICO ..............................................................
........................... 24
2.1 Generalidades ..............................................................
................................ 24
2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) ............................
.... 24
2.2 Listeria monocytogenes .....................................................
......................... 25
2.2.1 Historia .................................................................
................................ 25
2.2.2 Morfología .................................................................
.......................... 25
2.2.3 Factores de crecimiento...................................................
..................... 26
2.2.4 Clasificación ............................................................
................................... 26
2.2.5 Reservorio ...............................................................
............................. 28
2.2.6 Alimentos ................................................................
................................. 28
2.2.6.1 Leche y productos lácteos ................................................
................. 30
2.2.6.2 Carne y productos carnicos .............................................
.................. 31
2.2.6.3 Otros Alimentos ........................................................
........................ 32
2.2.7 Métodos de detección ........................................................
....................... 33
2.2.7.1 Métodos de aislamiento ...................................................
................. 35
2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas .....................................
............... 36
2.2.8 Virulencia ...............................................................
.................................. 37
2.2.8.1 Entrada a las células del hospedero .....................................
.............. 39
2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular. .........................
........ 39
2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático .......................................
.......... 40
2.2.8.4 Diseminación célula-célula ...................................................
............ 40
2.2.9 Listeriosis ..............................................................
................................... 41
2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis) ..........................................
................... 41
2.2.9.2 Invasivo ...............................................................
.............................. 42
2.2.9.3 Tratamiento ............................................................
........................... 42
2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos 43
2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor) .......................
..... 43
2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z .........................................
.................. 43
2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D) ....................................
...... 44
2.3.2.2 Valor Z ................................................................
.............................. 45
2.3.3 Termorresistómetro .........................................................
......................... 46
2.3.4 Factores que influyen sobre la termorresistencia de los microorganismos
..............................................................................
......................................... 47
xv
= Page 9 =
2.4 Antimicrobianos naturales ...............................................
................................ 49
2.4.1 Aceites esenciales........................................................
............................. 50
2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales ...........................
.... 50
2.4.1.2 Eugenol (clavo) ........................................................
............................. 52
2.4.1.3 Carvacrol y Timol (Tomillo) ...........................................
.................. 54
2.5 Modelo y distribución Weibull ..............................................
.......................... 58
2.6 Factor de exactitud (A ) f ..............................................
.................................... 62
3. JUSTIFICACIÓN ...............................................................
............................. 64
4. OBJETIVOS .................................................................
.................................. 66
5. HIPOTESIS .................................................................
................................... 67
5.1 Predicciones ...............................................................
................................. 67
6. MATERIALES Y METODOS ......................................................
.................... 68
6.1 Materiales .................................................................
................................... 68
6.1.1 Microorganismo ...........................................................
........................ 68
6.1.2 Medios de cultivo ........................................................
......................... 68
6.1.3 Aceites esenciales........................................................
......................... 69
6.1.4 Equipos .................................................................
................................ 69
6.1.5 Materiales ...............................................................
.............................. 69
6.2 Metodología ..................................................................
.............................. 70
6.2.1 Activación del microorganismo ..............................................
............. 70
6.2.2 Preparación de la suspensión para el termorresistómetro .................... 70
6.2.2 Recuento inicial ........................................................
............................ 70
6.2.3 Realización de los tratamientos Isotérmicos a 55 y 60ºC .................... 71
6.2.4 Realización de los tratamientos no isotérmicos a 55 y 60ºC ............... 72
6.2.5 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con los aceites
esenciales de tomillo y clavo...................................................
...................... 75
6.2.6 Tratamientos sobre el alimento ...........................................
................. 77
6.3 Análisis Estadístico de los datos ..............................................
................... 78
7 Resultados y Discusión ......................................................
................................ 78
7.1.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC .........................................
............ 79
7.1.2 Tratamientos no isotérmicos (N.I) a 55 y 60ºC ...............................
......... 84
7.1.2.1 Predicciones ...........................................................
........................... 89
7.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con los aceites esenciales. ....... 99
7.2.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con el aceite
esencial de tomillo.............................................................
.......................... 100
xvi
= Page 10 =
7.2.2 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60 ºC en combinación con el aceite
esencial de clavo ..............................................................
........................... 101
7.3 Tratamientos sobre el alimento .............................................
.................... 107
7.3.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC. ........................................
...... 108
8. Conclusiones ..............................................................
................................... 118
9. Recomendaciones ...........................................................
............................... 119
10. Bibliografia .............................................................
.................................... 120
xvii
= Page 11 =
INDICE DE TABLAS
T ABLA IEMPO DE MUESTREO EN LOS TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS POR 1. T
TEMPERATURA ..................................................................
............................................... 71
T ABLA ILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 2. D
55 C ( º EN BASE 10) ........................................................
.................................................... 72
T ABLA ILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 3. D
60 C ( º EN BASE 10) ........................................................
.................................................... 72
T ABLA ERFIL DE TEMPERATURAS PARA LOS TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS ANGO 4.
P . R
DE TEMPERATURAS Y VELOCIDADES POR PERFIL . ....................................
......................... 73
T ABLA RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 5. T 55 C, º TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIO
NES A
SEMBRAR EN BASE ( 10). .....................................................
.............................................. 74
T ABLA 6.T RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60 C, º TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONE
S A
SEMBRAR EN BASE ( 10). .....................................................
.............................................. 74
T ABLA RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 7 T 55 C º CON A.E. CLAVO AL 0.01%,
TIEMPO DE
MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR EN BASE ( 10) EN MEDIO BHIA. ...........
.................... 75
T ABLA RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 8. T 55 C º CON A.E. CLAVO AL 0.05%
, TIEMPO DE
MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR EN BASE ( 10) EN MEDIO BHIA+N C . ......
............. 75 A L
T ABLA RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 9. T 55 C º CON A.E. TOMILLO AL 0.0
1%, TIEMPO
DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR EN BASE ( 10) EN MEDIO BHIA. ........
.................. 76
T ABLA 10. T RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55 C º CON A.E. TOMILLO AL 0
.01%, TIEMPO
DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR EN BASE ( 10) EN MEDIO BHIA+N C . ...
........... 76 A L
T ABLA 11. T RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60 C º CON A.E. CLAVO AL 0.0
1%, TIEMPO DE
MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR EN BASE ( 10) EN MEDIO BHIA. ...........
.................... 76
T ABLA 12. T RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60 C º CON A.E. CLAVO AL 0.0
1%, TIEMPO DE
MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR EN BASE ( 10) EN MEDIO BHIA+N C . ......
............. 77 A L
T ABLA 13. T RATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60 C º CON A.E. TOMILLO 0.0
1% 0.05%, Y
TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR EN BASE ( 10). ....................
.................... 77
T ABLA 14. V ALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%),D, I ND
ICE DE
2
CORRELACIÓN R Y ( ) R O PARA L ISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN
UN
TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55 C. .................................................
................................ 80 º
T ABLA 15. V ALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%),D, I N
DICE DE
2
UN
TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60 C. .................................................
................................ 82 º
T ABLA 16. V ALORES OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS Z . ........
........................ 83
T ABLA 17. . V ALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%),D, I
NDICE DE
2
UN
TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55 C. ..............................................
.............................. 86 º
T ABLA 18. V ALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%),D, I ND
ICE DE
CORRELACIÓN RO Y ( ) R2 PARA L ISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032
EN UN
TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60 C. ..............................................
.............................. 89 º
T ABLA 19. V ALORES OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Z . .....
...................... 89
T ABLA 20. I NTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO
ISOTÉRMICO HASTA 55 C º CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y
PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO
DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN EL MEDIO BHIA. ....................
............................. 91
xviii
= Page 12 =
DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+N C . ..................
........................ 92 A L
DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA. .......................
............................... 93
DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+N C . ..................
........................ 94 A L
T ABLA 24. P ARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN W EIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LA
S
CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN
TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55 C º Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE
ESENCIAL DE CLAVO . ...........................................................
........................................... 102
S
CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN
TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60 C º Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE
ESENCIAL DE CLAVO ............................................................
........................................... 104
T ABLA 26. V ALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%),D, Í NDIC
E DE
CORRELACIÓN RO Y ( ) R2 PARA L ISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032
EN UN
TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55 C º SOBRE CREMA DE CALABACÍN . ...................
....... 108
T ABLA 27. V ALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%),D, Í NDIC
E DE
CORRELACIÓN RO Y ( ) R2 PARA L ISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN
UN
TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60 C º SOBRE CREMA DE CALABACÍN . ...................
....... 109
T ABLA 28. V ALORES OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS EN CREMA DE
Z
CALABACÍN . .....................................................................
.............................................. 109
S
CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE
CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55 C º CON UNA
CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO . .......................
.................. 114
S
CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE
CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60 C º CON UNA
CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO ........................
................. 115
xix
= Page 13 =
INDICE DE FIGURAS
F IGURA ABITAT DE 1. H L. MONOCYTOGENES Y VIAS DE CONTAMINACIÓN .....
........................... 28
F IGURA 2. R ESUMEN MODIFICADO DE TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS GENERALES
DE
AISLAMIENTO IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN PARA , L ISTERIA SPP . Y L
ISTERIA
MONOCYTOGENES EN MUESTRAS AMBIENTALES Y DE ALIMENTOS . .....................
............... 34
F IGURA 3. S ISTEMA METODOLÓGICO PARA LA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE L ISTER
IA
SPP . MODIFICADO .........................................................
................................................... 37
F IGURA 4. R EPRESENTACIÓN ESQUÉMATICA DE LA BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN
INTRACELULAR POR L. MONOCYTOGENES .........................................
................................. 38
F IGURA EPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA FISIOPATOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR 5. R
L ISTERIA SPP . ............................................................
........................................................ 41
F IGURA RÁFICA DE SUPERVIVENCIA 6. G ......................................
............................................ 44
F IGURA RAFICA DE VALOR 7. G D. .........................................
................................................... 45
F IGURA RAFICA DE TERMO RESISTENCIA Y VALOR 8. G Z. .....................
................................... 46
F IGURA 9. L OCALIZACIÓN Y MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS COMPONENTES DE
A.E
SOBRE LA CÉLULA BACTERIANA . ....................................................
.................................. 51
F IGURA 10. E UGENOL .................................................
............................................................. 53
F IGURA 11. E SQUEMA SUGERIDO DE ACCIÓN SUGERIDO PARA EL CARVACROL SOBRE LA
MEMBRANA CITOPLASMÁTICA .......................................................
................................... 55
F IGURA 12. T IMOL .....................................................
.............................................................. 56
F IGURA 13. C ARVACROL .................................................
......................................................... 56
F IGURA 14. E JEMPLO M ODIFICADO DE CONCAVIDADES . ...................
....................................... 61
F IGURA 15. UPERVIVENCIA DE S L. MONOCYTOGENES CETC 4032 E
N CONDICIONES
ISOTÉRMICAS (55 C) º EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA BHIA+N C ..................
.... 79 Y A L
F IGURA 16. S UPERVIVENCIA DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN
CONDICIONES
ISOTÉRMICAS (60 C) º EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA BHIA+N C . .................
.... 81 Y A L
CONDICIONES NO
ISOTÉRMICAS (N.I) 55 C A º EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA BHIA+N C . .........
... 85 Y A L
F IGURA 18. C OMPORTAMIENTO DE LA POBLACIÓN DE L. MONOCYTOGENES
CETC 4032
DURANTE EL PERFIL N.I 55 C A º EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA BHIA+N C .....
. 85 Y A L
CONDICIONES NO
ISOTÉRMICAS (N.I) 60 C A º EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA BHIA+N C . .........
... 88 Y A L
F IGURA 20. C URVA DE SUPERVIVENCIA L. MONOCYTOGENES CETC 4032 D
ESPUÉS DE UN
CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55 C º EN MEDIO BHIA. ..........................
................... 92
F IGURA 21. C URVA DE SUPERVIVENCIA L. MONOCYTOGENES CETC 4032
DESPUÉS DE UN
CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55 C º EN MEDIO BHIA+N C . .....................
............ 93 A L
F IGURA 22. C URVA DE SUPERVIVENCIA DE L. MONOCYTOGENES CETC 4032
DESPUÉS DE
UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60 C º EN MEDIO BHIA. .......................
................ 94
DESPUÉS DE
UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60 C º EN MEDIO BHIA+N C . ..................
......... 95 A L
32 EN MEDIO
BHIA, A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL MODELO
DE B IGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE
TEMPERATURA DE º 3 C/ MIN . .................................................
............................................. 97
32 EN MEDIO
BHIA+N C , A L A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL
xx
= Page 14 =
MODELO DE B IGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE
TEMPERATURA DE º 3 C/ MIN . .................................................
............................................. 98
EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55 C º CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO
EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN
DE W EIBULL . .............................................................
..................................................... 102
EXPUESTA A
EN MEDIO BHIA+N C A L A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA
DISTRIBUCIÓN DE W EIBULL .....................................................
....................................... 103
EXPUESTA A
EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN
DE W EIBULL ..............................................................
..................................................... 104
EXPUESTA A
EN MEDIO BHIA+N C A L A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA
DISTRIBUCIÓN DE W EIBULL .....................................................
....................................... 105
CONDICIONES
ISOTÉRMICAS (55 C) º EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO
SELECTIVO Y NO SELECTIVO . ....................................................
...................................... 108
CONDICIONES
ISOTÉRMICAS (60 C) º EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO
SELECTIVO Y NO SELECTIVO . ....................................................
...................................... 109
F IGURA 32. C OMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE
L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 55 C.
.............. 111 º
F IGURA 33. C OMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE
L. MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 60 C
. .............. 111 º
EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 55 C º CON 0,05% DE
ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR
DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE W EIBULL . ................
.......... 113
EXPUESTA A
ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE
LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE W EIBULL . ...................
............ 113
EXPUESTA A
ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR
DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE W EIBULL . ................
.......... 114
EXPUESTA A
ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE
LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE W EIBULL . ...................
............ 115
xxi
= Page 15 =
1. INTRODUCCIÓN
Con el descubrimiento de los microorganismos gracias a la invención del

