UNIVERSIDAD DE LA SALLE

FACULTAD DE INGENIERIA
Departamento de ingeniería de alimentos

CONCEPTOS BASICOS DE ESPECTROFOTOMETRIA

OBJETIVO
El estudiante analizara las leyes físicas que rigen a la espectrofotometría,
identificara las partes de un espectrofotómetro y realizara una curva de calibración
para observar el cumplimiento de la ley de Beer.

MARCO TEORICO
La luz es una forma de radiación electromagnética. La longitud de onda, expresada
por el símbolo , se define como la distancia entre dos picos de una onda medida
en la dirección de su progresión. Para el cálculo de las longitudes de onda se usa
la unidad de nanómetros (nm que equivalen a 10 -9 m). Además, la luz que el ojo
humano puede percibir se llama luz visible.

En los ensayos bioquímicos la espectrofotometría se usa generalmente para las

longitudes de onda de luz ultravioleta que corresponden a la región de 185-400 nm,
las de la luz visible corresponden a una banda de longitud entre la región de 400-
700 nm y la longitud de onda en la franja infrarroja que se la región del espectro de
radiación electromagnética de 700-15000 nm.

La longitud de onda de la luz es inversamente proporcional a su energía según la

ecuación
ch
E

Donde: c: velocidad de la luz
h: constante de Planck
E: energía
: Longitud de onda

Es decir, que la radiación UV tiene más energía que la visible y la radiación visible
más que la infrarroja; entonces, la luz de determinadas sustancias a una cierta
longitud de onda es absorbida selectivamente (absorbancia), de acuerdo con la
estructura molecular que esta posea. Entonces, la absorción de la energía de la luz
ocurre cuando la incidencia de los fotones que acarrean energía es igual a la
diferencia entre la energía de dos estados de valencia de los electrones, el fotón
promueve la transición de un electrón desde ele estado de energía más bajo hasta
el más alto.

1
Por tal razón, la espectrofotometría en bioquímica podría referirse como la
espectroscopia de absorción electrónica. Entonces, la evaluación de la absorción
espectrofotométrica es de las técnicas de espectroscopia visible y de UV mas
usadas en bioquímica en la determinación cuantitativa de las especies cromóforas.
Todo método espectrofotométrico que mida absorción sigue la ley de Beer-
Lambert.

En el rango de la luz ultravioleta de cuarzo, la absorción se debe a la excitación de

los electrones de enlace y a los no enlazados de los “hetero-átomos”.
Un gran número de compuestos presentan puntos máximos de absorción en el Uv,
con una absortividad molar de 1000 a 10.000, razón por la cual las muestras se
deben someter antes a purificación o eliminación de impurezas.

LEYES QUE RIGEN LAS DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS

Al incidir un rayo de luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un
medio absorbente; la absorbancia (A) está determinada por la concentración de la
sustancia responsable de la absorción, la intensidad constante y distancia recorrida
del rayo incidente (Po) sobre la sustancia (b) y la longitud de onda de esta (Ley de
Beer-Bouguer-Lambert).

Al incidir un rayo de intensidad Po, la intensidad que sale del medio se denomina
intensidad transmitida Pt. La relación Pt/Po se denomina TRAMITANCIA (T).

Entonces, T= Pt / Po A= 2- log%T

La tramitancia (T) relacionada a 100 se denomina porcentaje de transmitancia

(%T), esta se determina por medio del espectrofotómetro.

La Absortividad molar (€): es la relación entre la absorbancia y el producto de la

longitud de paso óptico, b, por la concentración c, es decir:
A
€ o A  € b C
b C

REACTIVOS

Solución coloreada, permanganato de potasio (KMnO 4) 10 mM

MATERIALES
(1) Espectrofotómetro
(1) Pipetas de 1,5 y 10 mL
(2) Vasos de precipitados de 50 mL
(1) Balanza analítica
(1) Espátulas
(2) Celdas espectrofotométricas
(15) Tubos de ensayo – gradilla
(1) Balón aforado de 100 mL

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(1) Pera de succión
(1) Frasco lavador

PROCEDIMIENTO

1. DETEMINACION DE LAS PARTES DEL ESPECTROFOTOMETRO.

Observar cada una de las escalas que se encuentran en el espectrofotómetro y

anótelas. Indicar ¿Cómo se realiza la conversión matemática de una escala a la
otra? Si se va a trabajar en la región de 600 nm a 960 nm de longitud de onda se
debe usar un ___________________ como detector y _________________ para
eliminar las radiaciones de longitudes menores.

2. FACTORES DE DILUCION

A partir de la solución coloreada de 10mM:

Realizar los cálculos correspondientes para obtener las siguientes diluciones.

1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 1:12 1:14 1:16 1:18 1:20

Luego proceder a realizar los cálculos para la preparación estas diluciones, escribir
sus resultados en la tabla 1.

Determinar la concentración en cada una de estas diluciones.

