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Belmonte, Adriana;Nogueras, Mónica G.;Contigiani, María Belén;Gandini,

Virginia;Sutich, Emma G.
Estudio de métodos por congelación para la conservación y mantenimiento de cepas
de Gardnerella vaginalis
Bioquímica y Patología Clínica, Vol. 72, Núm. 2, 2008, pp. 15-18
Asociación Bioquímica Argentina
Argentina

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Bioquímica y Patología Clínica

ISSN (Versión impresa): 1515-6761
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REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 72 Nº 2 2008 Pág | 15

Estudio de métodos por congelación para la conservación

y mantenimiento de cepas de Gardnerella vaginalis.
Adriana Belmonte, Mónica G. Nogueras, María Belén Contigiani, Virginia Gandini, Emma G. Sutich.
Cátedra de Microbiología, Parasitología y Virología- Facultad de Ciencias Médicas U.N.R- Santa Fe 3100- 2000 Rosario- Santa Fe-
Argentina
CONTACTO: Mónica G. Nogueras - Pasaje Pinzón 1034 -2000-Rosario- Santa Fe- Argentina TE: 0341-: 4380396.
E- mail: monicanogueras@hotmail.com

RESUMEN Gardnerella vaginalis requiere condiciones especiales para su conservación. Se sugiere para ello
la liofilización y criopreservación. Ambos métodos aseguran viabilidad, pureza, estabilidad feno y
genotípica de las cepas.
Se estudiaron 6 cepas provenientes de materiales clínicos y se conservaron a partir de un cultivo de
32 hs. en dos medios: CG (Caldo cerebro Corazón+ 20% Glicerol) y MGY (10% leche descremada + 1%
glucosa + 0,5% Extracto de levadura+ 15% glicerol) a las temperaturas de -20 ºC y -70 ºC.. Se repicaron
a las: 0 y 24 hs; 7, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 días, en un medio suplementado. Se evaluó el desarrollo
cuantitativamente y se verificó la pureza.
La sobrevida para las conservadas a –20ºC y -70º C en medio GC, fue de 60 y 90 días respectivamente.
Mientras que en MGY a – 20º C decrece a los 60 días y permanece inalterado hasta los 180 días a -70ª C.

Palabras claves: Gardnerella vaginalis - conservación – criopreservación- sobrevida bacteriana.

SUMMARY Gardnerella vaginalis needs special conditions for it’s preservation. The suggested methods are
lyophilization and cryopreservation. Both methods, assure the strain viability, purity and feno -
genotype stability. Six strains from clinical samples were studied.
The suspension media assayed: CG (Brain Heart Infusion + glycerol 20%) and MGY (Skim milk 10%+
Glucose 1% + Yeast extract 0, 5 % + Glycerol 15%) were stored at –20ºC and –70 ºC. The samples were
transferred onto supplemented medium at: 0 y 24 hs. and then to 7, 30, 60, 90, 120, 150 and 180 days.
The bacterial growth was evaluated quantitatively and the purity was verified.
Our result indicates that the survival of Gv stored at a different temperature preservation, starts to
decrease in the CG medium, after of 60 days at -20ºC and after 90 days at -70ºC. The other strains
stored in MGY at -20ºC start to decrease in 60 days, remaining unchanged up to 180 days at -70ºC.

Key words: Gardnerella vaginalis - preservation-cryopreservation- survival- conservation.

