El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones • 97

El ejercicio moderado temprano después de la infección Virus de la

Influenza Reduce el Th1 de respuesta inflamatoria en los pulmones de
ratones

Thomas Lowder 1, David A. Padgett 2, y Jeffrey A. Woods, 1

1 Departamento de Kinesiología de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign @,

Urbana IL, 61801 y
2 Sección de Biología Oral de la Universidad Estatal de Ohio, Columbus OH,

La cabeza corriente: El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones

Resumen

Hemos demostrado anteriormente que el ejercicio moderado aumenta significativamente la supervivencia

después de virus de la gripe (8/34 A / PR /) la infección en ratones. La hipótesis de que esta duración breve de
ejercicio sería o bien aumentar las defensas inmunitarias innatas y / o cambiar la respuesta inmune a un Th1
inflamatoria a una respuesta anti-inflamatoria Th2 resulta en una disminución patología pulmonar. Adulto ratones
Balb / cByJ masculino (5-6 meses de edad) fueron infectados con 50 l de A / 34 virus A / PR / 8 (40HAU) por vía
intranasal y asignados al azar a un ejercicio (EX) o grupo sedentario (SED). ratones EX realizó 20-30 min de
ejercicio moderado (8-12 m / min) en una hora después de la infección rueda de ardilla motorizada 4 y luego
ejerce de manera similar durante 4 días consecutivos. SED ratones fueron expuestos a condiciones ambientales
similares, pero no ejerció. Los ratones de ambos grupos SED EX y se sacrificaron 1, 3, o 5 días después de la
infección (pi) y de los pulmones, se recogieron los ganglios linfáticos mediastínicos (MLN) y bazos. EX signifi-
cativamente reducida infiltración celular total y IFN γ la expresión génica en los pulmones en los días 3 y 5 pi y
había un cambio cualitativo en la expresión de citoquinas en el pulmón de un Th1 a una respuesta Th2. También
hubo una tendencia hacia una reducción de la proteína M1 de la gripe expresión del ARNm. No hubo diferencias
en IFN β

los niveles de proteína entre los grupos. Estos datos sugieren que el ejercicio moderado cuando se aplica poco después
de la infección por turnos la respuesta inmune lejos de un perfil Th1 en ratones infectados con el virus de la influenza. Este
cambio inducido por el ejercicio en la respuesta inmune puede ser responsable de la mejora de la supervivencia después
de infección por el virus de la influenza. (.. Exerc Immunol Rev. 12, 2006: 97-111)

palabras clave: la gripe, el ejercicio, la inflamación, la inmunidad, Th1, interferón γ

Dirección para la correspondencia a:

Jeffrey A. Woods, Ph.D., 906 S. Goodwin Ave, Universidad de Illinois, Urbana IL,
61801, Tel: 217-244-8815, Fax: 217-244-7322, correo electrónico: Woods1@uiuc.edu Este trabajo apoyado por el NIH
subvención AG-13928 (a JA Woods), el Colegio Americano de Medicina Deportiva Estudiantil de Investigación Grant (a TW
Lowder) y una beca de la Universidad de Illinois Junta de Investigación
 Introducción

Muchos laboratorios, incluyendo el nuestro, se han llevado a cabo investigaciones que

examina la influencia del ejercicio sobre las respuestas inmunes. Si bien lejos de certeza, los datos
imperantes sugieren
respuesta inmune que el ejercicio
a la infección moderado
por virus de la gripe enmejora
ratonesla función inmune (43), mientras que
extenuante ejercicio, prolongada disminuye muchos aspectos de funcionamiento del sistema inmune
(18, 19, 29). Aparte de algunos estudios recientes con herpes simplex-1 del virus y el virus de la
coriomeningitis linfocítica (LCMV) (6, 19, 43), la mayoría de las pruebas de investigación proviene de
los estudios que analizan in vitro la respuesta inmune utilizando retos inmunes patógenos no
específicos. Por ejemplo, varios estudios han examinado la respuesta de aislaron células
mononucleares de sangre periférica a mitógenos clonales poli- o examinado la actividad de células
al virus de la influenza. La hipótesis de que esta duración breve de ejercicio resultaría en 98 • El ejercicio y la
natural killer partir de células obtenidas antes y después del ejercicio (14, 24, 33).

Cada año, las enfermedades asociadas con el virus de la gripe son responsables de un estimado de
36.000 muertes y 150.000 hospitalizaciones hasta en los Estados Unidos por lo que es un problema
importante de salud pública (4). Tanto el los sistemas inmunes adaptativas innata y se activan después de la
intento de comenzar a soporte sub qué es que el ejercicio protegida a los ratones de la muerte debido a la exposición
infección primaria con virus za influ-. La detección temprana innata del virus de la gripe en el tracto
respiratorio se produce a través de células dendríticas plasmacitoides (PDC) toll-like receptor (TLR) -7 que
conducen a la inducción de interferones de tipo 1 (IFN), NF κ B, la activación y expresión ry de citoquinas
pro-inflammato- (26). producción de IFN-TLR-7-desencadenada α y IFN β

