GUÍA DE PRÁCTICAS

FACULTAD: FICIAB CARRERA: Ingeniería Bioquímica

NIVEL: Octavo ASIGNATURA: Ingeniería de TIPO GUÍA DE PRÁCTICAS:
las Enzimas Laboratorio
DOCENTE: Mg. Cecilia Carpio CICLO ACADÉMICO: Septiembre 2019-Enero2020
AYUDANTE:

I. TEMA: “ESTABILIDAD FRENTE AL pH”

II. OBJETIVO:
 Determinar el efecto del pH del medio en la actividad de la enzima en estudio.
 Estimar el pH óptimo de la enzima.
III. INSTRUCCIONES: Use mandil, guantes, gafas, mascarilla y la sorbona. Registre todos los datos y
observaciones en el cuaderno de laboratorio. RECUERDE: en el informe todos los gráficos y tablas
deben ir precedidos de una breve descripción. Utilice referencias de bibliografía especializada y libros
de la biblioteca virtual para la discusión de resultados.
IV. LISTADO DE EQUIPOS MATERIALES Y RECURSOS:
Materiales
 Medidor de pH
 Pipetas serológicas de 1 mL y 5mL
 Micropipeta de 100-1000 µL
 Plancha de calentamiento con agitación
 Agitador magnético
 Baño María a ebullición
 Cronómetro
 Tubos bacteriológicos con tapa de 15 mL
 Tubos de vidrio de 10-15 mL
 Centrífuga y tubos de centrífuga de 14 mL
 Espectrofotómetro de VIS y celda de metacrilato
 Balanza analítica
Enzima
 Invertasa de levadura
Reactivos
 Ácido acético 0,04 M
 Acetato de sodio 0,04 M
 Ácido cítrico 0,05 M
 Manitol 0,5 M
 Fosfato dibásico de sodio 0.1 M
 Sacarosa para análisis (o micropulverizada)
 Solución de DNS
a. Ácido 3,5 dinitrosalicílico
b. NaOH 2 M
c. Tartrato de sodio y potasio
 Agua destilada
V. ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
A. Preparación de soluciones
 Soluciones tampón citrato – fosfato de pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0 (25 mL):
Mezclar las soluciones de ácido cítrico (0,05 M) y fosfato dibásico de sodio (0,1 M) de modo que el
pH final de cada una de ellas alcance los valores antes indicados.
  Adicionalmente para conservar la estabilidad de la enzima se debe añadir manitol 0,5 M (C 6H14O6)
en la misma proporción que se mezclaron las soluciones tampón.
 Soluciones de sacarosa al 1% (15 mL) en cada uno de los tampones citrato-fosfato: pesar la
cantidad de sacarosa correspondiente y disolver en 15 ml de tampón citrato-fosfato-manitol.
 Solución de enzima 1/20 en cada tampón (2 mL): Pesar 0,1 mL del extracto de enzima en 9 tubos
de vidrio de 10 o 15 mL. Registrar el peso. Añadir 1,9 mL del tampón correspondiente justo antes
de realizar la prueba de actividad. Registrar el peso total.

B. Determinación de la actividad a 20 °C (temperatura ambiente)

Colocar en una gradilla 36 tubos bacteriológicos perfectamente lavados y marcados con el valor de pH,
4 tubos por cada valor de pH incluido un blanco.
Añadir a cada tubo 0,15 mL de la solución de sustrato. Agregar 0,15 mL de la solución de enzima a
cada una de las réplicas (3), dejar que la reacción proceda durante 3 minutos y detener la reacción con
la adición de 0,3 mL de solución de DNS.
Mezclar bien, hervir por 5 minutos, enfriar, añadir 3 mL de agua destilada y leer la absorbancia a 540
nm.
Para la preparación del blanco se debe invertir el orden de adición de los reactivos empezando con la
adición de la enzima en solución tampón citrato-fosfato-manitol, luego de ello se debe agregar DNS, se
debe mezclar y finalmente se debe añadir la solución de sacarosa 1%.
NOTA: se debe preparar un blanco para cada valor de pH.
C. Preparación de la curva estándar de Glucosa
Utilizar los valores de absorbancia y concentraciones de la curva estándar de glucosa de prácticas
anteriores.
VI. RESULTADOS OBTENIDOS:
 Obtener el perfil de pH (Gráfico de velocidad inicial vs pH), incluir la ecuación de regresión que
mejor se ajuste al gráfico y las barras de error.
 Comparar
 Reportar el valor de pH óptimo.
DISCUSIÓN
 Comparar con valores encontrados en bibliografía para esta enzima a la temperatura utilizada en la
práctica. RECUERDE emplear bibliografía existente en la biblioteca de la FCIAL.
VII. CONCLUSIONES:
Formular las conclusiones en relación a los objetivos planteados, de forma clara y concisa.
VIII. RECOMENDACIONES:
Establecer las recomendaciones que se desprendan del trabajo realizado.

VALIDACIÓN DE LAS GUÍAS DE PRÁCTICAS

Fecha de elaboración: 30 de diciembre del 2019.