Revista ByPC. Incorporada

al Latindex.
ISSN 1515-6761
Código Bibliográfico: RByPC
Fecha de aceptación:
26/08/2009.
 Pág | 16 Estudio de métodos por congelación para la conservación y mantenimiento de cepas de Gardnerella vaginalis. Trabajo: págs 15 | 18
INTRODUCCIÓN
Gardnerella vaginalis es un microorganismo que está ínti-
mamente relacionado con la Vaginosis Bacteriana (VB), la
que es considerada un síndrome no inflamatorio polimicro-
biano del tracto genital inferior femenino, que se caracteri-
za por un disbalance y reemplazo de la flora lactobacilar por
Gardnerella vaginalis (Gv), anaerobios y micoplasmas(1).
Además, forma parte de la flora vaginal de la mujer en edad
fértil y se la relaciona con otras patologías extra vaginales
como bacteriemia, síndrome urinario, parto prematuro, me-
ningitis neonatal etc. (2), (3), (4), (5), (6).
Este microorganismo se encuentra dentro del grupo de bacte-
rias lábiles, de lento desarrollo, por lo que necesitan condiciones
especiales para su conservación. Por otra parte, cuando este
proceso debe mantenerse por largos períodos de tiempo se re-
comiendan, como métodos de elección el uso de la liofilización
y criopreservación, que aseguran tanto la viabilidad y pureza,
así como la estabilidad feno y genotípica de las cepas. (7), (8)
La congelación es un método simple, accesible y muy uti-
lizado, que detiene el crecimiento celular o actividad me-
tabólica, pues de lo contrario aumentaría la posibilidad de
mutaciones y variaciones en los cultivos. Pueden usarse las
temperaturas de congelación de -20º C ó -40º C o bien la
ultra congelación a - 70º C ó -90º C.
Ante la necesidad de mantener la viabilidad de los aisla-
mientos a largo plazo y para poder investigar los aspectos
fisiopatogénicos de estos microorganismos, se propuso
comparar la recuperación y sobrevida de estas bacterias
conservadas por congelamiento en medios de cultivos, con
distintos crioprotectores y a temperaturas inferiores a 0° C.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas:
Se estudiaron 6 cepas de Gardnerella vaginalis provenientes
de materiales clínicos de pacientes con VB, aisladas en Agar
CNA (Merck) + 5% sangre humana en atmósfera de 5% CO2
incubadas a 37º C por 48hs.
Fueron identificadas presuntivamente, colonias minúsculas
transparentes, beta hemolíticas en Agar sangre humana
(9), las que se detectaron evaluando las características
macroscópicas de las colonias observadas con iluminación
brillante directa, de modo que la luz se reflejara desde
diversos ángulos y con la ayuda de una lupa.
Estas colonias fueron luego estudiadas microscópicamente,
observándose cocobacilos o bacilos Gram negativos o
variables, sin disposición particular. Las pruebas mínimas
implementadas para la identificación, según la actividad
bioquímica o metabólica, dieron los siguientes resultados:
• catalasa negativa,
• hidrólisis de Hipurato de Sodio positivo,
• fermentación de glucosa positiva y
• manita negativa.
Con las cepas ya identificadas de la siembra original, y con el fin
de enriquecer su desarrollo para una posterior conservación, se
efectuó un repique en Agar Sangre Suplementado (ASS - Agar
Base Columbia + 5% sangre humana +1% Proteosa Peptona Nº
3 + 1% Extracto de levadura).
Conservación en medios líquidos:
Se prepararon dos medios:
a) Medio CG: caldo cerebro corazón + 20% de glicerol
b) Medio MGY: leche descremada 10% + glucosa 1% + extracto
de levadura 0,5% + glicerol 15%.(10)
En el primer caso se empleó glicerol como crioprotector y en el
segundo, además de éste, se le adicionó leche descremada y
un azúcar (glucosa 1%).
Se realizó una suspensión bacteriana en solución fisiológica con
turbiedad equivalente al tubo Nº 2 Mc Farland = 6x108 UFC/ml a
partir de un cultivo puro en ASS. Luego, fue homogeneizado por
toque en vortex a 2800 rpm e inmediatamente se colocó 1 ml
de esta suspensión en cada uno de los dos tubos que contenían
5 ml de medio CG y en otros dos con 5 ml de medio MGY. Estas
suspensiones fueron homogeneizadas por vortereado y
repartidas en lotes de viales en tubos Eppendorf conteniendo
0,5 ml cada uno (concentración final 1 x 10 8 UFC/ml) para ser
conservados a – 20 º C y -70 ºC.
Estudios de viabilidad de las cepas:
Se llevó a cabo un repique del inóculo inicial (0 hs.) y
posteriormente se efectuaron repiques a distintos tiempos: a
las 24 hs. y luego a los: 7, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 días.
En cada tiempo por cada cepa se extrajo 1 vial (de los 10
inicialmente conservados) La recuperación y revitalización