microscopio por parte de Anthony Van Leeuwenhoek (1632-1723), la visión del
mundo tal y como se conocía en ese tiempo cambió drásticamente, las teorías que
formularon investigadores como el filósofo romano Lucrecio ( circa 98-55 a.C.)
y
el médico Girolamo Fracastoro (1478-)
Desde aquellos tiempos hasta la actualidad el ser humano se ha visto favorecido

y
afectado por los microorganismos. Beneficiado porque aprovecha las cualidades
(metabólicas, genéticas, etc.) de algunos de estos para la elaboración de alimentos
(pan, queso, cerveza, etc.), elaboración de medicamentos (antibióticos, vitaminas,
vacunas, etc.) y en la actualidad como agentes recuperadores de ambien
tes y
ecosistemas contaminados por la actividad industrial del hombre en una rama de
la microbiología llamada biorremediación. Pero como se dijo anteriormente,
también se ha visto afectado a nivel salubre debido a las enfermedades que estos
provocan y que han generado grandes acontecimientos históricos como la peste
negra en 1347. Con el descubrimiento del microscopio y la creación de
la
microbiología, el ser humano se ha preocupado por mejorar los niveles de la salud
desde diferentes puntos, algunos de ellos como la industria farmacéutica,
la
industria alimentaria y la medicina entre otros.
Una de las ramas de la microbiología encaminada a asegurar la salud del hombre
y de los animales es la microbiología de alimentos, esta rama es la encargada de
verificar que los alimentos producidos por el sector agroalimentario, sean segur
os,
confiables e inocuos para la salud previniendo la generación de brotes
epidemiológicos de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), como por
ejemplo: el cólera, la listeriosis, la salmonelosis, entre otras.
Para esto la industria utiliza conservantes químicos como nitritos, benzoato sódico
y meta bisulfito sódico los cuales han demostrado gran eficacia en el
control
22
= Page 16 =
microbiológico de los alimentos. Sin embargo, estudios recientes han demostrado
que estos compuestos ó sustancias derivadas de estos son peligrosos para la salud,
como por ejemplo las nitrosaminas, compuesto cancerígeno proveniente de l
a
transformación de los nitritos.
Por otro lado, en la última década, los consumidores reclaman alimentos naturales
mínimamente procesados, es decir, que mantengan sus características
organolépticas y nutricionales intactas, pero que a su vez sean inocuos con un
mayor tiempo de frescura sin la adición de compuestos químicos ó aplicación de
técnicas agresivas, como la exposición a altas temperaturas.
En este sentido, los investigadores han explorado varias alternativas, como la
combinación de tratamientos, por ejemplo: temperaturas moderadas con pH, a , w
entre otros; y lo más reciente es el uso de componentes antimicrobianos naturales
los cuales han sido usados durante décadas para la conservación y sazonamiento.
23
= Page 17 =
2 MARCO TEÓRICO .
2.1 Generalidades
2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs)
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) son uno de los mayo
res
problemas de la salud mundial, pueden causar una enfermedad pasajera o pueden
ser tan graves que pueden llegar a causar la muerte. Estas enfermedades resultan
por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con agentes químicos
(plaguicidas, fertilizantes, etc.) o por agentes biológicos (microorganismo
s,
parásitos, y/o algunas substancias toxicas que estos producen).
Las ETAs pueden ser de 3 tipos:
Infecciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de alimentos
contaminados por microorganismos perjudiciales (patógenos) vivos (virus,
bacterias, parásitos) Ej.: Salmonella spp, Listeria monocytogenes, el virus de
la
Hepatitis A (Anónimo 1, 2007).
Intoxicaciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de toxinas
formadas en tejidos de plantas o animales, o de productos metabólicos d
e
microorganismos en los alimentos, o por sustancias químicas que se incorporan a
ellos de modo accidental, incidental o intencional desde su producción hasta su
consumo. Ocurren cuando estas toxinas o venenos de bacterias o mohos todavía
están presentes en los alimentos ingeridos, las toxinas no son detectadas por el
consumidor, pues no tienen olor ni sabor y algunas pueden soportar lo
s
tratamientos térmicos realizados a los alimentos como por ejemplo la cocción, a
estas toxinas se les denomina toxinas termorresisentes. Entre los microorganismo
s
que producen toxinas se encuentran: Clostridium botulinum ( toxina botulínica),
Escherichia coli (toxina shiga), toxinas del pez globo (Michanie, 2007; Anónimo
1, 2007).
Toxi-infecciones: Son enfermedades causadas por la ingestión de una cier
ta
concentración de microorganismos vivos capaces de causar una enfermedad y
24
= Page 18 =
poseen la capacidad de producir, sintetizar o liberar toxinas unas vez ingeridas
. Ej.
Vibrio cholerae (cólera) (Anónimo 1, 2007).
2.2 Listeria monocytogenes
2.2.1 Historia
La primera descripción de Listeria monocytogenes fue en 1926 debida a un brote
epidemiológico en unos cerdos de guinea y conejos, y no fue reconocida como un
serio problema de salud, hasta que causó un gran brote invasivo con una alta tasa
de mortalidad en las provincias marítimas de Canadá. Este fue el primer brote que
demostró que este microorganismo es un patógeno alimentario y se ha demostrado
que muchos de los casos de listeriosis son producidos por la ingestión
de
alimentos contaminados. Después de este brote, se dio un gran interés en
investigar y conocer la epidemiología de este organismo, para proteger a
los
consumidores de la manera más efectiva contra el mismo, (Swatiman et al. , 2007
).
2.2.2 Morfología
El género Listeria está constituido por bacilos Gram positivos cortos y regulare
s,
de 0.4 a 0.5 m de ancho por 0.5 a 2.0 m de largo que pueden disponerse ?
?
cultivos viejos. Pueden aparecer en filamentos cortos y la capacidad de coloración
puede perderse (Blanco, 1994), no esporulados, aerobios y anaerobios
facultativos, son catalasa positivos, productores de acido L(+) láctico e
n el
metabolismo fermentativo de la glucosa, oxidasa negativos, esculina posi
tivos
(Blanco, 1994), L monocytogenes L.seeligeri L.ivanovii , y son hemolít
icos en ?
agar sangre con 5% vol/vol de sangre de caballo o cordero. L.monocytogenes y
L.seeligeri presentan un pequeño halo de hemólisis alrededor de las colonias que,
en numerosas ocasiones, es difícil de observar de tal forma que se hace necesario
retirar la colonia para poder detectarlo, L.ivanovii presenta un amplio dobl
e halo
-hemólisis. Para diferenciar más claramente entre estas especies, se utiliza un
test de potenciación de su actividad hemolítica con Staphylococcus aureus
-hemolisina (esfingomielinasa C) y Rhodococcus equi , denominado
25
= Page 19 =
test de CAMP (Michanie, 2007). Mientras L. ivanovii presenta un característico
R. equi, en L. monocytogenes L. y
seeligeri se observa un efecto en forma de cerilla. Con S. aureus
tan sólo L.
monocytogenes y L. seeligeri muestran una potenciación de su actividad
hemolítica (Blanco, 1994).
Son móviles por flagelos perítricos que se expresan mejor a 20-25ºC que a
temperaturas más elevadas, son bastantes resistentes a agresiones fisico-químicas
lo que les confiere una gran resistencia en el medio ambiente y puede sobrevivir
por prolongados periodos de tiempo (15 años) siempre que se encuentren
en
presencia de materia orgánica y que las condiciones de pH, temperatura, a , etc.
w
Sean favorables. (Blanco, 1994).
2.2.3 Factores de crecimiento
El género Listeria spp. presenta una temperatura mínima de crecimiento de 0.4ºC

