TITULACIÓN DE ANTICUERPOS

La importancia del seguimiento en condiciones de

sensibilización
 OBJETIVOS DELA
OBJETIVO DE LACLASE
CLASE
Revisar:
• Métodos para realizar titulación de
anticuerpos.
• Aplicación clínica de la técnica de titulación
 Titulación
DEFINICIÓN TITULACIÓN

Método semicuantitativo que se emplea para determinar la

concentración de anticuerpos presentes en una muestra clínica, o
bien, para comparar la intensidad de expresión antigénica en
distintas muestras de GR.
 UTILIDAD TITULACIÓN

Actividad de Anticuerpos Irregulares en embarazadas sensibilizadas

Definir la especificidad de Autoanticuerpos

Caracterizar anticuerpos con ↓ título y ↑ avidez.

 TITULACIÓN DE ANTICUERPOS MATERNOS

La titulación juega un rol importante durante el

embarazo en aquellas futuras madres que están
sensibilizadas, así como también, en aquellas que
están expuestas a estarlo ….. ¿¿Por qué??

La titulación es útil para decidir la

realización, en el momento oportuno, de
procesos invasivos, en especial, si se
sospecha de un anti-D.
 Introducción
EHRN
• El proceso patológico esta caracterizado por la
incompatibilidad de uno o varios antígenos eritrocitarios
entre la madre y el feto.
• Mecanismos de inmunización materna:
1. Enfermedad hemolítica por anti-D, o a menudo,
combinado con anti-C o anti-E.
2. Enfermedad hemolítica secundaria a anticuerpos contra
otros Ag del sistema Rh o de otros sistemas, como lo es
con mayor frecuencia anti-c y anti-K.
3. Enfermedad hemolítica ABO, provocada por anti-
A/anti-B en mujeres grupo O.
 Etiopatogenia
ETIOPATOGENIA EHRN
• Presencia de anticuerpos maternos en circulación fetal, los
cuales son causantes de la destrucción de GR fetales.
• Estos anticuerpos reconocerán antígenos (de origen paterno)
presente en los GR fetales, ausente en la madre, y su
existencia puede ocurrir de manera natural como en EHRN-
ABO.
• O bien, producto de una inmunización o gestación previa 
EHRN-Rh.
 ETIOPATOGENIA EHRN

 En todas las enfermedades

EHRN, exceptuando ABO, los
anticuerpos maternos reflejan la
aloinmunización por embarazo o
transfusión.
1. Embarazo: inmunización cuando
los GR fetales con Ag paternos
extraños para la madre ingresan
a circulación materna producto
de una hemorragia fetomaterna.
El evento mas común es el parto
 ETIOPATOGENIA EHRN

• Especificidades inmunogénicas
Etiopatogenia • Los Ags inductores mas
frecuentes de inmunización son
los D.
• Como otros Ag eritrocitarios son
menos inmunogénicos que los D,
la sensibilización dependerá de
los volúmenes de sangre
involucrados, por ejemplo: una
transfusión.
• La inmunización a los Ag D podría
generarse con cantidades de
sangre fetal inferiores a 0.1 mL.
 ETIOPATOGENIA EHRN
• Efecto de incompatibilidad ABO
• La incompatibilidad ABO entre la madre y el feto ejerce
un efecto protector sustancial, pero no absoluto, contra
la inmunización materna, en virtud de la mayor tasa de
destrucción de los GR por anti-A o anti-B. La frecuencia
de inmunización disminuye del 16% al 1.5 o 2%.
 ETIOPATOGENIA EHRN
• 2. Transfusión: el riesgo de
inmunización a Ag eritrocitarios
después de una transfusión de GRs
alogénicos es del 1% al 2.5%. Este
evento solo es riesgoso para el feto si
los Ac son IgG contra Ag GR fetales.
• Si una pareja planifica tener hijos, ella
no debe recibir sangre de su pareja ni
de sus familiares directos, ya que
incrementa el riesgo de inmunización
materna contra Ag eritrocitarios
(leucocitarios o plaquetarios) paternos.
ETIOPATOGENIA EHRN

Madre Rh(-) gesta un feto

Rh(+), presentando además
anticuerpos anti-RhD.
Clase IgG  atraviesan
placenta.
Llegan a circulación fetal
generando una destrucción
de GR fetales.
 ETIOPATOGENIA EHRN

Aunque la aloinmunización puede

generarse durante el embarazo, el
paso más importante en cantidad
de GR fetales a la circulación
materna tiene lugar durante el
parto.
El feto puede estar ligero o
gravemente afectado dependiendo
de la cantidad de anticuerpo al cual
haya sido expuesto.
ETIOPATOGENIA EHRN