Tabla 1.
Volumen
Dilución Factor preparado Concentración
de (mM)
dilución Volumen Volumen
soluto solvente
1:1
1:2
1:4
1:5
1:6
1:8
1:10
1:12
1:14
1:16
1:18
1:20

Volumen final preparado para cada dilución:___________________

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3. DETERMINACION DE LA GRAFICA ESPECTRAL

Con la absorbancia a diferentes condiciones de longitud de onda de una sistemas,

se puede determinar el rango optimo de lectura de una o varias concentraciones,
es decir, el rango de longitud de onda o la longitud máxima a la cual se puede
aplicar la lectura cuantitativa (determinación de la absorbancia) de una muestra
desconocida, dicha medición se da con un mínimo error en el momento de la
lectura.

Por ejemplo, se ha calculado que el rango optimo de medición de la enzima

polifenol oxidasa de la manzana es de 390 a 480 nm 3.
Primero, preparar un blanco con el que se calibrara el equipo, el cual es el sistema
solvente con el que se ha diluido la muestra. Ver tabla 2.

Para la determinación de la máxima longitud de onda y los rangos óptimos de

lectura se proceden así:

Tomar la dilución 1:2 y realizar las mediciones de la absorbancia en toda la región

visible, teniendo en cuenta que las lecturas en esta se deben hacer con intervalos
de 10 nm en la longitud de onda.

Luego, calibrar el equipo para efectuar correctamente las lecturas. La calibración

del equipo se hace de la siguiente forma:

1. Poner en funcionamiento el espectrofotómetro, permitir que por 15 minutos

se estabilice el equipo.

2. Escoger la longitud de onda para comenzar a medir la absorbancia.

3. Colocar el blanco en la cubeta espectrofotométrica.

4. Limpiar bien esta cubeta e introducirla en el espectrofotómetro.

5. Calibrar el equipo con este blanco haciendo que la aguja del galvanómetro
llegue al 100% de T y la absorbancia maque cero (0).

6. Una vez se tenga el espectrofotómetro calibrado, en la primera longitud de

onda, es decir, 450 nm, sacar la celda y medir inmediatamente la
absorbancia (A) de la muestra.

Realizar esta misma operación de calibración cada vez que se lea en una nueva
longitud de onda, hasta completar la medición de la absorbancia de esta muestra
en todo el rango visible.

Anotar los valores de A y %T obtenidos con esta dilución en la tabla 2.

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Graficar %T vs.  y A vs. .

Tabla 2.
Longitud de onda () Absorbancia (A) Transmitancia (%T)
450
460
470
480
490
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
610
620

Entonces, el rango óptimo de lectura de la solución coloreada que se uso en la

práctica es de ___________nm a ____________ nm.

Y la máxima longitud de onda (m) para esta solución es de: _____________

4. DETERMINACION DEL INTERVALO ÓPTIMO DE CONCENTRACIONES

(CURVA DE RINGBOM)

Un sistema cumple la ley de Beer solo en un determinado rango de

concentraciones. Este se puede calcular o determinar, haciendo una grafica del %
T vs., Log C, denominada curva de Ringbom, la cual tiene una parte recta que está
delimitada por la Cmin y la Cmax del rango optimo. Además, se puede calcular el
porcentaje de error relativo del método utilizando la ecuación:

230.3Ei
C / C 
m
Donde
%T2  %T1
m
log C2  log C1

mC / C
Ei 
230.3

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Donde Ei es el error instrumental y m es el valor absoluto de la pendiente en la
parte recta de la curva de Ringbom.

Para realizar esta determinación, se debe medir la transmitancia de cada una de

las diluciones que se prepararon anteriormente en esta practica y calcular para
cada una de ellas el logaritmo de su concentración

Registrar sus resultados en la tabla 3.

Tabla 3.
Concentración Transmitancia
Diluciones (mM) Log C (%T)

Graficar el %T vs. Log C, para obtener la curva de Ringbom, luego halar en

ella la parte recta y así determinar el rango de C mínima y C máxima de la
solución coloreada usada en esta práctica.

El rango para esta solución está entre ________________ y ______________

Error fotométrico

Como se menciono anteriormente, un sistema cumple la ley de Beer solo en un

determinado rango de concentraciones, ya que el instrumento está limitado para
detectar la potencia transmitida por una solución. El equipo produce un error que se
denomina error fotométrico, este incide en la absorbancia o transmitancia de las
concentraciones, dicho error se comete al analizar una muestra desconocida. El
error fotométrico no es igual para todas las lecturas que da el instrumento, sino que
es función de este.

Para la mayoría de los equipos comerciales el error fotométrico se puede

considerar constantes en el rango de valores de transmitancia de 15% a 80%; pero
con los de muy alta calidad se puede obtener un rango de 10 a 85%. El valor de la
transmitancia que teóricamente produce el menor error relativo es de 36.8%.

Calcular el porcentaje de error relativo del método en esta práctica.