de ellos se hizo descongelando a Baño María a 37 º C durante
30 minutos y luego de homogeneizar los viales, se sembró
en superficie una alícuota de 0,1 ml de ellos, con espátula de
Drigalsky en ASS, incubándose a 37 º C en 5-10% CO2 por 48hs.
Dichos viales luego de su uso fueron descartados.
Se consideró como porcentaje de recuperación del 100% al
obtenido en el primer repique efectuado a las 0 hs. (antes de
iniciar la conservación).
Se evaluó el desarrollo obtenido en forma cuantitativa, mediante
el examen visual de la superficie de las placas de ASS, con la
ayuda de una lupa, además se verificó la pureza y morfología
microscópica por tinción de Gram de las colonias
RESULTADOS
Del total de los repiques realizados a las 6 cepas (n: 216), en
los medios de conservación ensayados a las 2 temperaturas
(-20ºC y -70ºC), sólo en 19 desarrollaron microorganismos
contaminantes, siendo Staphylococcus spp el germen más
frecuente, lo que demostró, que el 91,20% de los cultivos
viables estaban puros.
Los viales contaminados no fueron contrastados en el momento
de descartarlos por otro vial.
REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 72 Nº 2 2008
TABLA I: Porcentaje de recuperación de Gardnerella
vaginalis (Conservadas a – 20 ºC)
Medios
Tiempo (días)
0 1 7 30 60 90 120 150 180
CG 100 100 100 100 60 20 0 0 0 CG
MGY 100 100 100 100 80 50 20 0 0
CG: Caldo cerebro corazón + 20% glicerol
MGY: Leche descremada 10%+ 1% Glucosa + 0,5 % Extracto de
Levadura + 15% glicerol
Inóculo Inicial: 1x 108 UFC/ ml (de cada vial)
100% se consideró ante una recuperación idéntica al inóculo
inicial.
El inóculo bacteriano inicial obtenido no logró ser tan abundante
como para preparar duplicado para las cuatro condiciones de
conservación.
En las tablas Nº I y II se observa la viabilidad de las cepas,
conservadas en los dos medios de cultivo empleados expuestos
a las dos temperaturas ensayadas.
El inóculo inicial no sufre variación alguna en la viabilidad de
las bacterias en los medios de conservación utilizados durante
los primeros 30 días a -20º C y hasta los 60 días a -70º C de
almacenamiento.
En cuanto a los medios de preservación ensayados, la influencia
de los mismos en la recuperación de las cepas conservadas a
-20º C, demuestran que hasta los 30 días no hay variación, pero
disminuye notablemente (40%) la recuperación a partir del
segundo mes en el medio CG (p<0.01) y 20% en el MGY (Tabla
I). En el caso de las conservadas a -70º C la disminución (25%)
se observa a partir de los 90 días en el medio CG y se mantiene
sin modificación en el medio MGY hasta los 180 días (Tabla II)
Se observa que la sobrevida de las bacterias, mantenidas a
diferentes temperaturas de preservación, comienza a disminuir
en el medio CG, entre los 30 y 60 días cuando se las conserva
a -20º C y entre los 60 y 90 días las que estaban a – 70 º C. En
cuanto a las conservadas en el medio MGY a -20ºC el recuento
de UFC comienza su disminución entre los 30 y los 60 días,
manteniéndose sin cambio hasta los 180 días las conservadas
a -70ºC (Tablas I y II).
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Para el mantenimiento de cepas bacterianas en el laboratorio
de microbiología es necesario que el cultivo sea puro, evitando
que se produzcan contaminaciones durante el proceso de
conservación y cuidando minuciosamente los pasos a seguir.
En el caso expuesto, la contaminación más frecuente se debió
a Staphylococcus spp, a pesar de haberse tomado todas las
precauciones en cuanto a la técnica manual desarrollada en
los distintos pasos de la conservación, puesto que se tuvo en
cuenta que las contaminaciones tienen un papel negativo en
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TABLA II: Porcentaje de recuperación de Gardnerella
vaginalis (Conservadas a – 70 ºC)
Medios
Tiempo (días)
0 1 7 30 60 90 120 150 180
100 100 100 100 100 75 50 20 0
MGY 100 100 100 100 100 100 100 100 100
CG: Caldo cerebro corazón + 20% glicerol
MGY: Leche descremada 10%+ 1% Glucosa + 0,5 % Extracto de
Levadura + 15% glicerol
Inóculo Inicial: 1x 108 UFC/ ml (de cada vial)
100% se consideró ante una recuperación idéntica al inóculo
inicial
el porcentaje de recuperación o producen invalidación de las
cepas.
Además, es importante que durante el tiempo de preservación
sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y por último, que
éstas permanezcan genéticamente estables. Los resultados
de este proceso dependen de varios factores:
• las condiciones de crecimiento (medios de cultivos,
atmósfera, temperatura de incubación y tiempo),