(Blanco, 1994), otros documentos reportan que la temperatura mínima es de -1.5
(Michanie, 2007), si bien la temperatura óptima es de 37ºC y la temperat
ura
máxima es de 45ºC, el rango de pH es de 4.3 a 9.4 siendo el pH 7 el óptimo para
su desarrollo y la actividad de agua (a ) mínima que permite su crecimiento es de
w
0.92(Michanie, 2007; Anónimo 4, 2007). La atmósfera ideal para su desarrollo es
de microaereofilia, pero tolera las condiciones aerobias, puede crecer
en
concentraciones altas de CO (Ej.30%) pero en concentraciones de 100% de CO 2
2
es inhibida.
2.2.4 Clasificación
La clasificación del género listeria ha sufrido muchas variaciones, a lo largo de
más de 30 años, y se le ha incluido en diferentes familias y géneros dentro del
Bergey`s manual of determinative bacteriology. En la séptima edición de 1957,
fue incluido dentro de la familia Corynobacteriaceae debido a sus característi
cas
morfológicas Con el tiempo y gracias a estudios de taxonomía numérica y de .
pared celular, evidenciaron la nula o baja relación entre Listeria y
las
corinebacterias y evidenciaron su errónea clasificación, (Domínguez, 2001).
26
= Page 20 =
Los estudios quimiotaxonómicos demostraron que el género Listeria posee un
bajo contenido de Guanina+Citosina (G+C) 36-42%, carencia de ácidos micólicos
y presencia de ácidos lipoteicoicos, presencia de peptidoglicano de la variedad
A1 asociados a ácidos teicoicos del tipo polirribitol-fosfato, y por poseer como
?
menaquinona principal la MK7. Todo esto, conllevó a la confirmación de la
estrecha relación de este género con los géneros Lactobacillus, Staphylococcus,
Streptococcus, Bacillus, Enterococcus, Lactococcus gracias a la proximidad que
los estudios de taxonomía numérica presentan y a la semejanza en las propiedades
quimitaxonómicas. Con esto, en 1974 en la siguiente edición del manual Bergey
aparece incluido en la sección 16 como género de afiliación incierta cerca de los
géneros anteriormente mencionados y con los cuales posee relación, (Blanco,
1994; Garcia, 1995; Domínguez, 2001).
Gracias a los avances de tecnologías genéticas (hibridación DNA-DNA, análisis
del ARNr 16S) se demostró la escasa relación filogenética entre el género Listeria
y las corinebacterias y la cercanía con los géneros Brochotrix y Lactobacill
us
(Blanco, 1994) Gracias a estos avances, se ubicó este género en la famili
a .
Listeriaceae , que está ubicado en la subrama del genero Clostridium
de las
bacterias Gram positivas, basado en el bajo contenido de G+C en su genoma
(Gasanov et al. , 2005). Las cuatro secuencias disponibles hasta hoy
de
L.monocytogenes (cepas Ende, F6854, F2365, H7858) tienen un tamaño promedio
entre 2,893,921 bp y 2,953,211 bp con un contenido aproximado de G+C del 38%
y cerca de 2900 genes codificadores de proteínas. La cantidad de G+C d
e
L.welshimeri y de L.innocua son de 36.4% y 37% respectivamente. Los análisis
de los genomas, de estas bacterias del género Listeriaceae permitieron evidenc
iar
particularidades y semejanzas entre estas, como las diferencias entre las cepas
patógenas y no patógenas. Uno de los rasgos semejantes entre las bacteria
s
pertenecientes a este género, es la fuerte conservación en la organización
genómica, sin inversiones o cambios de largos segmentos geonómicos. Una casi
perfecta conservación en el orden y en la relativa orientación de los ge
nes
heterólogos fue identificada, demostrando e indicando una gran estabilidad y una
27
= Page 21 =
filogenia cercana entre los genomas de las bacterias del género Listeri
a
(Buchrieser, 2007).
Actualmente, el género listeria se halla constituido por seis especies:
L.monocytogenes, L.inonocua,L.seeligeri, L.welshimeri, L.grayi L.ivanovii y
con
sus dos subespecies indoniencis ivanovii e (Blanco, 1994).
2.2.5 Reservorio
Listeria monocytogenes es un microorganismo ubicuo, está de modo saprofito en
gran cantidad de nichos medioambientales, considerándose su hábitat principal el
suelo y la materia vegetal en descomposición y en aguas continentales (Fig.1).
También se encuentra normalmente en la flora intestinal de animales y está en las
heces de un 2 a 6% de la población. Se encuentra también en ensilados y en el
entorno de la producción de alimentos (Fig.1) (Blanco, 1994; Michanie, 2007).
Figura 1. Habitat de L.monocytogenes y vias de contaminación (Reguera et al.

,
1995)
2.2.6 Alimentos
Como se comentó en un apartado anterior una de las principales vías de
contaminación son los alimentos. Algunas investigaciones y reportes proponen
que los alimentos susceptibles y con más probabilidad de encontrar este
28
= Page 22 =
microorganismo son salchichas, fiambres, leche, leche pasteurizada y derivados
lácteos, carne y productos cárnicos, y debido a su presencia en aguas servidas se
puede encontrar en vegetales regados con agua contaminadas y no tratad
as
(Blanco, 1994; Michanie, 2007).
Diversos factores, son un reflejo de los cambios sufridos en el estilo de vida
de
los consumidores, entre estos se pueden incluir: (i) progresos médicos que han
producido un cambio demográfico, incrementando la proporción de población de
edad avanzada e inmunocomprometida; (ii) cambios en el sistema de producción
primaria de alimentos (producción a gran escala de materias primas, modificación
de las técnicas de procesado de los alimentos, expansión de la industria
alimentaria y desarrollo de sistemas de almacenamiento en frío); (iii)
modificaciones en los hábitos de alimentación (incremento en la demanda por
parte de los consumidores de alimentos listos para comer, precocinados,
refrigerados o congelados pero con un mínimo requerimiento de tiempo de
cocinado antes de su consumo); (iv) realización de la compra una vez a la semana
(Domínguez, 2001).
Como ya se comentó antes al ser este un microorganismo ubicuo y encontrarse
presente de manera normal en la flora intestinal en algunos organismos
, los
enfermos y portadores sanos (animales y humanos) son una de la fuentes más
importantes de contaminación en la industria alimentaria, debido a la
diseminación en el ambiente de L.monocytogenes por parte de estos a través de l
a
orina, heces y otras secreciones (Fig.1) (Blanco, 1994).
Se han aislado colonias de L.monocytogenes , de agua por la descongelación de

refrigeradores domésticos, gracias a la capacidad de este microorganismo
de
soportar bajas temperaturas, lo que puede causar la contaminación cruzada de los
productos refrigerados generando un riesgo para el consumidor (Blanco, 1994;
Michanie, 2007; Farber, 1991; Mena et al. , 2003).
29
= Page 23 =
Otro punto de contaminación de los alimentos, es la contaminación cruzada por la
mala higiene de equipos y personal que laboran en plantas de producción, en seis
plantas de delicatesen en Francia, se identificó contaminación cruzada entr
e
alimentos crudos y cocinados por los procedimientos inadecuados de limpieza y
desinfección, como fuentes importantes de contaminación (Mena et al. , 2003)
2.2.6.1 Leche y productos lácteos
La leche y los productos lácteos son los alimentos en los cuales se han realizado
mas investigaciones, debido a su alta incidencia en relación a los brot
es de
listeriosis presentados entre 1983 y 1987 en USA y Suiza.
L.monocytogenes por ser un microorganismo ubicuo puede contaminar a las vacas

lecheras provocándoles mastitis, la cual puede presentarse con ó sin alteración
mamaria y/o de la leche de los animales afectados y Listeria spp. puede segu
ir
siendo excretada en la leche aun 3 meses después de la desaparición de
los
síntomas (Fig.1).
En los demás productos lácteos su presencia se debe a 2 factores: uno e
s la
utilización de leche contaminada y mal tratada como materia prima para
la
elaboración de derivados lácteos (queso, leches achocolatadas, postres, etc.) y dos
a la capacidad que tiene este microorganismo de crecer a temperaturas
de
7
refrigeración, y alcanzar niveles de hasta 10 ufc/mL durante el almacenamiento si
el producto está contaminado (Blanco, 1994).
En estudios realizados por Mena et al . 2003 en Portugal, obtuvieron
como
resultado que de 6 muestras de leche cruda 1 estaba contaminada con Listeria
(incidencia del 16.7%), de 28 muestras de leche pasteurizada ninguna presentó
presencia del microorganismo, de 371 muestras de quesos fabricados a partir de
leche pasteurizada 6 resultaron positivas (incidencia 1.6%) y de 50 muestras de
queso fresco 2 dieron positivas en presencia del microorganismo (incidencia del
4.0%) y en España un estudio realizado por Vitas et al. , 2003 obtuvieron que d
e
340 muestras de leche de vaca obtuvieron presencia de: 23 L.monocytogenes, 2
4
30
= Page 24 =
L.innocua , 1 L.welshimeri , 1 L.seeligeri. La leche fresca pertenece a
los productos
crudos que sufren un proceso de cocción o calentamiento antes de su us
o o
consumo (Vitas et al. , 2003) lo cual es reflejado por la ausencia de
Listeria en
las muestras de la lache pasteurizada, y la presencia de listeria en productos a
partir de este tipo de materias primas es a causa de la contaminación cruzada
durante elaboración de los productos.
La leche cruda permite una presencia medianamente alta de patógenos por
el
proceso de obtención, transporte y contaminación cruzada, pero como es un
producto que no se consumirá crudo y sufrirá un proceso de calentamiento
(pasteurización, UHT, entre otros) que asegurara la destrucción del 100% d
e
patógenos no se tiene mucha relevancia sobre la misma.
2.2.6.2 Carne y productos carnicos
Se ha aislado L.monocytogenes de muy diversos tipos de carne. La carne de av
e y
sus derivados, son los mas susceptibles y los que mayor incidencia presentan ent
re
los diferentes alimentos investigados y la contaminación aumenta a medida que
avanza el procesado y distribución del producto, aunque los recuentos obtenidos
2
no son superiores a 10 UFC/mL (Vitas et al. ,2003; Mena et al. , 2003).
Las carnes rojas presentan una mayor presencia de Listeria spp. siendo esta
mayor
en la carne de porcino que en las de vacuno y ovino, aunque los recuentos no son
superiores a 5 UFC/mL. En productos derivados como el paté se han llegado a
6
obtener recuentos de hasta 10 UFC/g (Blanco, 1994).
Mena et al . 2003, analizaron 105 muestras de carne, 15 fueron de pollo crudo
(músculo) de las cuales 9 dieron positivo (+) para la presencia de Li
steria
(incidencia del 60%), 17 de carne roja (músculo) de las cuales 3 dieron positivo
(+) para la de Listeria (incidencia del 17.7%), 4 muestras de jamón de las cua
les
solo 1 dio positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 25%
), 44
muestras de jamón curado (presunto) de los cuales 1 dio positivo (+) p
ara la
presencia de Listeria (incidencia del 2.3%) y 25 muestras de pescado crudo d
e las
31
= Page 25 =
cuales 3 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 1
2.0%) y
en España un estudio realizado por Vitas, y col. 2003 obtuvieron que de 295
muestras de carne cruda obtuvieron presencia de: 103 L.monocytogenes,
103
L.innocua , 45 L.welshimeri , 4 L.seeligeri , de 158 muestras de carne de
ave de
corral (pollo y pavo) obtuvieron presencia de 57 L.monocytogenes, 106 L.in
nocua ,
6 L.welshimeri , 2 L.seeligeri.
Para las carnes crudas se acepta una presencia moderada de patógenos por los
procesos que sufre el producto para su obtención (matanza, destripado, etc.) y la
preparación de las porciones (picado, troceado, etc.) pero como estos productos
sufrirán un proceso de cocción y su temperatura interna alcanzará los 70ºC y
asumiendo que el proceso es listericida si realiza de manera correcta (Vitas e
t al. ,
2003; Mena et al. , 2003).
2.2.6.3 Otros Alimentos
Se han encontrado reportes de L.monocytogenes en productos refrigerado
s
precocidos, listos para comer, congelados, y verduras y hortalizas crudas. (Blan
co,
1994; Domínguez, 2001)
La presencia en alimentos listos para consumo (ALC) ó ready to eat , refrigerados
y congelados se debe a que estos alimentos se consumen, sin ningún tratamiento
térmico o tratamientos muy suaves, que no aseguran la eliminación de
L.monocytogenes (Blanco, 1994).
Las investigaciones de Vitas et al.. 2003 y de Mena et al.. 2003, concue
rdan en
que los ALC poseen una alta probabilidad de causar listeriosis en los
consumidores, aunque estos productos sufran procesos de conservación y/o
maduración, y procesos de cocción que aseguren su inocuidad para los
consumidores, el riesgo radica en la contaminación directa ó cruzada por contacto
con superficies de equipos en los cuales se han manipulado alimentos crudos los
cuales presentan una alta probabilidad de contaminación con Listeria spp. Otro
s
estudios, han demostrado que los refrigeradores pueden ser una fuente potencial
32
= Page 26 =
de colonización y contaminación de alimentos por parte de Listeria
monocytogenes debido a su capacidad psicotrofa y a la generación de un ambiente
adecuado para su desarrollo y multiplicación debido a la ausencia de
microorganismos patógenos, y valores de pH y a adecuados (Vitas w et al. , 20
03).
Algunos autores y entidades recomiendan cero tolerancia en 25 g de productos
que posean un tiempo de vida útil mayor a una semana, debido a que
investigaciones en microbiología predictiva han demostrado, que a una
temperatura de almacenamiento de 0-5ºC y por más de 5 días la concentración
3
final de listeria puede ser de 10 ufc/g partiendo de una concentración
de 10
células, y si el almacenamiento es a 10ºC se puede alcanzar una concentración de
7
10 ufc/g , si el tiempo es menor recomiendan una concentración < 100 ufc/g,
(Vitas et al. ,2003).
Para los productos de carne cocinada y ALC, debido a sus cualidades y métodos
de conservación como se ha descrito anteriormente, son un medio idóneo para el
crecimiento de L.monocytogenes en todo el concepto microbiológico y por eso
deben tener un control igual que el de productos que posean duración de más de
una semana (Vitas et al. , 2003; Mena et al. , 2003).
2.2.7 Métodos de detección
Desde la aparición de ETAs, ha habido una constante investigación, búsqueda y
diseño de métodos más rápidos y más sensibles para la detección de
microorganismos patógenos, sobre todo en la industria alimentaria, debido a las
normas de gobiernos y organismos internacionales de ofrecer, alimentos inocuos
para el consumidor y para mejorar su aceptación en el mercado ofreciend
o
tiempos de vida útil más largos.
Existen variados y diferentes procedimientos y protocolos avalados por agencias
internacionales como FDA, ISO, para el aislamiento de Listeria monocytogenes
,
igualmente, existe gran diversidad de técnicas para la identificación de colonias
aisladas, métodos de identificación epidemiológica y el futuro para la detección de
33
= Page 27 =
microorganismos está encaminado a las tecnologías genéticas que se basan en el
análisis del RNA y DNA (Gasanov et al. , 2004).
Figura 2. Resumen modificado de técnicas y procedimientos generales d
e
aislamiento, identificación y tipificación para Listeria spp. y Listeria
monocytogenes en muestras ambientales y de alimentos (Gasanov et al. , 2004).
La mayoría de pruebas, protocolos y test usados para la detección de