5. DETERMINACION DE LA GRAFICA DE CALIBRACION

A partir de la determinación del rango óptimo de concentraciones con la grafica de

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Rongbom, se realiza una curva de calibración tomando las concentraciones que se
encuentren en este rango óptimo, para luego medir su absorbancia y observar el
cumplimiento de la ley de Beer.

Con los resultados se grafica A vs. Concentración (C) y se obtiene una línea recta,
que indica la relación directa entre la A y la Concentración.

Para la realización de esta curva se debe:

Fijar en el espectrofotómetro la máxima longitud de onda (max), que se hallo en la

grafica espectral.

Realizar los cálculos necesarios para obtener las concentraciones que se

emplearan en la curva de calibración y hacer las diluciones correspondientes que
se usaran.
Marque los tubos con las concentraciones respectivas.

Leer la Absorbancia de cada de las diluciones preparadas.

Registrar los resultados de los cálculos y las lecturas de la A en la tabla 4.

Calcular la Absortividad Molar (€) de la solución coloreada, KMnO 4, 10 mM.

Tabla 4.
Concentración Factor de Absorbancia Transmitancia
(mM) Dilución (A) (%T)

10 mM (Patrón)

Absortividad molar (€) de la muestra patrón: __________________

Graficar A vs. Concentración (C), realizar el análisis, con una regresión lineal y la
ecuación de la recta, si la curva de calibración no presenta un r= 0.99998, hacer el
ajuste a la curva de calibración así:

1. Los datos de absorbancia que se obtuvieron para los respectivos patrones

se multiplican por la concentración de estos ( A x C)
2. La concentración de cada patrón se eleva al cuadrado (C 2),
3. Obtener las sumatorias de C2 y A.
4. Dividir ∑A x C / ∑C2, para obtener un valor de corrección (W)

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 5. Este valor de corrección (W) se multiplica por cada concentración para
obtener la absorbancia corregida (A).

Se debe tener en cuenta los valores limites del rango optimo, para eliminar los
datos muy dispersos.

Realizar el grafico corregido de la A vs. C

Explicar claramente el cumplimiento y las desviaciones de la ley de Beer – Lambert

que se observan en estas graficas.

6. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA

PROBLEMA EN UN ESPECTROFOTOMETRO

La curva de calibración no solo permite ver los posibles errores que se puedan
incurrir en las diluciones realizadas, en el momento de la lectura o el estado de
calibración del equipo, también determinar la concentración de una muestra
problema que posea características químicas semejantes al sistema usado para
hacer la curva de calibración. Entonces, una vez se tenga la curva de calibración se
debe:

1. Tomar la muestra problema y leer su A de esta muestra a la misma longitud

de onda con la cual se realizo la curva de calibración y hallar el %T
2. Registrar los datos en la tabla 5.
3. Sobre la curva de calibración hallar la concentración de la muestra problema,
para ello se debe interpolar el dato de la A de la muestra problema en la
curva, o calcular su concentración aplicando la siguiente fórmula:

Au  intercepto(curva _ calibracion)
Cu 
pendiente

Para comprobar la concentración obtenida usar la ecuación de la recta. Hallar la

absortividad molar de la muestra problema.

Tabla 5.
Absorbancia Transmitancia Concentración Absortividad
(A) (%T) (mg/mL) Molar (€)

ACTIVIDADES

Cada resultado debe estar planteado en las tablas de esta guía, así mismo se
deben anexar los cálculos realizados en la práctica y las graficas.

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Analizar claramente cada una de las graficas de la práctica, y confirmar el
cumplimiento de la ley de Beer – Lambert.

1. Consultar el espectro de luz (rango relectura espectrofotométrica) a los

siguientes cromóforos moleculares

A. Aminoácidos
B. Proteínas
C. Ácidos nucleícos
D. Carotenoides
E. NAD (P(H
F. Grupo hemo

2. ¿Qué tipo de sustancias reaccionan con las proteínas para que se puedan
determinar por espectrofotometría?

3. ¿Cuál es el principio básico de cada uno de estas sustancias?

4. ¿Cuál relación existe entre el color de las muestras y la longitud de onda de

trabajo? Presente ejemplos.

5. ¿Cuáles son las desviaciones de la ley de Beer – Lambert?

6. ¿Cuál es el significado de la absortividad molar €?

7. ¿Qué otros aplicaciones de espectrofotometría existen? Explíquelas.

BIBLIOGRAFIA
GORE, M,G. Spectrophotometry and Spectrofluorimetry. Ed Oxford University Press.
United Kingdom, 2000.

P. Atkins y J. de Paula, physical Chemistry, 9 ed.; Oxford Univ. Press, Oxford, 2009.

T. Owen, Fundamentals of UV-visible spectroscopy; Agilent Technologies, 2000.

http://www.chem.agilent.com/en-
US/Search/Library/_layouts/Agilent/PublicationSummary.aspx?whid=16907&liid=7

TORRENEGRA, Rubén Darío. Curso de Introducción al análisis químico moderno.

Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias Básicas. Departamento de química.
Bogota: Publicaciones Javegraf, 1983. p. 13-23.