Destrucción de GR fetales en el bazo

Anemia, eritroblastosis

↑[Bilirrubina NC]

Neurotoxicidad Kernicterus
 TITULACIÓN DE ANTICUERPOS MATERNOS

Como los estudios invasores se realizan después

de las 16-18 semanas de gestación, no se deben
efectuar titulaciones antes de esta fecha.
Cuando se realiza la titulación, es de gran
importancia:
- Emplear los mismos métodos.
- Realizar la evaluación con la muestra anterior
(congelada).
 TITULACIÓN DE ANTICUERPOS MATERNOS

Se realiza para identificar a las mujeres con

niveles significativos de anticuerpos que podrían
llevar a una EHRN, y en caso de títulos bajos,
establecer un valor basal para comparar con los
posteriores.
 TITULACIÓN DE ANTICUERPOS MATERNOS

Muestras Reactivos
Suero para titulación  SAGH
1mL Solución Salina Tamponada (PBS)
Muestra anterior GR O (2-5%)
(congelada) GR recubiertos con IgG
Pipetas

Evaluar la muestra previamente, tanto la actual como la anterior.

 Procedimiento
PROCEDIMIENTO

Rotular 10 tubos de acuerdo a la dilución del suero

(SM, 2,4,8,16,32,64,128,256,512,1024)

Solución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/512 1/1024

1/128 1/256
Madre

0.5 mL Suero

Suero
PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS
0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL

0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
 Procedimiento
PROCEDIMIENTO

Repetir el paso anterior para todas las diluciones, cuidando siempre utilizar una
pipeta limpia para mezclar y transferir al siguiente tubo.

Marcar 10 tubos con las diluciones realizadas.

Transferir 2 gotas de suero diluido en cada tubo según corresponda (usar siempre
pipeta nueva entre cada tubo)
 Procedimiento
PROCEDIMIENTO

Agregar 1 gota de GR suspendidos 2-5%.

Mezclar e Incubar según técnica empleada para Detección/Identificación de

Anticuerpos.

Observar resultados y realizar registro.

 Procedimiento
PROCEDIMIENTO
¿QUE GLOBULOS ROJOS UTILIZAR PARA UNA
TITULACION?

Por concenso  R2R2 

Tanto para anti-D como para
cualquier Ac.

Otra opción ….

R1r  Se busca el fenotipo

que se espera tener en la
circulación del feto.
 PROCEDIMIENTO
Se recomienda comenzar desde la dilución mas
alta  MAS DILUÍDO
Confirmar reacciones negativas con GR recubiertos con IgG

¡¡¡ SIEMPRE CONFIRMAR !!!

 Interpretación
INTERPRETACIÓN
 Observar la dilución más alta que produce aglutinación
1+.
 El titulo se informa como la inversa de la dilución mas
alta que revela la aglutinación de 1+.

Ejemplo: Se informa 32 …NO 1/32 NO 1:32

 En los estudios comparativos la diferencia significativa

en los títulos es de 2 o mas diluciones.
 Interpretación
INTERPRETACIÓN
 Se considera que los títulos =16 son
significativos y podrían indicar la necesidad de
monitorear la EHRN.

 Se puede asignar un valor numérico a la

intensidad de la aglutinación.

 Los anticuerpos con títulos altos y escasa avidez

generalmente tienen títulos mas altos que 64,
con reactividad débil en la mayoría de los tubos.
 INTERPRETACIÓN
Interpretación de las reacciones de aglutinación
Intensidad de Grado Scor Aspecto
Reacción e
4+ Completa 12 Aglutinado Único

3+ 3+ 10 Reacción potente, varios aglutinados grandes

2+ 2+ 8 Aglutinados grandes en un mar de grumos más pequeños, sin GR libres

1+ 1+ 5 Muchos aglutinados pequeños y un fondo de GR libres

½ +/- 3 Granularidad débil en la suspensión de GRs.

macro Pocos aglutinados macroscópicos pero muchos microscópicos.

Vestigios o Micro + micro 2 Negativa por el aspecto macroscópico. Unos pocos aglutinados de 6-8
GR en la mayoría de los campos.

Dudoso Burdo 1 Aglutinados microscópicos ocasionales.

0 0 0 Suspensión de GR uniforme. No se detectan aglutinados

 Interpretación
INTERPRETACIÓN
 Importante
NO OLVIDAR……

Fenotipo GR para detección

Los estudios de titulación
de EHRN debe ser R2R2, al
deben efectuarse en cuanto
igual que para cualquier
se detecta el anticuerpo
antígeno con efecto de dosis
(conservar la alícuota de
se deben enfrentar GR con
suero)
antígeno en doble dosis.