microorganismos en la industria alimentaria no diferencian las especies
de
Listeria. Estos protocolos son regulados y certificados por agencias
gubernamentales como la FDA (Food and Drug Administration) o la USDA (US
deparment of agricultura) en Estados unidos ó la ANZFA (Australian and New
Zeland food administration) en Australia. Desde la perspectiva de higie
ne la
presencia de alguna especie no patógenica de Listeria como L.innocua pued
e
indicar la potencial transmisión o presencia de L.monocytogenes (Gasanov et
al. ,
2004).
La mayoría de pruebas que se usan en la actualidad en los laboratorios
de
microbiología de alimentos para la detección de L.monocytogenes están basados
34
= Page 28 =
en métodos de cultivo y anticuerpos, pero el reto de la industria alimentaría es
usar métodos moleculares. Algunas de las desventajas de los método moleculares,
es el costo de equipos y reactivos y que es necesario tener personal altamente
entrenado y capacitado para este tipo de pruebas, aparte no diferencia entre célul
as
vivas y muertas, alguna de sus ventajas, es que no se basa en la expresión de
factores antigénicos, enzimáticos o proteicos, es fiable y se basa en las diferencia
s
entre los genomas y se pueden realizar en la misma fracción de tiempo que toman
los métodos convencionales (Gasanov et al. , 2004).
2.2.7.1 Métodos de aislamiento
Históricamente, el aislamiento de Listera spp. de muestras de alimentos
y
ambientales ha sido un reto debido a la capacidad de este microorganismo de
crecer a bajas temperaturas. Por lo que, antiguamente se solía aislar de las muest
ra
clínicas poniéndolo a crecer en medios de cultivo a 4ºC por largos periodos de
tiempo hasta poder evidenciar el crecimiento de colonias. Este tipo de método,
toma demasiado tiempo y no permite la recuperación de células de Listeria spp.
dañadas. Hay tres elementos claves: enriquecimiento, tiempo de aislamiento
y
recuperación de células dañadas, los cuales son factores que se han de tener en
cuenta en los procesos de aislamiento si se desean obtener los mejores resultado
s
para el control de Listeria spp. en la industria alimentaria.
Las pruebas aprobadas por agencias reguladoras, deben detectar por lo menos una
célula de Listeria en 25 g de muestra ó producto a analizar. Esta sensibilidad s
olo
se puede lograr usando métodos y medios en el cual el microorganismo sea capaz
4
de llegar a una concentración de 10 UFC/mL el cual es un límite detectable. Dos
de los protocolos más usados para la detección de Listeria spp. en cua
lquier
alimento y que han sido certificados y avalados por agencias reguladoras son el
método de análisis bacteriológico (BDMA) de la FDA y el de la Organización
internacional de estándares (ISO) 11290, estos dos métodos poseen en común el
uso de 25 g de muestra para enriquecimiento en un medio que sea selectivo e
inhiba la microflora acompañante, y la siembra en medios sólidos selectivos e
identificación bioquímica de las colonias sospechosas (Gasanov et al. , 2004).
35
= Page 29 =
2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas
Los métodos de enriquecimiento, demoran entre 30 y 48 horas y como se dijo
anteriormente, debe continuarse con la identificación de los microorganism
os
aislados. Después de seleccionar un método de enriquecimiento validado para
Listeria se debe considerar la extensión en la cual el método ha sido validado, en
pocas palabras continuar usando protocolos validados y aceptados por agencias
reguladoras. Mientras varios países tienen sus propios esquemas de validación, la
AOAC en Washington, es la autoridad más reconocida en el mundo. La AOAC de
métodos oficiales, posee una gran variedad de métodos para la búsqueda de
Listeria que incluye métodos rápidos como inmunoensayos hasta pruebas basadas
en genética
Para la identificación existen varios métodos tales como: Confirmación por
pruebas bioquímicas, la Prueba de CAMP, pruebas de basadas en anticuerpos,
ELISA, inmunocaptura, y a nivel de las pruebas moleculares tenemos:
Hibridación de DNA y la PCR, en los estudios epidemiológicos se llega a la
tipificación del microorganismo (Gasanov et al. , 2004).
36
= Page 30 =
Figura 3. Sistema metodológico para la identificación fenotípica de Listeria spp.
modificado (Gasanov et al. , 2004)
2.2.8 Virulencia
L.monocytogenes puede invadir el ojo y la piel del hombre después de
una
exposición directa, se ha observado en accidentes de laboratorio, veterinario y
personal que labora en mataderos. Pero en la mayoría de casos de listeriosis en
humanos la puerta de entrada es la parte superior del tracto gastrointestinal po
r el
consumo de alimentos contaminados con dosis muy altas del microorganismos
6
( 10 UFC/mL ó g de alimento consumido) (Garza ? et al. , 2002; Álamo et al.
,
2006).
La bacteria luego de entrar por el tracto, atraviesa la barrera mucosa del intes
tino
probablemente ayudada por la endocitosis de las células endoteliales (placas de
peyer), y crece eficazmente dentro de los enterocitos y mononucleares, lo cual
37
= Page 31 =
permite que parte de su población alcance el torrente sanguíneo y se disemine por
vía hematógena. Luego de la translocación del intestino el hígado es el primer
órgano blanco donde se multiplica activamente antes de que la infección s
ea
controlada por la inmunidad mediada por células, luego de alcanzar el hígado los
otros tres órganos blancos de este patógeno son la placenta, el cerebro y el sistema
nervioso, (Álamo et al. , 2006; Reguera et al. , 1995).
Cuando la bacteria se interna en la célula, sea por fagocitosis o fago
citosis
inducida, queda englobada en un fagosoma monomembranal, del cual luego
escapa asegurando su libertad en el citosol, multiplicándose libremente e
n el
citoplasma, luego se desplaza por el interior hacia el exterior de la
célula
hospedora alcanzando las células subyacentes, quedando nuevamente englobadas
en el nuevo hospedador dentro de un fagosoma bimembranal. En concreto, los
eventos implicados en el proceso infectivo global, son (Vazquez et al
. , 2001;
Garza et al. , 2002) (figura 4):
i) Entrada a las células del hospedador.
ii) Escape del fagosoma y desarrollo intracelular.
iii) Desplazamiento intracitoplasmático.
iv) Diseminación célula-célula.
Figura 4. Representación esquématica de la biología de la infección intracelular
por L.monocytogenes (Reguera, et al. , 1995)
38
= Page 32 =
2.2.8.1 Entrada a las células del hospedador
La forma en la cual el microorganismo ingresa a las células no fagocíticas es
semejante a la clásica fagocitosis, ya que implica la interacción del ligando del
primero con el receptor de las segundas, como ya se dijo las placas de peyer y l
as
células M son el primer sitio de invasión, posteriormente el bacilo es englobado
por los macrófagos residentes. Las proteínas que participan en la internalización
inducida de Listeria en la célula, son las internalinas A y B que son codifica
das
por los genes InlA e InlB. Luego de su ingreso las células quedan internadas en un
fagosoma constituido de una sola membrana, que luego interactuara con
un
lisosoma para la destrucción de las bacterias pero este microorganismo es capaz
de escapar antes que esto suceda (Garza et al. , 2002; Domínguez, 2001).
2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular.
Dentro del fagosoma la bacteria queda englobada alrededor de 30 minutos en el