inducir un estado antiviral importante limitar la propagación inicial del virus, y estos interferones de tipo I también
inducidos por el ejercicio moderado en la respuesta inmune de los ratones infectados con el virus de la gripe en un
comienzan a impulsar la respuesta inmune innata a za influ- (5, 32). Tal vez lo más importante, la primera
activación de TLR-7 hace que los PDC jugadores clave que impulsan los primeros acontecimientos que finalmente
conducen al desarrollo de respuestas inmunes mediadas por células Th1-dominados. Los PDC secretan múltiples
citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo TNF α, IL-1 β, IL-6 y IL-18) y quimiocinas (por ejemplo, RANTES, MCP-1)
que directa e indirectamente conducen a un aumento de cessing antígeno pro- y presentación por los macrófagos
y el aumento de la citotoxicidad por células asesinas naturales (NK). En última instancia, TLR-7 de señalización
ejercicio
puede prolongado
estar dioactivación
ligada a la lugar a mayores tasas de mortalidad.
de las respuestas inmunes En este estudio, hemos
anti-gen-específicas porexplorado los cambios
la producción de IFN γ, que
es el principal mediador de las respuestas Th1. Ese vínculo se manifiesta más en la proliferación pro- posterior y el
reclutamiento de antígeno específico CD8 + linfocitos T (la expansión de la que depende de CD4 + Las células Th1)
en los ganglios linfáticos de drenaje mediastínicos (MLN). Estos antígeno específico CD8 + células T juegan un
papel importante en Ance claro- viral y recuperación de la infección de la gripe (42). Curiosamente, mientras que
una fuerte respuesta Th1 es importante en la eliminación del virus de la gripe, una respuesta tan inflamatorio
virus de
puede la gripedar
también aumenta
lugar asignificativamente la tasa
daños en los tejidos y la de supervivencia
muerte en sugerido
(38). Se ha ratones Balb
que/ las
c (25). Por el contrario,
citoquinas Th2, taleselcomo
IL-4 e IL-10, contrarrestar las altos niveles potencialmente dañinos de citoquinas Th1 (y sus respuestas inducidas)
en la infección de la gripe (1).

Hemos determinado que 4 días de ejercicio moderado a principios aplicados después de la infección con el
 El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones • 99

disminución de la patología pulmonar y cambiar la respuesta inmune a una respuesta inflamatoria Th1 a una
respuesta anti-inflamatoria Th2.

Materiales y métodos

Animales. endogámica ratones BALB / c macho libre de patógenos específico de 5-6 meses (n = 110) fueron criados
en nuestras instalaciones y se utiliza en todos los experimentos. Los ratones se alojaron individualmente en jaulas
micro-aislado caja de zapatos en instalaciones mantenidas a una tem- peratura de 23 ºC. Todos los ratones se
mantuvieron en un 12: 12-h ciclo de luz-oscuridad (0700-1900 oscuro) y de alimentos en autoclave dado (8640 Harlan
Teklad 22-5 Harlan, Madison, WI) y agua ad libitum. Todos los tratamientos con animales fueron aprobados por el
Institucional cional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Illinois en Urbana @ / Champaign
y dentro de las pautas establecidas por el NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

La infección de la gripe. Desafiamos ratones BALB / c por vía intranasal (IN) con una dosis de virus (40
unidades hemmaglutinating [HAU]) que resultó en ~ 50% lethali- ty de los ratones de control sedentario como
en nuestro estudio anterior (25). En este estudio, 50 l de virus de la gripe (40 HAU de A / Puerto Rico / 8/34)
fue entregado en en ratones ligeramente anestesiados con isoflurano.

Paradigma de ejercicio. Los ratones fueron infectados 2-3 hr en su ciclo de oscuridad en el Día 0. Cuatro horas
después de la infección (pi) (1300-1400, Día 0) ratones se ejercieron usando una cinta rodante motorizada a una
velocidad de 8-12 m.min- 1 y el grado 5% durante 30 min. Esta velocidad de la cinta era de aproximadamente
55-65% de su consumo máximo de oxígeno (VO 2 max) (23). Nuestros propios estudios de medición de VO 2 max en
ratones BALB / c de edades OU variabilidad han confirmado estas intensidades de ejercicio relativas (datos no
mostrados). Los ratones entonces ejerce de manera similar durante 3 días más consecutivos (días 1-3), con cada
sesión de ejercicio separado por 22-24 hr. Esperábamos los efectos del ejercicio a ser mayor cuando el ejercicio se
llevó a cabo en las primeras etapas de la infección. Los ratones no se ejercieron pasado día 3 porque presentaban
síntomas de enfermedad. Los ratones se ejecutó sin descarga eléctrica o pinchar. Los ratones control se expone al
entorno cinta de correr durante un tiempo similar, pero no ejerció. Todos los ratones se les niega el acceso a
alimentos y agua durante el período de ejercicio.