• la edad del cultivo (en la fase estacionaria: las células
son más resistentes a la congelación- descongelación
que en la etapa exponencial).
• el medio de suspensión,
• la temperatura de almacenamiento, etc.
El conocimiento de las características del cultivo es esencial
en la elección de un método de preservación. La identidad
del mismo puede conocerse en base a sus condiciones de
crecimiento en uno o más medios específicos, considerándose
las propiedades macro y microscópicas exhibidas, o en base a
una evaluación más exhaustiva, empleando muchos ensayos
bioquímicos, biológicos, inmunológicos y genéticos.
Para el mantenimiento, preparación y propagación de inóculos
se deben usar métodos reproducibles que no produzcan
variaciones. Por eso se tuvo en cuenta que, ante, una bacteria de
dificultosa conservación a largo plazo como es Gv, era necesario
comparar medios líquidos conteniendo crioprotectores (para
preservarlas del proceso de congelación y descongelación) y la
utilización de temperaturas inferiores a 0º C (– 20 ° C y – 70 °
C) en congeladores, generalmente disponibles en laboratorios
de mediana complejidad.
Pese a ser considerada la criopreservación un método muy
eficaz, debe tenerse en cuenta que durante este proceso se
producen fenómenos fisicoquímicos que pueden afectar la
viabilidad de las cepas, por lo que se deben estabilizar los
organoides disminuyendo la posibilidad de muerte celular. De
allí la importancia del uso de los crioprotectores para aumentar
la resistencia de las bacterias al estrés sometido. La selección
de los mismos depende de la cepa a conservar (11).
Años atrás Taylor y Phillips (1983) conservaban las cepas de
Gardnerella vaginalis en Caldo Tioglicolato, suplementado con
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10% v/v de glicerol y 10% v/v de sangre de caballo desfibrinada a
una temperatura de -20º C. (12). En 1985 estas bacterias fueron
guardadas a -70º C en Caldo Tripteína Soya, suplementada con
suero de caballo al 50% según refieren Peters y Piott (13).En
estos medios de conservación puede haber variación de lote
en lote de sangre de caballo, por lo tanto para lograr una mayor
reproducibilidad en los resultados en el medio utilizado, se
recurrió a otras combinaciones más comunes como caldos con
glicerol o leche descremada, azúcares y extractos de levadura,
que son componentes más estables.
La conservación por frío puede producir daños reversibles como
irreversibles en la membrana y/o pared celular.
Los crioprotectores utilizados para este ensayo fueron:
• glicerol, que difunde a través de la membrana protegiendo
a la célula, tanto interna como externamente,
• glucosa, que sólo protege externamente la membrana
celular,
• leche descremada, utilizada frecuentemente.
De acuerdo con esta experiencia, la evaluación de la viabilidad
de Gardnerella vaginalis por recuperación en ASS (CO2- 37º C -
48hs.) permite concluir que, de los dos medios utilizados, MGY
(medio que contiene tres crioprotectores: leche descremada,
glucosa y glicerol) fue el más eficaz tanto a -20º C como a -70º C.
A - 70 º C en 6 meses de conservación se obtuvo una
recuperación del 100% (constatada por el crecimiento hasta
las últimas estrías en los medios de repique: ASS). En tanto que
a – 20ºC, entre los 30 y 60 días decayó un 20%.
En este estudio, llevado a cabo durante 6 meses, se vio que
la utilización del medio MGY para la conservación de cepas de
Gardnerrella vaginalis dio resultados concordantes con los
obtenidos por Nader y col. (10) que refieren una excelente
viabilidad de cepas de Haemophilus influenzae después de
haber sido conservadas por 12 meses en este mismo medio a
– 70ºC(100%). También, estos autores refieren una viabilidad
del 86,5 % conservando las cepas de Haemophilus a – 20 ° C,
mientras que, con la realización de este trabajo se encontró,esa
recuperación, para Gv, en un período más corto (entre 30 y 60
días)
De los resultados obtenidos, se revela que no sólo es importante
el medio de conservación sino también la temperatura de
almacenamiento. Es por ello que se sugiere la utilización de
MGY, el cual es accesible al laboratorio de mediana complejidad,,
y que puede ser implementado como método simple de
conservación de estas cepas bacterianas, cuando se necesita
preservarlas para posteriores estudios epidemiológicos.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue realizado con fondos provenientes de la
Universidad Nacional de Rosario, en el marco de Proyectos PID
2006 (Med-173) Directora: Emma Sutich
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