caso de L.monocytogenes , el fagosoma se acidifica rápidamente por medio de
ATPasas de protones. La supervivencia bacteriana y su posterior multiplicación
en el citosol van a ser el resultado de una competición entre la fu
sión del
fagosoma-lisosoma y la exposición oxidativa de las células hospedadoras
(Domínguez, 2001), los mecanismos para evitar esto son la expresión de los genes
( hly ) de las toxinas líticas (listeriosina O con interacción sinérgica de fosfolip
asas)
para la destrucción del fagosoma y la expresión de dos enzimas, catalasa
y
superóxido dismutasa, que la protegen de la oxidación fagolisosómica (Garza et
al. , 2002).
Una vez que se concreta la lisis del fagosoma (en el fagosoma monomembranal
solo interfiere la listeriosina O y en el fagosoma bimembranal intervienen
las
fosfolipasas junto con la listeriosina) el microorganismo se libera al citosol d
onde
se multiplica en un tiempo de 50 minutos (Garza et al. , 2002).
39
= Page 33 =
2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático
Dentro del citoplasma la bacteria expresa otro gen de virulencia denom
inado
ActA, que es una proteína que manipula los componentes del citoesqueleto de la
célula hospedadora para su tránsito intracelular e intercelular. Durante la
internalización, el microorganismo absorbe varios filamentos cortos de act
ina
(Garza et al. , 2002), y durante su división se observa una densa nube de actin
a que
la rodea. Asociada con la replicación bacteriana se va a producir una
redistribución de los filamentos de actina, concentrándose en uno de los polos de
la bacteria (Domínguez, 2001), formándose estructuras (actínicas) semejantes a la
cola de una cometa.
Posteriormente, se produce una polimerización continua de la actina en dicho polo
que mediante un mecanismo similar al de los cohetes, propulsa las bacterias por
el
citoplasma (Domínguez, 2001), aportando una fuerza locomotora que logra
velocidades de 0.05 a 0.3 m/seg (Garza ? et al. , 2002).
2.2.8.4 Diseminación célula-célula
La adquisición de movilidad asociada a la polimerización de los filamentos de
actina alcanza la membrana plasmática de la célula infectada para poder invadir a
las células vecinas (Garza et al. , 2002; Álamo et al. , 2006).
Los bacilos se desplazan a través del citoplasma hacia la membrana
citoplasmática, utilizando los filamentos de actina polimerizados, una vez logran
este objetivo, la empujan progresivamente provocando que se produzcan
prolongaciones alargadas llamadas filópodos o protruciones, desde cuyo interior
continúan ejerciendo presión, de esta manera dichas proyecciones terminan siendo
fagocitadas por las células adyacentes (Garza et al. , 2002). Como consecuencia
de
esto, las bacterias quedan atrapadas en una vacuola rodeada por una d
oble
membrana, la interna constituida por la membrana citoplasmática de la primera
célula y la externa por la membrana de la nueva célula invadida (Domínguez,
2001; Vazques et al. , 2001).
40
= Page 34 =
2.2.9 Listeriosis
A pesar de la amplia presencia de la bacteria en el ambiente la enfermedad no es
frecuente y afecta principalmente a adultos inmunocomprometidos, mujeres
embarazadas, recién nacidos, granjeros, veterinarios y enfermos crónicos
(Michanie, 2007).
La listeriosis presenta dos tipos de cuadros: invasivo y no-invasivo, el cuadr
o
invasivo suele ocurrir en personas con sistemas inmunes muy débiles (VIH
positivos, gerontes, embarazadas, fetos y neonatos, personas que padecen cáncer,
diabetes, cirrosis, y en las que reciben medicamentos inmunodepresores o han
sido sometidas a transplantes), y la no invasiva ocurre en cualquier persona que
haya consumido una alta dosis de Listeria monocytogenes (Garza et al. , 2

002).
Figura 5. Representación esquemática de la fisiopatología de la infección por

Listeria spp. (Vasquez et al. , 2001)
2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis)
Los síntomas son diarrea, fiebre, dolor muscular, dolor de cabeza, dolor
abdominal y vomito en casos menos frecuentes, la incubación del microorganismo
y reflejo de los síntomas se dan entre la primera hora y los 7 días.
41
= Page 35 =
2.2.9.2 Invasivo
Las infecciones invasivas tienen un tiempo de incubación de 1 a 90 días, se
presentan síntomas parecidos a una gripe, diarrea con presencia de vomito, tiene
una mortalidad del 30% y una tasa de hospitalización del 92%, la concentración
de microorganismo para causar la enfermedad es de 100-1000 células.
Las enfermedades que puede causar son (Garza et al. , 2002; Michanie, 2007) :
I. Infecciones durante el embarazo.

II. Granulomatosis linfatiséptica.
III. Sepsis de origen desconocido (septicemia).
IV. Meningoencefalitis, cerebritis, y romboencefalitis.
V. Infecciones focales.
2.2.9.3 Tratamiento
L.monocytogenes es susceptible a gran cantidad de antimicrobianos y su
resistencia es ocasional, excepto a las tetraciclinas, estudios han comprobado q
ue
es capaz de adquirir genes de resistencia provenientes de Enterococcus spp.
y
Streptococcus spp. entre otros, lo cual puede aportarle resistencia a gentamic
ina,
estreptomicina, eritromicina y sulfametoaxol (Michanie, 2007).
Algunos autores reportan que la combinación de penicilina, ampicilina y
opcionalmente un amino glucósido (ej.gentamicina) es el más efectivo, algunos
otros adicionan el tratamiento con quinolonas, macrolidos y trimetropim-
sulfametaxol, y otros recomiendan que la asociación ampicilina-cotrimoxazol
,
subrayando que es superior a la combinación de ampicilina-penicilina-
gentamicina, ya que reduce la mortalidad y las secuelas cerebrales (Garza et a
l. ,
2002).
42
= Page 36 =
2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos
2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor)
La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque por di
ferentes
microorganismos (bacterias, levaduras, mohos), y estos alimentos pueden resultar
perjudiciales para la salud del consumidor.

El fuego y el agua en ebullición se han utilizado para esterilizar y desinfectar
desde la época de los griegos, siendo el calor aún hoy en día uno de los métodos
más comunes para la destrucción de microorganismos (Prescott et al. , 19
99),
debido a que los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a
temperaturas superiores a las de su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar
altas temperaturas para eliminarlos por termodestrucción, la sensibilidad de los
microorganismos a los tratamientos térmicos es diferente, las esporas son más
termorresistentes que las células vegetativas y los microorganismos Gram-
positivos lo son más que los Gram-negativos (Anónimo 2, 2007).
2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z
Al someter a una población bacteriana a la acción del calor, a una temperatura
constante, el número de supervivientes es una función exponencial del tiempo de
tratamiento: a intervalos iguales de calentamiento la población se reduce en igual
proporción. La cinética de destrucción microbiana es, por tanto, una cinética de
reacción de primer orden (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007):
-kt
N = N e t 0
Siendo:
N t
N : número inicial de microorganismos. 0
k: constante de inactivación.
t: tiempo de tratamiento.
Así pues, al representar el logaritmo del número de supervivientes a un
tratamiento térmico, realizado a temperatura constante, frente al tiempo,
se
43
= Page 37 =
obtiene una línea recta. Esta representación se denomina gráfica de supervivencia
(Palop, 2007).
Figura 6. Gráfica de supervivencia (Palop, 2007)

2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D)
Para definir la termorresistencia microbiana se creó un parámetro al que
se
ión decimal o valor D T
tiempo que es preciso tratar a una población microbiana a la temperatura T para
reducir su recuento a la décima parte , o lo que es lo mismo, para que la línea de
supervivencia atraviese un ciclo logarítmico. Si consideramos N como el número 0
de células al inicio del tratamiento y N el número de células sobrevivien
tes X
después de un tratamiento de t minutos a una temperatura T, el valor
D se
calcula:
=
0
D = x/Log(N /N ) ó D =-1/m (donde T 0 X T m es la pendiente de la

grafica de
supervivencia (Prescott et al. , 1999; Palop, 2007).
44
= Page 38 =
Figura 7. Grafica de valor D (anónimo 1, 2007).

2.3.2.2 Valor Z
Si aumentamos la temperatura del tratamiento, el valor D disminuye de forma
logarítmica. Por tanto, representando el logaritmo de los valores D frente a la
T
temperatura de tratamiento, obtendremos una línea recta denominada gráfica de
termodestrucción. La gráfica de termodestrucción permite conocer la
termorresistencia que presentará el microorganismo a cualquier temperatura de
tratamiento y su pendiente indica la termodependencia de las reacciones
que
conducen a su destrucción. A partir de la gráfica de termodestrucción se define el
valor como el z número de ºC que hay que aumentar a la temperatura
de
tratamiento para reducir el valor D a la décima parte T , es decir, para que la
línea
de termodestrucción atraviese un ciclo logarítmico, el valor z se calcula:
z =
log D log D T2 T1
o simplemente Z=-1/m (donde m es la pendiente de la gráfica de
termodestrucción) (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007, Palop, 2007).
45
= Page 39 =
Figura 8. Grafica de termorresistencia y valor Z. (Anónimo 2, 2007).
2.3.3 Termorresistómetro
El termorresistómetro es un instrumento diseñado para la determinación de la