Recogida y tratamiento de tejido. Los pulmones aislados para el ARNm o el análisis de proteínas fueron
extirpados e inmediatamente se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido en 2,5 ml de tubos de
microcentrífuga y después se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis por tiempo real de la transcriptasa inversa
(RT) -PCR. Los pulmones aislados para el análisis celular se colocaron en 5 ml de medio (RPMI 1640) y se
homogeneiza. El homogeneizado se añadió a 25 ml de medios de comunicación para un volumen total de 30 ml.
Esto fue seguido por la adición de 1.500 unidades de colagenasa tipo I por muestra (Worthington Bio- Chemical
Corporation, Lakewood, New Jersey). Esta mezcla se colocó en un vaso de precipitados y se agitó usando una
placa de agitación magnética durante 45 min a 4 ° C. Después de esta digestión, la mezcla se centrifugó a 200 x sol
durante 5 min. Se retiró el sobrenadante, las células rojas de la sangre residual se lisaron con solución de cloruro
de amonio, se resuspendieron las células, se contaron, y una sola célula suspensiones eran
100 • El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones

ajustado por la tinción de anticuerpos y análisis de citometría de flujo. Además de los pulmones ING isolat-, que
también examinó el contenido celular y el fenotipo de las MLN drenaje y el bazo. suspensiones de células
individuales de MLNs y bazos se obtuvieron haciendo pasar estos tejidos a través de una pantalla de malla de
alambre (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). glóbulos rojos residuales se lisaron con solución de cloruro de amonio, se
resuspendieron las células, se contaron, y una sola célula suspensiones fueron concentración ajustada para la
tinción de anticuerpos y análisis de citometría de flujo.

Cytospin Preparación. Tras el sacrificio, los pulmones se lavaron con 3-5 ml de PBS. Las células se centrifugaron
a 250 x sol durante 5 min, se resuspendieron en PBS, se contaron y se ajustaron a 0,5 x 10 6 células por ml. Las
células se mantuvieron en hielo, y se utilizó 100-200 l de esta solución para la tinción de Wright en portaobjetos de
microscopio. Cell identificación ción se realizó a 40X por triplicado en 3 campos determinados previamente en una

de forma ciega, con los tres recuento

6

UN de células (un mínimo de 200 células

sedentaria
5 contadas por campo) identificaciones
Ejercidas
promediados para cada ratón. Los
neutrófilos, linfocitos,
Diferencia N-Fold en IFN Expresión Génica

y Mac-
rophages se presentan como un
3

porcentaje de la nú- mero total de

*
2
células contadas.
1

Citometría de flujo. Las células (0,5 x

0 10 6) se añadieron a 1 ml de azida de
1 3
sodio PBS / 2% FBS / 0,1% y se
Días después de la infección
centrifugó a 250 x
90 sol. Las células se agitaron
si eliminación si- guiente de
80 sedentaria

Ejercidas sobrenadante y 100uL de PBS / FBS

70
al 2% / azida sódica al 0,1% se
Diferencia N-Fold en IFN La expresion genica

60
añadió junto con los anticuerpos
50
apropiados marcados (0,5 g
40 conjugado con ficoeritrina anti-CD8,
30 Pharmingen, San Diego, CA; o 0,5 g
de la rata anti-ratón CD49b / RPE
20
* pan-, GY Sur Biotechnolo-,
10
Birmingham, aL) durante 30 min a
0
1 5 temperatura ambiente. Después, las
Días después de la infección células se lavaron y se fijaron en PBS
/ 1% de formalina tamponada (Sigma)
Figura 1. IFN- γ la expresión génica en los pulmones de los ratones en el día 3 y se almacenó a 4 ° C hasta su
(Figura 1a; n = 8 y 7 por grupo en los días 1 y análisis usando un Becton Dickinson
3, respectivamente) y el Día 5 (Figura 1b; n = 8 y 10 por grupo en los días LSR Benchtop citómetro de flujo con
1 y 5, respectivamente) tras la infección con A / PR / 8/34. Tenga en un láser de ion argón de 488 nm. Un
cuenta las diferencias en la escala del eje y entre la Figura 1a y 1b. * mínimo de 10.000
Significativamente (p <
0,05) más bajo que el grupo SED en el mismo día.
 El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones • 101

eventos se analizaron en cada muestra. La puerta de la autofluorescencia se fijó utilizando una muestra sin teñir.
Todas las muestras autofluorescent cayeron dentro del primer registro, con muestras teñidas que cae entre el
primer y tercer registro.