Titulo y especificidad de Ac
La ultima dilución siempre se
se asocian a EHRN se sugiere
debe guardar … en caso que
repetir la titulación cada 2/4
sea necesario realizar más de
semanas desde la semana 18
ellas.
de gestación.
 NO OLVIDAR…

Ac contra Ag de baja
incidencia, considerar GR NO usar potenciadores
paternos.

Cada laboratorio de IH
Resultados errores??
debe establecer políticas
Técnica incorrecta, no
que garanticen
haber mezclado el suero
uniformidad en registros e
congelado
interpretación.
 INHIBICIÓN PLASMÁTICA PARA ANTI Ch y anti Rg

Muestra Reactivos
Suero o plasma en estudio GR reactivos
Pool de plasma (6 o mas)
Albumina bovina 6%
SAGH
GR recubiertos con IgG
INHIBICIÓN PLASMÁTICA PARA ANTI Ch y anti Rg

Preparar diluciones seriadas dobles de suero/plasma (hasta 1/512)

2 gotas de cada dilución + 2 gotas de plasma + 2 gotas de albumina

T° ambiente por 30 min.

Agregar 1 gota de GR 2-5% en cada tubo

 Interpretación…
INTERPRETACIÓN
• La inhibición de la actividad de los Ac con
plasma sugiere especificidad anti-Ch y anti-Rg,
casi siempre esta inhibición es completa.
• La presencia de inhibición parcial indica la
posibilidad de aloanticuerpos adicionales.
• Para ello …. Se prepara un volumen suficiente
de suero inhibido y se procede a realizar
identificación del posible anticuerpo.
 Importante
IMPORTANTE…
1. Usar siempre pipetas nuevas.
2. Respetar periodos y tiempos de incubación.
3. Antigüedad, fenotipo y concentración de las
células influyen en los resultados.
4. Las comparaciones solo son validas cuando se
realizan de manera simultánea.
5. Mediciones con mayor exactitud cuando se
trabaja con altos volúmenes.
 ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS

• SAF (Sd aglutininas frías) Ac anti-I (Menos

con Ac anti-i).
• Se asocian a Mononucleosis Infecciosa.
• No patológico  Títulos 64 a 4°C.
 ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS

Autoadsorción en frío

Algunos anticuerpos potentes pueden enmascarar la presencia de aloanticuerpos

significativos.

Adsorción en frio con GR autólogos  Eliminar los AutoAc.

Método utilizando ZZAP

 ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS

Determinación de la especificidad de las Crioaglutininas

Muestra Muestra
Suero, separado a 37°C de una GR O I de adulto.
muestra coagulada. GR sangre de cordón O i.
GR autólogos. GR autólogos lavados 37°C.
GR del mismo grupo del pcte.
PBS
 Preparar diluciones seriadas dobles de suero/plasma

Se preparan diluciones por cada GR en estudio (3 baterias)

Incubar 1 hora a T° ambiente  Registro de algutinación.

Incubar 1-2 hora a 4°C Centrifugación Leer en frío

ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS

SCA con frecuencia se

observan Ac anti-I.
Los AutoAc reactivos
en frio, pueden no
mostrar especificidad
obvia en los estudios
de titulación a T°
ambiente o 4°C.
Puede emplearse para
determinar titulo y
especificidad.
 TITULACIÓN DE CRIOAGLUTININAS
Los anticuerpos reactivos en frío con títulos altos (Ej:
anti-I) pueden sugerir enfermedad por crioaglutininas.

Muestra Reactivos
Suero, separado a 37°C de una GR O I adulto, lavados 3-5%.
muestra coagulada. PBS
 Preparar diluciones seriadas dobles de suero/plasma

Mezclar 2 gotas de cada dilución con 1 gota de GR O I adulto 3-5%

Incubar 1-2 hrs. a 4°C

Centrifugar para lectura Leer en frío

 La AH por crioaglutininas es
Los títulos superiores a 64
excepcional con títulos
son elevados. debajo de 1000

Titulación de
Crioaglutininas

Los títulos debajo de 1000 TCD positivo por C´ con signos

pueden obtenerse cuando el de AH es necesario
autoAc tiene una determinar especificidad y
especificidad diferente rango térmico
 DETERMINACIÓN DEL RANGO TÉRMICO
Se realiza en casos expresamente solicitados en
la orden de examen.

Incluye la incubación del set anterior de tubos

correspondientes al titulo a distintas T°.

Deben incluir T°  4°C, 16°C, 24°C y 37°C

 Importante
IMPORTANTE…
1. Usar siempre pipetas nuevas entre cada
dilución.
2. Siempre realizar diluciones grandes … con
ellos aseguramos mayor exactitud.
 Referencias
• Manual Técnico AABB edición 15, 2007.
Métodos 4 y 5.
Capitulo 15, 20 y 23.