resistencia de los microorganismos al calor. Este instrumento permite l
a
aplicación directa de un tratamiento térmico preestablecido, durante un tiempo
determinado en condiciones controladas, a una muestra de alimento o a un medio
sintético. (Palop, 2007)
El termorresistómetro consiste en un tanque de acero presurizado, calentado por
una resistencia eléctrica y homogeneizado mediante una hélice de agitación. La
temperatura del instrumento se controla mediante un autómata programable. Está
dotado de un puerto para adicionar los microorganismos, por medio de una jeringa
y una aguja estéril. En este instrumento se pueden realizar tratamientos
isotérmicos (temperatura constante a través del tiempo) y no isotérmicos (rampas
de temperatura, la temperatura aumenta de manera gradual y constante durante el
tiempo deseado hasta una temperatura final) (Fernández, 2007).
46
= Page 40 =
2.3.4 Factores que influyen sobre la termorresistencia de los
microorganismos.
En cualquier tratamiento antimicrobiano puede ocurrir que algunas células sean
dañadas pero no mueran debido a que algunas células sean más termorresistentes
que las demás por la producción de proteínas de choque térmico ó HSP (Heat
Shock Proteins) u otros mecanismos (Hassani, et al. , 2007; Millar, et al.
, 2006).
Aparte de esto, la resistencia de los microorganismos al calor esta supeditada a
una serie de factores, entre los cuales están:
- Tipo de microorganismos : Las bacterias esporuladas son las formas
mas
resistentes, llegando algunas de ellas, a sobrevivir a tratamientos de
varios
minutos a 120ºC, seguido están las bacterias vegetativas, levaduras y hong
os
presentan una termorresstencia similar, la mayoría mueren tras estar unos minutos
a una temperatura entre 70 y 80ºC (Anonimo 3, 2007; Garza, 2007).
-Temperatura: Algunas investigaciones han demostrado que la termorresistencia
de las esporas está influenciada por la temperatura de esporulación, así si
la
esporulación tiene lugar a la temperatura óptima de crecimiento, o superior, su
termorresistencia será mayor que si el crecimiento hubiera tenido lugar
en
temperaturas más bajas. Las formas vegetativas presentan un comportamiento
similar a las esporuladas pues en general, cuanto más se aproxima a la
temperatura óptima de crecimiento durante la fase de crecimiento más elevada es
su termorresistencia (Garza, 2007; Der Lin et al. , 2003).
- pH del medio de tratamiento: Quizás el factor más importante que afecta la
termorresistencia sea el pH. La resistencia de los microorganismos es
generalmente máxima a valores de pH próximos a la neutralidad, entre 6.0 y 8.0, y
decrece cuando el medio es ácido (Garza, 2007). Investigaciones de Hassani et al
.
2003 y de Hassani et al . 2007, demostraron que a un pH ácido la termorresisten
cia
disminuía y conforme aumentaba el pH la termorresistencia también aumentaba.
- Actividad del agua: La reducción en la actividad del agua en el me
dio de
tratamiento aumenta considerablemente la termorresistencia tanto en los esporos
47
= Page 41 =
como en las células vegetativas, lo que se refleja en la necesidad de
utilizar
temperaturas de tratamiento más elevadas o tiempos más prolongados (Garza,
2007). Fernández, y col. 2006, realizaron un modelo en el cual el efecto del a
w
sobre la termorresistencia de L.monocytogenes varía dependiendo de la
temperatura del tratamiento.
- Composición del medio: El contenido de azúcares, la adición de conservantes,
la presencia y el tipo de ácidos orgánicos y la presencia de sales, tienen un efecto
importante sobre la termorresistencia de los microorganismos. El azúcar e
n
concentraciones altas protege a las células contra la inactivación térmica pero no
solo la concentración influye, sino también el tipo de azúcar interviene
significativamente en el efecto protector (Garza, 2007). La sal en los alimentos
juega un rol importante pues el primer efecto que tiene sobre las células es la
plasmolisis, luego tiene otros efectos como deshidratación, interferencia
enzimática, retiro de oxígeno y la toxicidad de los iones, cloro y sodio, cuando el
cloruro de sodio es ionizado (Der lin et al. , 2003). Schultze, et
al.. 2006,
determinaron en su investigación que el D de 60 L.monocytogenes en una mezcl
a
de frankfurter con una concentración de 8.5% es de 2.2 minutos y a
concentraciones de 11 y 23% fue de 1.7 minutos, lo que desmiente que una
mayor concentración de grasas produce un aumento de la termorresistencia de los
microorganismos.
Listeria spp. es capaz de sobrevivir a bajas temperaturas debido al cambio de
composición que realiza en su membrana (Gandhi et al. , 2006). Según la teoría de
membrana fluida, la membrana en los organismos, al estar a temperaturas altas
aumenta su proporción de ácidos grasos saturados, y a bajas temperaturas las de
ácidos grasos insaturados y hopanoides. Listeria spp. a bajas temp
eraturas,
aumenta la proporción de C 15:0 a expensas de C 17:0 cuando la temperatura
es
reducida de la ideal (7ºC), todo esto con el objeto de mantener la fluidez adecuad
a
de la membrana (Gandhi et al. , 2006) ajustándose al modelo de mosaico fluido
de
Singer y Nicholson.
48
= Page 42 =
Las condiciones conocidas que afectan la resistencia a los tratamientos térmicos
por parte de Listeria spp son, entre otros, el estado en el ciclo de crec
imiento,
temperatura alta (19 ò 37ºC) durante el crecimiento (debido a que afect
a la
biosíntesis de lípidos), la composición membranal y síntesis de proteínas,
exposición a otros estreses y las células que se encuentran en fase estacionaria,
influyen en la resistencia a la inactivación térmica por parte de este
microorganismo. La termotolerancia tiende a aumentar significativamente después
de un shock térmico (30 minutos a 48ºC) en células crecidas a 4ºC. El caldo de
crecimiento juega un papel importante, pues afecta la tasa de crecimiento y la
composición de constituyentes celulares que determinan la termotolerancia de las
células bacterianas. (Doyle, 1999; Doyle et al. , 2000).
2.4 Antimicrobianos naturales
Los antimicrobianos son sustancias que pueden inhibir o detener el crecimiento d
e
microorganismos, estos pueden ser de origen natural (animal, vegetal y
microbiano) ó sintético (ácidos orgánicos y ésteres) (Raybaudi et al. , 2006).
Se estima que en la parte aérea de las plantas, la filosfera y especialmente en la
s
6 7 2 8
hojas, existen alrededor de 10 -10 células/cm (10 células/g) de
microorganismos, principalmente bacterias. Globalmente las plantas produce
n
más de 100.000 productos naturales de bajo peso molecular, también conocidos
como metabolitos secundarios. Esta diversidad tan rica resulta de un p
roceso
evolutivo para la adquisición de defensa mejorada frente a los ataques
de
microorganismos, insectos y otros animales (Domingo et al. , 2003).
Desde tiempos antiguos y en la actualidad se conocen y reconocen las propiedades
antimicrobianas de muchas especias y hierbas usadas en los alimentos. Se han
realizado investigaciones y se ha encontrado que los compuestos presentes en
estas plantas son derivados simples y complejos del fenol, los cuales son volátile
s
a temperatura ambiente (Marcén, 2000; Raybaudi et al. , 2006).
49
= Page 43 =
2.4.1 Aceites esenciales
Los aceites esenciales (A.E.) son compuestos lipídicos muy olorosos obtenidos
mediante la extracción de diferentes partes de plantas (flores, yemas, semillas,
hojas, ramas, corteza, hierba, madrea, frutos, raíces, etc.) usando solve
ntes
orgánicos ó técnicas como la destilación. Estos aceites están compuestos por
mezclas de ésteres, aldehídos, cetonas, terpenos, hidrocarburos cíclicos y
alcoholes. Además son compuestos muy solubles en alcohol pero poco solubles en
agua (Castillejos, 2005; Raybaudi et al. , 2006).
Los A.E que contenían un aldehído o un fenol como principal componente fueron
los más activos frente a bacterias del tracto respiratorio, seguido por los alcoho
les
y, con una menor acción antimicrobiana, los aceites que contenían
mayoritariamente cetonas, ésteres o hidrocarburos. La actividad de un ace
ite
esencial está relacionada con sus constituyentes principales (estos pueden
constituir hasta un 85% del total, mientras que el resto se presentan como traza
s),
la configuración estructural y grupos funcionales de sus compuestos, y c
on
posibles sinergias entre los compuestos. En consecuencia hay que difere
nciar
entre la mezcla total del aceite esencial de una planta y cada uno
de sus
componentes activos (Castillejos, 2005; Raybaudi et al. , 2006).
La composición de los aceites esenciales puede variar mucho dependiendo de la
variedad (propiedades determinadas genéticamente), la zona geográfica o
climatología (medio ambiente), la edad de la planta, la parte utilizada
en la
extracción, y el método de secado y extracción del aceite (Castillejos, 2005).
2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales
Los aceites esenciales al tener un gran número de compuestos, su acción
antimicrobiana no se atribuye a un único mecanismo, sino a varios debido a los
múltiples blancos en la célula. Una característica importante de los aceites
esenciales es su hidrofobicidad, característica que les permite unirse a los lípidos
de la membrana celular desestabilizando su estructura y aumentando su
50
= Page 44 =
permeabilidad, generando la salida de iones, metabolitos y demás moléculas que
pueden conllevar a la muerte (Burt, 2004; Castillejos, 2005). Estudios demuestra
n
que la mayoría de las propiedades antibacterianas frente a microorganismo
s
patógenos por parte de los A.E se debe en un alto porcentaje a los compuestos
fenólicos como el timol, el carvacrol y el eugenol presentes en estos (Burt, 2004)
.
Según algunos estudios señalan, la localización y la cantidad de grupos hidroxilo
sobre los grupos fenólicos de estas moléculas está relacionado con su toxicidad:
una mayor oxidación es responsable de una mayor capacidad bactericida
(Castillejos, 2005). Es razonable pensar que sus mecanismos de acción se
an
parecidos a los de otros compuestos fenólicos, generalmente se consideran
la
desestabilización de la membrana citoplasmática, la interrupción en la fuerza
protón motriz (FPM), el flujo de electrones, el transporte activo y la coagulación
de componentes celulares, (Burt, 2004). También pueden actuar sobre las
proteínas de la membrana citoplasmática. Los hidrocarburos lipofílicos pueden
acumularse en la bicapa lipídica e interferir en la interacción lípido prot
eína.
Además, también es posible una interacción directa entre los compuestos
lipofílicos con la parte hidrofóbica de la proteína. Como consecuencia, pueden
modificar la actividad de las enzimas que regulan la producción de energía o la
síntesis de compuestos estructurales (Castillejos, 2005).
Figura 9. Localización y mecanismo de acción de los componentes de A.E sobre

la célula bacteriana. (Burt, 2004; Castillejos, 2005)
51
= Page 45 =
Aparentemente los componentes de los A.E. interaccionan con las ATPasas que
están presentes en la membrana citoplasmática (Burt, 2004), Gill y col. 2006, en
su investigación determinaron que el eugenol, el carvacrol, y el cinemaldehido,
componentes de aceites esenciales, inhibían la obligada actividad de la ATPasa de
membrana de E.coli L.monocytogenes y . Las membranas bacterianas contienen
un
alto número de diferentes enzimas con función ATPasa incluyendo aquellas
involucradas en el transporte activo de proteínas, como la ATPasa F1F0 que es la
encargada de la regulación del pH celular. La inhibición de estas funciones puede
afectar la sobrevivencia celular, las concentraciones para inhibir la actividad
de
las ATPasas es la misma que se necesita para la desestabilización de la membrana
celular, lo que sugiere que la interrupción de las funciones de estas enzimas es u
na
causa secundaria más que una primaria de la muerte celular.
Otra investigación de Gill et al . 2005, permitió evidenciar que el carvacrol y e
l
eugenol aumentan la permeabilidad de la membrana afectando la movilidad de
E.coli L.monocytogenes y ofreciendo gran evidencia que la desestabilización d
e la
membrana es la causa primaria de la muerte celular por acción de estos
compuestos. El flagelo de estas bacterias esta estructuralmente integrad
o a la
membrana y el cual recibe energía proveniente del gradiente de protones más que
por los intermediarios fosforilados del ATP.
2.4.1.2 Clavo (Eugenol)
El clavo es una especia proveniente de las plantas del género Syzygium spp, es
ta
ha sido usada desde tiempos antiguos en la medicina tradicional, teniendo usos d
e
expectorante, estimulante, analgésico, anti flatulento, etc, y en la odon
tología
como antiséptico, por lo cual es común encontrarlo en gomas y en cremas dentales
para el tratamiento y prevención de la caries (Chaieb et al. , 2007).
El aceite esencial proveniente del clavo está constituido por 36 compone
ntes
(Chaieb, K, et al. , 2007) y con altas concentraciones de: eugenol (figura 12
), - ?
caryophyleno, -humuleno, epóxido de humuleno, etil hexanoato, 2-heptanona, ?
52
= Page 46 =
humulenol, calacoreno y calameneno (Chaieb et al. , 2007; Raina et al. ,
2001; Fu
et al. , 2007).
Figura 10. Eugenol
El eugenol pertenece al grupo de los fenilpropanos que son sustancias