La expresion genica. muestras de tejido pulmonar se homogeneizaron usando un sin- gle paso ARN TRIzol
procedimiento de aislamiento estándar (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Después del aislamiento, el ARN total
se cuantificó espectrofotométricamente a 260 nm y 280 nm. El ARN se transcribe de forma inversa en ADNc de
acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega, Madison, WI). El sistema de transcripción inversa consistía en
MgCl 25 mM 2, 10X tampón de transcripción inversa, mezcla de dNTP 10 mM, rRNase en inhibidor de
ribonucleasa, virus de la mieloblastosis aviar (AMV) de la transcriptasa inversa, y cebadores aleatorios. Las
muestras se incubaron a 42 ° C durante 60 min, 100ºC durante 5 min, y después se enfriaron a 4 ° C. Todas las
muestras se sometieron a reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR), con el fin de cuantificar las
secuencias de nucleótidos de interés. 18S RNA se utilizó como control interno en todas las muestras. Cebadores
se compraron de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA), y sondas fueron adquiridos de Applied Biosystems
(Foster City, CA). información de la secuencia cebador se puede encontrar en la Tabla 1. La mezcla maestra
para PCR en tiempo real consistía en 2X Universal Master Mix (PE Biosystems, Roche Molecular Systems,
Branchburg, New Jersey), 0,9

μ M de cDNA cebador 5 ', 0,9 μ M de cDNA cebador 3 ', y 0,25 μ M de la sonda de ADNc. Las muestras se
sometieron a 40 ciclos de amplificación cada uno compuesto de 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 C, 15 s a 95ºC, y 1
min a 60 ° C. PCR en tiempo real se formó per- utilizando un Prisma 7000 Secuencia del software del sistema
de detección (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las muestras obtenidas de animales sedentarios 24 horas
después de la infección se utilizaron como control de referencia.

La proteína M1 Secuencia
Adelante 5 'GGACTGCAGCGTAGACGCTT-3'
Marcha atrás 5 'CATCCTGTTGTATATGAGGCCCAT-3'
Investigacion 5 'CTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCA-3'
IFN Secuencia
Adelante 5 'AGCAACAGCAAGGCGAAAA-3'
Marcha atrás 5 'CTGGACCTGTGGGTTGTTGA-3'
Investigacion 5 'CCTCAAACTTGGCAATACTCATGAATGCATCC-3'
IL-10 Secuencia
Adelante 5 'TTTGAATTCCCTGGGTGAGAA-3'
Marcha atrás 5 'ACAGGGGAGAAATCGATGACA-3'
Investigacion 5 'TGAAGACCCTCAGGATGCGGCTG-3'

Tabla 1. Las secuencias de cebador utilizadas para tiempo real de RT-PCR.

El análisis de proteínas cualitativa. Hemos utilizado una matriz de anticuerpos de citoquinas inflamatorias
(RayBiotech, Lakewood, New Jersey) a la sonda de diferencias cualitativas en la expresión de proteínas en los
homogeneizados de pulmón combinados de los dos grupos diferentes. Como este fue un ensayo costoso,
solamente los ratones desde el día 3 fueron utilizados (n = 6 SED y n = 8 EX). Se eliminó mg Diez de pulmón y se
añade a 250 μ L de tampón de lisis, 250 μ L PBS, y 50 μ L de cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, St. Louis, MO). Esta
mezcla se homogeneizó y se centrifugó a 2500 x sol durante 5 min. La super- resultante
respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones

de Natant se congeló a -80 ° C. Las muestras de ratones individuales fueron luego agrupadas (cantidades
iguales de proteína de cada ratón) y se analizaron de acuerdo con las especificaciones del fabri- cante
(RayBiotech, Lakewood, New Jersey).

IFN-pulmonar ββ ELISA. Análisis de pulmón IFN β expresión de la proteína se realizó usando un kit (PBL
Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ) ELISA comercialmente disponible.

Análisis de los datos. recuentos y porcentajes de células y IFN-pulmón β concentración se presentan como
media ± error estándar de la media (SEM). Para estas variables, los efectos del tratamiento (por ejemplo sig- sig-
EX vs SED) se determinaron utilizando general
Modelo lineal análisis univariado
12 de la varianza (SPSS
11
sedentaria 14.0, Chicago, IL). los efectos del peralte
10
Ejercidas SIGNIFI- fueron seguidos por una serie
Diferencia N-Fold en IL-10 de la Expresión Génica

9
de pruebas roni ajustados Bonfer- post
8
hoc. Para evaluar la influencia del
7
ejercicio sobre la expresión génica
6
durante la infección de la gripe, la
5
cantidad de ARN específico (por ejemplo,
4
IFN- γ, proteína IL-10, o la gripe M1)
3
obtenido a partir de PLE un pulmón sam-
2

1
se comparó con la cantidad de las

0
mismas especies de ARN presentes en
1 3 5
los pulmones sedentarios Día 1 después
Días después de la infección
de la infección. tratamiento EX no afectó
la expresión de genes de línea de base
Figura 2. IL-10 expresión génica en los pulmones de ratones en los días 3 y 5
en los pulmones no infectados (datos no
después de la infección con A / PR / 8/34. (N = 12 y 10 en cada grupo para los
mostrados). En pocas palabras, en
días 1 y 5 después de la infección, respectivamente).
tiempo real

PCR genera una C t valor, que es el ciclo de PCR, donde la amplificación del ADNc de interés
comienza expansión exponencial. Para el análisis, la C t valor para el estándar interno (es decir, ARN
18S) se restó de la primera C t valor para el ADNc de interés. Este controles resta de las diferencias
en cripción inversa tran- y carga de la muestra, y el valor se indica como la Δ C t. A continuación, el Δ C
t
valor generado a partir de muestras de tejido referentes Después se resta de la Δ C t
para cada muestra experimental. Esta ecuación establece la muestra de control a un valor refe- rencia de 0 y
genera una ΔΔ C t para cada desconocido. Y, por último, estos UE Val- se promediaron para cada grupo de
tratamiento; estos valores medios se utilizaron para generar la diferencia de N veces en el ARN de expresión
con respecto al control usando la ecuación: 2 (- ΔΔ C t); Usando esta ecuación el control = 1. Aunque esta
transformación de datos ilustra con precisión la amplificación logarítmica después de cada ciclo de PCR y se
utiliza en cada una de las figuras, la evaluación estadística se formó per- usando el ΔΔ C t valor. suma
pruebas clasificados con un estudiante de t-test se formaron per- usando Sigma Stat software estadístico
versión 2.0. valores de p de menos de

0,05 se consideraron significativos. Debido a la transformación logarítmica de los 102 • El ejercicio y la

 El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones • 103

datos, es engañoso visualmente para representar una desviación estándar o error estándar de la media; por lo tanto las
figuras que ilustran los datos de PCR en tiempo real no incluyen tales barras de error.

resultados

El ejercicio reduce la afluencia de células en los pulmones y los órganos linfoides secundarios de los ratones
infectados de influenza. La infección resultó en la infiltración celular significativa en el pulmón cuando se compara con
SED no infectados y de los ratones EX (datos no mostrados). Importante- Ly, hubo una reducción significativa del
total de células que infiltran el pulmón en el día 5, pero no el día 3 (2,5 ± 0.6 vs. 2.5 ± 0,4 x 10 6 para SED y EX,
respectivamente; p = 0,98), pi en el EX cuando se compara con el grupo SED (Tabla 2). Hemos preparado
portaobjetos de citospina de células obtenidas de los pulmones para determinar si el ejercicio reduce
preferentemente fenotipos específicos de células, incluyendo neutrófilos, linfocitos o macrófagos. A pesar de la
reducción en el número total de células, no hubo diferencias significativas en el porcentaje de neutrófilos (34 ± 4% vs.
36 ± 5%, por SED y EX, respectivamente, p =

0.78), los linfocitos (42 ± 4.7 vs. 42.5 ± 4,2%, por SED y EX, respectivamente, p =
0,93) o los macrófagos (24 ± 3.7 vs. 21.6 ± 3,5%, por SED y EX, respectivamente, p =
0,64) entre EX y ratones SED en el día 5 después de la infección indicando que el efecto antiinflamatorio de
ejercicio fue de células no específica, al menos tan groseramente definido por la morfología celular. Además, no se
encontraron diferencias significativas en el porcentaje de células positivas para la célula específica marcadores de
superficie CD8 (linfocitos T citotóxicos) (Tabla 2) o CD49 (12.8 ± 3,6 y 15,9 ± 2.1, por SED y EX, respectivamente).
ratones EX exhibió número de CD8 + redujo significativamente las células en el bazo y una ten- dencia para
reducida CD8 + células en los MLNs y pulmón (Tabla 2).

Pañuelo de papel Células totales (x10 6) Porcentaje de CD8 + CD8 + (x10 6)

SED EX SED EX SED EX

Pulmón 5.4 + 0.44 4.1 + 0.34 * 12.6 + 0.8 14.5 + 2.7 0.68 + 0,06 0,59 + 0.1

MLN 4.8 + 0.64 2.8 + 0.66+ 12.7 + 2.9 11.7 + 2.2 0.65 + 0,19 0,33 + 0.08+

Bazo 20.1 + 5.7 12.9 + 2.3 16.8 + 3.7 15.9 + 2.4 2.8 + 0.4 1.7 + 0,17 *

Tabla 2. Efectos de ejercicio sobre la celularidad y el fenotipo CD8 en pulmón, MLN, y bazos de ratones infectados influenza
después de la infección 5d (N = 5-8 por grupo). * P <0,05; + P <0,08

El ejercicio reduce el IFN γγ la expresión génica en los pulmones de ratones infectados influenza.
Nos expresión génica de citocinas pulmonar medida para determinar si el ejercicio modularización lated la Th1
(IFN γ) o Th2 (IL-10) la respuesta inmune a la infección por influenza. ratones EX exhibió una expresión
significativamente reducida de IFN γ mRNA tanto en el día 3 (Figura 1a) y el Día 5 (Figura 1b) post-infección.
Independientemente del grupo, IFN γ
los niveles de mRNA se incrementaron significativamente en el día 3 y aún más en el Día 5 cuando comparación
con el día 1. Nota la gran diferencia de escala del eje y entre las Figuras 1a y 1b. Si bien la infección de la gripe
aumentó IL-10 expresión génica significativo-
104 • El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones

citoquinas EX SED
ly por el día 5 pi, no se encontraron diferencias
BLC 2,988.29 1,366.63
signifi- signifi- entre EX y SED en IL-10
CD30L 1,282.62 0.00
expresión de genes en el día 3 o 5 pi (Figura 2);
eotaxina 1,897.55 0.00
aunque hubo una tendencia (p = 0,10) para la
Eotaxina-2 1,503.41 0.00
expresión de IL-10 gen a ser menor en los
ligando FAS 305,27 0.00
ratones EX en el Día 5 pi También comparamos
Fracktaline 4.08 0.00 IFN- γ y IL-10 expresión génica en los pulmones
G-CSF 0.00 0.00 de ejercido (para 1 o 4 días y se sacrificaron 24
GM-CSF 4,023.74 4,153.74 h después de la última sesión de ejercicio), pero
IFN γ 43.34 2,165.44 no infectados, los ratones con la de los ratones
IL-1 α 4,312.05 2,578.38 no infectados sedentaria. Se encontró que el
IL-1 β 2,554.57 243,31 ejercicio por sí solo no afectó apreciablemente
IL-2 591,69 0.00 IFN γ o IL-10 expresión génica en el pulmón en
IL-3 0.00 0.00 comparación con ratones sedentaria. Más-más,
IL-4 255.96 0.00 el nivel de IFN γ y IL10 la expresión génica en los
IL-6 0.00 0.00 pulmones de sedentario infectado no o ratones
IL-9 0.00 0.00 ejercido fue muy baja en comparación con los
IL-10 0.00 0.00 ratones infectados.
IL-12p40 / p70 338,24 0.00

IL-12p40 0.00 0.00

IL-13 1,679.28 2,988.31

IL-17 0.00 765,12

I-TAC 0.00 1,379.57

KC 0.00 834.00 El ejercicio provoca una reducción cualitativa en

La leptina 0.00 93.23 Th1 y un aumento de las proteínas Th2 en los

LIX 1,841.02 3,732.08

pulmones de ratones infectados de influenza. Se
utilizó una matriz de anticuerpos para evaluar
linfotactina 0.00 1,076.71
cualitativamente la expresión de proteínas de
MCP-1 2,661.98 3,004.55
citoquinas inflamatorias en agrupados (cantidades
M-CSF 404,20 894,15
iguales de proteína por ratón) muestras de pulmón
MIG 0.00 0.00
de ratones SED y EX en el día 3 pi. Como puede
MIP-1- α 0.00 0.00
verse en la Tabla
MIP-1- γ 10,887.22 6,527.00

RANTES 7,405.86 9,855.47

3, los niveles de muchas proteínas inflamatorias
SDF-1 0.00 2,017.47
fueron alterados por el ejercicio. Más
TCA-3 4,489.18 3,879.45
notablemente, en comparación con los ratones
TECK 637,86 1,037.31i
SED, el ejercicio resultó en una reducción 2-
TIMP-1 5,689.52 4,475.25
veces en IFN γ, RANTES, IL-13, IL-17, I-TAC,
TIMP-2 1,271.95 1,801.83
SDF-1, KC,
TNF α 1,776.01 1,728.44
LIX, M-CSF y linfotactina. aumentos de
sTNFRI 2,522.22 1,542.28
dos veces en la eotaxina, eotaxina-2,
sTNFRII 1,968.53 743,47
IL-2, IL-4, BLC, sTNFRI y II y CD30L se
Tabla 3. expresión de la proteína cualitativa (expresada como unidades observaron en ratones ejercido, así como
arbitrarias) en los pulmones 3 días después de la infección. Los IL-1 α
números en verde o indicar a> 2 veces y IL-1 β. Sin embargo, el pro- inflamatoria de
aumento de la expresión en comparación con SED. Los números en citoquinas TNF α fue similar en ambos
rojo o indicar a> disminución de 2 veces en grupos y IL-6 fue indetectable en tampoco.
expresión en comparación con SED.
 El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones • 105

mi Xercise no afecta a los pulmones IFN ββ expresión. IFN β SIDA en la respuesta temprana ral antivi- través
de la activación de la transcripción de muchos genes, incluyendo el
ARN de doble cadena acti- vada
90
sedentaria proteína quinasa (PKR) y proteínas
80 Ejercidas
Mx, que a su vez alteran la
70
replicación de virus de la gripe (32).
60 mientras IFN β expresión en pulmones
50 infectados tendió (p = 0,11) a ser
IFN (pg / ml)

40
mayor el Día 1 después de la
infección en los ratones EX no hubo
30
diferencias estadísticas BET grupos
20
ween (Figura 3).
10

0
1 5
El ejercicio tiende a reducir la
Días después de la infección
replicación viral temprana en los
Figura 3. Efectos del ejercicio sobre IFN- β expresión de la proteína en los
pulmones de ratones infectados de
pulmones de ratones después de la infección con A / PR / 8/34. (N = 8 por
influenza. Influenza A / PR / 8/34
grupo).
infección en el pulmón era ured medi-
usando PCR en tiempo real con un
6
conjunto de cebador / sonda que
sedentaria
amplifica el gen de virus-codificada de
5
Diferencia N-Fold en M1 la expresión de proteína de genes