ampliamente distribuidas entre los vegetales y se caracterizan por un
anillo
aromático unido a una cadena de 3 carbonos y derivados biosintéticamente del
ácido shikímico 2-metoxi-4-(2-peopenil) fenol (bolilla, 2007), los compuestos con
estructura fenólica demostraron tener una actividad antimicrobiana superior
debido a su carácter hidrofóbico. Estudios dan importancia al grupo hidroxilo y su
localización en la estructura fenólica para obtener una mayor capacidad
antimicrobiana (Castillejos, 2005).
Se teoriza sobre la posible interacción del grupo hidroxilo con proteínas
inhibiendo su acción, concentraciones subletales de eugenol inhibieron la
producción de las amilasas y proteasas de B.cereus. El deterioro de l
a pared
celular y el alto grado de la lisis celular también se comprobó en otra
s
investigaciones (Burt, 2004).
Estudios han comprobado la eficacia del aceite esencial del clavo como
antimicrobiano pero todavía no se conoce muy bien su forma de acción, pero se
sabe que el componente responsable de esta actividad antimicrobiana es
el
eugenol. Kamel y col. 2007, determinaron la acción antibacteriana del eugenol
53
= Page 47 =
extraído del clavo sobre S.epidermidis, E.coli, S.aureus, L.monocytogenes,
E.fecalis, P.aureginosa, S.typhimurium M.luteus, y y determinaron que el me
nor
diámetro de inhibición fue de 8 mm. Para L.monocytogenes el halo de inhibición
por parte del A.E fue de 15 mm con una DS (desviación estándar) de 0, dando un
resultado muy bueno al compararlo con la gentamicina que dio como resultado un
halo de 38mm sobre este mismo microorganismo.
En otro estudio Fu y col. 2007, realizaron un estudio de la activida
d
antimicrobiana del clavo sobre S.epidermidis, E.coli, S.aureus, P.auregin
osa,
B.subtilis P.vulgaris y encontraron que a menor halo de inhibición fue de 9mm
para P.aureginosa y el mayor fue de 18.2mm para P.vulgaris lo cual fu
eron
resultados óptimos teniendo como control la estreptomicina.
2.4.1.3 Tomillo (Carvacrol y Timol)
El tomillo es una especia proveniente de las plantas del género Thymus spp, y
se
le atribuyen propiedades antiespasmódica, expectorante, antiséptica,
antiinflamatoria y otras más (Ettayebi et al. ,1999; López, 2006; Bounatirou et
al. ,
2007). El tomillo es usado en la industria alimentaria como agente saborizante y
aromático y en las preparaciones farmacológicas su aceite esencial esta en
le
ranking de los 10 aceites esenciales más usados en el mundo (Solomakos et al. ,
2007; Rasooli et al. , 2005).
Se sugiere que la presencia y el número de grupos hidroxilo sobre el grupo fenol
de estas moléculas está relacionado con su toxicidad: una mayor hidroxilación es
responsable de una mayor capacidad bactericida. La presencia del grupo hidroxilo
en la molécula de carvacrol, al igual que en el timol, provoca la entrada y el
escape de iones potasio (Figura 13), que conlleva a la disminución del pH, el
aumento en el gasto de energía (ATP) y, finalmente, la muerte celular
del
patógeno. (Castillejos, 2005).
54
= Page 48 =
Figura 11. Esquema sugerido de acción sugerido para el carvacrol sobr

e la
membrana citoplasmática (Castillejos, 2005)
El aceite esencial que se obtiene del tomillo esta compuesto por 60 componentes
(Solomakos et al. , 2007) de los cuales 32 fueron identificados por Bounatiro
u, y
col. 2007. Los componentes mayoritarios y a los cuales se les atribuy
e la
capacidad antibacteriana son el timol y el carvacrol y se da alguna responsabili
dad
minoritaria a los componente minoritarios como lo son el p-cimeno, -terpineno y
?
? -caryphyleno los cuales pueden actuar de manera sinérgica con el timol y el
carvacrol aumentando su capacidad antimicrobiana (Bounatirou et al. ,
2007;
Solomakos et al. , 2007). Muchos autores discrepan sobre cual es el component
e
mayoritario del tomillo (timol ó carvacrol) y dan diferentes porcentajes
de
presencia de cada uno. Burt, 2004, en su revisión da que el timol esta entre un 10
a un 64%, el carvacrol está entre un 2 a 11%, el -terpineno entre un 2 a 31% y

?
que el p-cimeno esta entre un 10 a 56%, por otro lado Bounatirou, y col. 2007,
comentan que el p-cimeno está en mayores cantidades cuando el carvacrol está en
menores cantidades y esto se presenta cuando la parte de la planta que se usa pa
ra
la extracción del aceite esencial es muy joven, y aseveran que este aceite es el
precursor del carvacrol.
El timol (figura 14) y el carvacrol (figura 15), son compuestos fenólicos que son
similares estructuralmente difiriendo en la posición del grupo hidroxilo. Como ya
55
= Page 49 =
se dijo en el apartado anterior, los compuestos con estructura fenólica poseen una
mayor actividad antimicrobiana que los que no la poseen y la presenci
a y
localización del grupo hidroxilo es un factor importante en esta activid
ad,
Algunos investigadores, observaron que el carvacrol y el timol actuaban de forma
diferente frente a microorganismos Gram positivos y negativos, también en otros
estudios no se observó la importancia de la posición del grupo hidroxilo, y la
capacidad antimicrobiana del timol y carvacrol fue similar (Castillejos, 2005).
Figura 12. Timol
Figura 13. Carvacrol

El carvacrol y el timol aumentan la permeabilidad de la membrana celu
lar
desintegrando la membrana externa de las bacterias Gram negativas, liberando los
lipolisacáridos (LPS) y aumentando la permeabilidad de la membrana
citoplasmática a ATP (Castillejos, 2005; Burt, 2004). Las mediciones de ATP
56
= Page 50 =
interno y externo revelaron que el ATP celular interno disminuía mientras que no
había un aumento proporcional en el exterior celular, de acuerdo a esto
se
presume que la tasa de síntesis de ATP disminuyo o que la tasa de hidrólisis de
ATP incrementó. En un estudio, se evidenció que las toxinas diarreicas de
B.cereus se vieron inhibidas por la presencia de carvacrol tanto en
medio de
cultivo como en sopa y esto puede deberse a que la excreción de la toxina es un
proceso activo, y de acuerdo a las dos presunciones anteriores no hay suficiente
ATP o fuerza protonmotriz (FPM) para exportarla fuera de la célula.
Alternativamente el crecimiento específico da a teorizar que la célula usa
la
energía (ATP) para mantener las funciones vitales para sostener su viabilidad,
dejando a un lado la producción de toxinas (Burt, 2004).
El carvacrol interactúa con la membrana uniéndose a la bicapa de fosfolípidos,
provocando la desestabilización de la misma, aumentando su fluidez e
incrementando la permeabilidad pasiva. También, se ha observado el paso
de
metabolitos celulares a través de la membrana celular. El potencial de membrana
también disminuye, debilitando la FPM y el gradiente de pH a través de
la
membrana (Catillejos, 2005). Se concluye por tanto que el carvacrol crea canales
a través de la membrana empujando las cadenas de ácidos grasos de los
fosfolípidos, permitiendo que los iones abandonen el citoplasma (Burt, 2004).
Por otro lado, el timol se une a las proteínas de membrana de manera hidrofóbica
y por puentes de hidrogeno, lo que cambia las características de la permeabilidad
de la membrana. Estudios demostraron, que el timol tiene un efecto más
inhibitorio en un pH de 5.5 que en uno de 6.5. Al estar en un pH acido la molécula
de timol se vuelve más indisociable y por tanto mas hidrofóbica, y por tanto se
puede unir mejor a las aéreas hidrofóbicas de las proteínas disolviéndose mejor en
la fase lípida (Burt, 2004) lo que puede apoyar la confirmación de la salida de
+
iones intracelulares de K (Castillejos, 2005) por el cambio de la permeabilidad
de
la membrana.
57
= Page 51 =
2.5 Modelo y distribución Weibull
El método convencional para calcular la eficiencia de la inactivación térmica de
los microorganismos en seguridad alimentaria, se basa en el método clásico de los
valores D y z, desarrollado por Bigelow, Ball y Stumbo (Stumbo,1973), el cual se
basa en la hipótesis de que las curvas de supervivencia microbianas y de esporas
bacterianas siguen una cinética de primer orden, apoyándose en el postulado de la
teoría mecanística en la cual la muerte celular es causada por la inactivación de
enzimas vitales ó de complejos enzimáticos.
En consecuencia, el valor D es estimado a partir de la relación lineal que existe
entre el logaritmo de la reducción decimal del número de microorganismos
supervivientes y el tiempo del tratamiento a una temperatura dada. En muchos
casos, en las curvas de supervivencia obtenidas a partir de tratamientos térmicos
no se observa una relación lineal, y por tanto no obedece una cinética de primer
orden, siendo normalmente observado los fenómenos de hombros (concavidades
hacia abajo) y colas (concavidades hacia arriba).
Se han desarrollado y propuesto gran variedad de modelos para la descripción de
las curvas de supervivencia no lineales, algunos de tendencia mecanística
o
pseudo-mecanistica o simplemente empíricos. La teoría mecanística postula que
todos los microorganismos de una misma población tienen la misma probabilidad
y por tanto existe una homogeneidad en la población. En contraposición a esta
esta sea pura, existe una variación biológica, en otras palabras, una
( )
muerte celular por la inactivación térmica no está gobernada por modelos
cinéticos de primer orden, hallándose más relacionada a una distribución
exponencial.
Existen gran variedad de modelos para sustentar esta teoría; entre estos el modelo
Weibull es el que gana en popularidad debido a su simplicidad y flexibilidad. Su
58
= Page 52 =
uso se debe a la aplicación del principio de la parsimonia, el cual postula: que p
ara
un problema existen dos ó más respuestas y entonces la más simple será la
correcta, argumentándose lo anterior en la teoría de la navaja de Ockham la cual
se fundamenta en igualdad de condiciones la
solución más sencilla es probablemente la correcta y No ha de presumirse la
existencia de más cosas que las absolutamente necesarias , indicado lo anterior
las explicaciones nunca deben multiplicar las causas sin necesidad. Lo anterior
en
pocas palabras indica que el modelo presenta mayor flexibilidad, robust
ez y
simpleza entre los demás modelos (Mafart et al., 2002; van Boekel, 2002).
El modelo proviene de ingeniería donde se usa para describir el tiempo de fallo en
sistemas mecánicos y electrónicos y es igualmente útil para el análisis de datos de
supervivencia en microbiología, como por ejemplo, el tiempo de muerte luego de
la aplicación de un estrés.
La forma acumulativa de la distribución de Weibull para el análisis de curvas de
supervivencia no lineales (Eq.1) fue empleada (Ruiz et al. , 2002):
= (1)
La cual fue modificada por Mafart et al. , 2002 (Eq.2) y esta última es la que
se
aplicará en la investigación para la modelización:
= (2)
Donde N o es el número inicial de microorganismos (CFU/mL), el número de N

supervivientes luego de un tiempo de exposición en un tratamiento térmico
t
(CFU/mL), () t
decimal o factor de escala, factor de forma (Mafart p et al. , 2002).
La distribución de Weibull puede ser:
59
= Page 53 =
a. Cóncava hacia arriba si <1 (Fig.16B), lo que indicaría que las células
p
supervivientes tienen menos probabilidad de morir, indicando que estas últimas
son las más resistentes ó tal vez se adaptan al tratamiento.
b. Cóncava hacia abajo si >1 (Fig.16A), que indicaría que las células supervivientes
p
se volverían mas termosensibles, en otras palabras; el daño acumulado provocado
haría más difícil que las células sobrevivan.
c. Y seguiría una distribución exponencial si =1 (Fig.16C), lo que indica que la
p
probabilidad de muerte de las células no depende del tiempo, o en otras palabras,
cada célula es igualmente susceptible no importando cuanto dure el tratamiento.
La hipótesis implícita es que no existe variación biológica, por lo que se ajustaría
a una cinética de primer orden clásica (valores D y z). (Mafart et al. , 2002; Va
n
Boekel, 2002; Chen and Hoover, 2004).
60
= Page 54 =
Figura 14. Ejemplo Modificado de concavidades (A) Concavidad hacia aba