Ejercidas
matriz (M1). Usando la expresión de este
4
producto del gen viral tardía como un
marcador sustituto para la replicación del
3 virus (11), los datos demostraron una
tendencia de ejercicio para reducir la
2
expresión del gen M1 viral en el pulmón
(Figura 4). Si bien no hubo no puede
1
signifi-

0
1 3 5
tratamiento efectos
Días después de la infección
entre EX y grupos SED, en los días
Figura 4. Efectos del ejercicio sobre el virus de la influenza la expresión génica
1, 3 y 5 M1 expresión gen de la
M1. Sedentario 24 hr muestra después de la infección fue utilizado como
proteína era 40-60% de la de los
referente. Aunque no es estadísticamente significativa, hubo una tendencia hacia
ratones SED. No es sorprendente,
la replicación viral más baja en el ejercicio en comparación con ratones
hubo un aumento significativo en el
sedentarios. la expresión del gen M1 en los pulmones de ratones después de la ARNm viral en el Día 3 y Día 5 pi en
infección con A / PR / 8/34 (n = 11, 8, y 10 en cada grupo en los días 1, comparación con el Día 1.

3, y 5 después de la infección, respectivamente).

Discusión

Después de la inoculación intranasal con el virus A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1), los ratones desarrollan una
infección del tracto respiratorio inferior con consolidación pulmonar resulta en la muerte a partir del día 6 después de la
infección (38). En un estudio anterior (25), encontramos
 virus de la gripe en ratones

que el ejercicio moderado, cuando se realiza durante las etapas iniciales de una respuesta inmune primaria de
montaje a la infección de la gripe, mejora de la supervivencia en ratones. En este estudio de seguimiento, la
hipótesis de que el ejercicio podría cambiar la respuesta inmune a un fenotipo Th1 inflamatoria a una respuesta
antiinflamatoria Th2. La hipótesis de que tal un cambio resultaría en una disminución de la patología pulmonar
mediada por inmuno y que por lo tanto explicar por qué los ratones ejercido tuvo mayores tasas de supervivencia
como se ha visto en nuestro estudio anterior. Para hacer frente a esta hipótesis, se ejem- Ined los pulmones y los
órganos linfoides secundarios (MLNs y el bazo) de ratones ejercido y sedentario en los días 1, 3, o 5 después de la
infección con el virus de influenza A.

En apoyo de la hipótesis, los datos ilustran que el ejercicio moderado, per- forman en las primeras etapas de
una respuesta inmune primaria de montaje a la infección por virus de la gripe, resultó en una reducción significativa
en el número total de células infil- trar el pulmón. Este efecto supresor del ejercicio fue sin tener en cuenta el tipo de
células. Además, los datos mostraron que el ejercicio redujo significativamente la expre- sión de la citoquina
inflamatoria potente Th1 IFN γ, sin alterar la expresión del gen de la citoquina Th2 IL-10. Aunque es bien sabido que
(34).
Th1 Mientras
mediada que el papel
respuestas de son
inmunes los eosinófilos
responsablesende
106 • El ejercicio
aclaramiento delyvirus
la respuesta inmune
de la gripe a la infección
y la recuperación por
de la
infección (42), hay alguna evidencia para sugerir que una exagerada respuesta inflamatoria Th1 a virus de la gripe
puede causar la patología pulmonar y aumento de la mortalidad (38). De hecho, la inyección de la neutralización de
anti-TNF- α anticuerpos en el momento de la infección por influenza reducen la gravedad de la lesión pulmonar y la
supervivencia prolongada por 24 hr (31). Por otra parte, el tratamiento con IL-1 antagonista del receptor produjo un
pequeño pero estadísticamente significativo incremento de las tasas de admisión y de supervivencia de los alimentos
después de la infección de la gripe en ratones (37). También hemos encontrado que el ejercicio no tuvo efecto sobre
sión de la proteína antiviral temprana de pulmón expre- IFN β. Esto, junto con la incapacidad de detectar una
reducción en la replicación viral (aunque hubo una tendencia), sugiere que el ejercicio moderado no afectó las
defensas inmunitarias innatas temprana en este modelo de influenza que podrían contribuir a la reducción de la
mortalidad.

De acuerdo con nuestros datos de expresión génica, análisis de matriz de anticuerpos tein pro cualitativa
de homogeneizado de pulmón obtenido en el día 3 después de la infección revelaron un cambio inducido por el
eotaxinas; que actúan como quimioatrayentes para eosinófilos y son inducidos por las citocinas Th2 IL-5
ejercicio de una Th1 hacia una respuesta inmunitaria de tipo Th2. El ejercicio resultó en una mayor que la
reducción de dos veces en los niveles de proteína de IFN γ, linfo Tactin, IL-17, IL-13, I-TAC, KC, leptina, SDF-1, y
LIX y una mayor que dos veces mayor en eotaxina, eotaxina-2, IL-2, IL-4, BLC , FasL, IL-12p40 / p70, y CD30L.
Aunque no es completamente consistente con nuestra hipótesis debido a elevados de IL-12 (aunque la expresión
de esta proteína era bajo), es de destacar que el ejercicio llevado a un aumento en muchas citocinas que se
caracteriza por ser de tipo Th2 y una disminución en aquellos que son indicativos de una respuesta Th1. Por
ejemplo, además de la reducción en ción IFN- γ, el ejercicio también reduce los LPS inducida por CXC de neutrófilos
chemoat- tractant LIX que se ha demostrado estar involucrados en la patogénesis del tejido en el modelo de sal
inducida por dextrano sódico de colitis (22). Por otra parte, el ejercicio reduce interferón-inducible de células T α quimioatrayente
(ITAC), que desempeña un papel fundamental en la atracción de células T efectoras en los sitios de inflamación de
tipo Th1 y está involucrado críticamente en el desarrollo de enfermedades múltiple de tipo Th1 inflamatorias (9, 27)
y aloinjerto rechazo (17).