jo
p >1, (B) Concavidad hacia arriba <1 (C)Distribucion exponencial =1. (Van
p p
Boekel, 2002).
61
= Page 55 =
2.6 Factor de exactitud (A ) f
La microbiología predictiva (M.P.) comprende el estudio de la respuesta
de
crecimiento o de inhibición de microorganismos patógenos o alteradores
presentes en alimentos en función de factores que la afecten (ºT, pH, a , etc.), y a
w
partir de estos datos predecir lo que sucederá durante el almacenamiento
,
procesado, etc.
La M.P. es una tecnología de vanguardia para el aseguramiento de la inocuidad
alimentaria, la optimización de procesos y recursos, y mejoramiento de sistemas
de gestión de la calidad; permite evaluar objetivamente y cuantitativamente el
efecto de las operaciones de procesamiento, distribución y almacenamiento en la
calidad microbiológica de los alimentos, usando modelos matemáticos y técnicas
computacionales.
La M.P. combina la matemática, la estadística, los sistemas de información y la
tecnología. Esto conduce al desarrollo de modelos, los cuales reducen el tiempo
de experimentación, los costos, el recurso humano y el material.
En la microbiología predictiva, es necesario que los modelos y las predicciones
realizadas sean lo más seguras posibles, y para esto es necesario tener un índice o
un valor que evalue los modelos indicando si el modelo es seguro y no tiende a
fallos o por el contrario es un modelo inseguro y con tendencia a fallar. Para e
sto
Ross, 1996 sugirió el Factor de exactitud (A ) (Eq.3) como índice de evaluación f
de los modelos:
log ( )/)
= 10 (3)
La ecuación 3 esta generada para modelos de crecimiento, y para esta
investigación se usara el modelo de exactitud modificado por Ruiz et al. , 2002
(Eq.4):
62
= Page 56 =
= 10 (4)
La ecuación 4 es más útil para la aplicación a modelos de inactivación térmica y
proporciona una medida de la media de precisión de las estimaciones, si el A >1
f
existe una correlación pero con cierta desviación, es decir, existe una b
uena
correlación entre los valores predichos y los experimentales pero no es exacta, si
A =1 existe una correlación exacta, denotando que los valores experimentales y f
los de la predicción encajan perfectamente, en ambos casos los modelos
son
seguros y la probabilidad de fallo es mínima; no obstante si Af<1 indica que no
existe correlación entre los valores predichos y los experimentales, y el modelo
puede ser inseguro, con tendencia a fallos.
63
= Page 57 =
3. JUSTIFICACIÓN
La integración de los mercados gracias a la globalización, y la nueva tendencia del
consumo de alimentos listos para consumir (precocinados, refrigerados o
congelados) que demanden un tiempo mínimo para su preparación y cocción antes
de su consumo, han incrementado el riesgo de las ETAs.
Uno de los principales patógenos de interés en la industria alimentaria es Listeri
a
monocytogenes , causante de la listeriosis. La mayor incidencia de esta enferme
dad
en humanos está asociada al consumo de alimentos contaminados con el
microorganismo debido a su presencia en gran cantidad de productos, gracias a su
capacidad de crecimiento y supervivencia a distintos tratamientos y en diversas
condiciones de almacenamiento.
En la actualidad, para la conservación de alimentos se utilizan tratamie
ntos
térmicos, los cuales afectan su calidad organoléptica y conservantes químicos que
son potencialmente peligrosos para la salud humana. Por lo anterior, l
os
consumidores de esta nueva era, demandan alimentos mínimamente procesados y
tratados, que posean sus características organolépticas intactas en lo posible, y
sean seguros para su salud. Por tanto, las técnicas de conservación a usar para
satisfacer las demandas del consumidor no deben ser agresivas y los conservantes
aplicados deben ser naturales; con la capacidad de prolongar la vida útil de los
alimentos en las despensas por un tiempo igual o mayor que los conservantes
químicos, salvaguardando principalmente la salud del consumidor.
Los tratamientos térmicos han demostrado ser efectivos para el control d
e
microorganismos patógenos alimentarios, pero el empleo de un único tratamiento
no es suficiente para asegurar su eliminación, por ende la combinación de
2
tratamientos es precisa para garantizar la inocuidad del alimento. Separadamente
,
la exigencia de alimentos mínimamente tratados y procesados por parte de los
consumidores, ha contemplado la necesidad de disminuir el tiempo y/o
la
potencia de los tratamientos térmicos junto con la eliminación de los conservantes
químicos, para proporcionar alimentos naturales con la mayoría de sus
64
= Page 58 =
características organolépticas intactas, por lo que se ha hecho urgente la
innovación de nuevas técnicas de conservación.
Desde tiempos antiguos, se conocen y reconocen las propiedades antimicrobianas
de muchas especias y hierbas usadas en los alimentos. La aplicación de
los
diversos componentes antimicrobianos naturales, que han sido usados en
los
alimentos para su conservación y sazonamiento, son el blanco y el objetivo de
muchas investigaciones, para determinar el efecto de éstos, sobre los
microorganismos patógenos de interés industrial, y su efectividad como
conservantes alimentarios.
Por estos motivos, se ha estudiado el efecto de los tratamientos térmic

os,
isotérmicos y no isotérmicos, por separado y en combinación con los aceites
esenciales de tomillo y clavo para el control de Listeria monocytogenes in vit
ro) ( ,
determinando el mejor tratamiento o la mejor combinación de tratamientos para
su aplicación sobre un alimento ( in vivo) , determinando el efecto y dando un g
ran
avance para el uso de estas sustancias en la industria alimentaria.
65
= Page 59 =
4. OBJETIVOS
General
Evaluar y determinar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos,
de manera individual y en combinación con los aceites esenciales de tomillo y
clavo en la supervivencia de Listeria monocytogenes.
Específicos
? Determinar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a
60ºC en la supervivencia de L.monocytogenes in vitro .
? Evaluar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a 60ºC
en combinación con diferentes concentraciones de aceite esencial de tomillo en la
supervivencia de L.monocytogenes in vitro .
? Evaluar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a 60ºC
en combinación con diferentes concentraciones de aceite esencial de clavo en la s
supervivencia de L.monocytogenes in vitro .
? Aplicar y evaluar las mejores combinaciones de tratamientos térmicos y aceit
es
esenciales de tomillo ó clavo en la supervivencia de Listeria monocytogenes en
un
alimento.
66
= Page 60 =
5. HIPOTESIS
La supervivencia de Listeria monocytogenes no se verá afectada
significativamente por los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos, ni por la
combinación de estos con los aceites esenciales de tomillo y clavo.
5.1 Predicciones
H = 0 Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC no afectarán de
manera significativa la supervivencia de L. monocytogenes.
H = a Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC afectarán de
manera significativa la supervivencia de L. monocytogenes.
H = 0 Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación
con los aceites esenciales de tomillo y clavo, no afectarán de manera significativ
a
la supervivencia de Listeria monocytogenes.
H = a Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación
con los aceites esenciales de tomillo y clavo, afectarán de manera significativa l
a
supervivencia de Listeria monocytogenes.
67
= Page 61 =
6. MATERIALES Y METODOS
6.1 Materiales
6.1.1 Microorganismo
Se utilizó la cepa de Listeria monocytogenes CETC 4032, procedente de
la
Colección española de cultivos de tipo CECT (Valencia, España), la cual se activo
en caldo B.H.I y luego se realizo aislamiento en placas de agar Oxford, estas
placas se mantuvieron en refrigeración durante la experiencia, y se criopreservó el
microorganismo en tubos ependorf a -80ºC, garantizando su pureza.
6.1.2 Medios de cultivo
Los medios de cultivos utilizados pertenecen a la casa comercial Scharlau Chemie
S.A. (Barcelona, España)

? Agua de peptona tamponada: peptona 10 g/L, cloruro de sodio 5 g/L, fosfa
to
disodico 9 g/L, fosfato potásico 1.5 g/L.
? Caldo infusión cerebro corazón (B.H.I.): extracto de cerebro 12.5 g/L, extra
cto
de corazón 5 g/L, peptona 10 g/L, dextrosa 2 g/L, cloruro de sodio 5 g/L, fosfato
di-sodio 2.5 g/L.
? Agar infusión cerebro corazón (B.H.I.A.): extracto de cerebro 12.5 g
/L,
extracto de corazón 5 g/L, peptona de proteasa 10 g/L, dextrosa 2 g/L, cloruro de
sodio 5 g/L, fosfato di-sodio 2.5 g/L, agar 15 g/L.
? B.H.I.A. 5% NaCl: agar B.H.I.A suplementado con cloruro de sodio
en
porcentaje m/v (el cloruro de sodio que se usara es de la casa comercial Panreac
química S.A.).
68
= Page 62 =
6.1.3 Aceites esenciales
Los aceites esenciales de tomillo y clavo usados en esta investigación provinieron
de la casa comercial IBERCHEM y se conservaron a temperatura de refrigeración
(2-5ºC aprox.) para evitar su evaporización.
6.1.4 Equipos
? Termorresistómetro Mastia (patente española 200302529)
? Centrifugadora: Heraeus labo fuge 400R. (Kendro laboratory products)
? Incubadora
? Vortex
? Autoclave
? Baño termostatado.
? Nevera
? Dataloger
6.1.5 Materiales
? Cajas de petri 14 x 90 mm
? Frascos tapa rosca de 500 mL
? Frascos tapa rosca de 100 mL
? Tubos de 16 x 150 mm
? Tubos 12 x 75 mm
? Asa.
? Balanza
? Microscopio
? Pipeta automática de 10 a 100 L y de 100 a 1000 L ? ?
? Puntas para pipetas automáticas
? Gradillas
? Mechero
69
= Page 63 =

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EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS

ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique na

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

Con el descubrimiento de los microorganismos gracias a la invención del

Desde aquellos tiempos hasta la actualidad el ser humano se ha visto favorecido

El género Listeria spp. presenta una temperatura mínima de crecimiento de 0.4ºC

Figura 1. Habitat de L.monocytogenes y vias de contaminación (Reguera et al.

Se han aislado colonias de L.monocytogenes , de agua por la descongelación de

L.monocytogenes por ser un microorganismo ubicuo puede contaminar a las vacas

La mayoría de pruebas, protocolos y test usados para la detección de

Dentro del fagosoma la bacteria queda englobada alrededor de 30 minutos en el

haya consumido una alta dosis de Listeria monocytogenes (Garza et al. , 2

Figura 5. Representación esquemática de la fisiopatología de la infección por

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Figura 6. Gráfica de supervivencia (Palop, 2007)

D = x/Log(N /N ) ó D =-1/m (donde T 0 X T m es la pendiente de la

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El eugenol pertenece al grupo de los fenilpropanos que son sustancias

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Figura 12. Timol

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Donde N o es el número inicial de microorganismos (CFU/mL), el número de N

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Por estos motivos, se ha estudiado el efecto de los tratamientos térmic

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