Por el contrario, el ejercicio aumento de la expresión de IL-4 (el prototipo de citocina Th2) y las
 El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones • 107

defensa contra la infección viral es controvertida, gránulos de eosinófilos contienen abundantes

ribonucleasas que degradan ARN que contiene virus de cadena simple (34). Curiosamente, el ejercicio
también resultó en un aumento de la expresión de IL-1 α
y IL-1 β en los pulmones de ratones infectados que aparece en desacuerdo con un Matory anti-infla- o Th1 reduciendo
efecto del ejercicio. Sin embargo, mientras que la IL-1 es responsable de la inmunopatología pulmonar aguda
También conduce a aumento de la supervivencia en respuesta a A / PR / 8/34 (35). Por último, los pulmones del
grupo ejercido muestran más altos nive- les de receptores de TNF solubles con ningún cambio en TNF- α que indica la
inducción de la anti-inflamación. Los resultados de este análisis cualitativo matriz de anticuerpos deben ser
interpretados con precaución (aunque el análisis se verifica que IFN γ proteína fue menor, de acuerdo con nuestra
expresión génica de datos) y los estudios futuros tendrán que estadísticamente verificar los cambios de expresión de
la proteína a partir de datos de animales viduales indi-. Hemos previsto un aumento de la histopatología pulmonar,
aunque en los pocos animales que examinamos no parecía que el ejercicio tuvo un efecto marcado sobre el daño del
tejido pulmonar, estos estudios estaban lejos de ser concluyentes debido a la histopatología solamente fue
examinado en los días 1, 3 y 5 después de la infección, probablemente demasiado pronto para distinguir las
diferencias entre los grupos.

Existe un precedente que el ejercicio y otros factores de estrés pueden causar cambios lejos de Th1 a
Th2 respuestas inmunes (2, 36) y que hace tiempo se sabe que los glucocorticoides y las prostaglandinas de la
serie E (PGE 2 en particular) puede disminuir Th1 y aumentar mediadas por Th2 respuestas inmunes (8, 15).
Mientras catecolaminas también pueden desempeñar un papel, Kohut et al. (2004) encontró que β bloqueo de
ejercicio exacerbado los aumentos inducidos por el entrenamiento en el VHS-inducida in vitro IFN γ

la producción en ratones jóvenes, pero disminuyó esta misma respuesta en ratones de edad (21). hormonas
neuroendocrinos están claramente implicado en aguda y estrés crónico inducido por alteraciones en el tráfico de
leucocitos y aumenta, disminuye, o cambios en la composición de la afluencia celular podrían tener
consecuencias beneficiosas o perjudiciales dependientes del contexto inmunológica (39). Por desgracia, un
papel definitivo para las moléculas neuroendocrinos específicos como responsable de ejercicio o los cambios
inducidos por el estrés en el equilibrio Th1 / Th2 espera un mayor estudio. Es interesante observar que, si bien
los cambios completos de distancia de las respuestas inmunes mediadas por Th1 serían perjudiciales en los
animales infectados por virus de una TLE más sub-contra-regulación de las respuestas Th1 puede ser
beneficioso.

dosificación Ejercicio y el momento de ejercicio relativa a la infección aparecen crítico para determinar si
el ejercicio reduce o aumenta la morbilidad y / o mortalidad a las enfermedades infecciosas. Los datos sugieren
un efecto hormético donde los periodos cortos de ejercicio prolongado o ejercicio intenso durante síntomas
exacerba la enfermedad (6, 10, 12, 13, 16, 18, 29), mientras que la práctica de ejercicio moderado antes o
ejercicio moderado durante los primeros tiempos después de la infección (pero antes manifiesta síntoma Toms)
aminora gravedad de la enfermedad (3, 7, 16, 25, 30) o es sin efecto (40, 41).

Sólo unos pocos estudios han examinado las alteraciones inducidas por el ejercicio en la respuesta
inmune que podría explicar los cambios en la morbilidad o mortal- idad. Kohut et al. (2001) examinaron la ex
vivo respuestas de citocinas a en la infección por HSV-1 después de una sola sesión de ejercicio prolongado
(19), que se habían encontrado previamente aumenta la mortalidad a un reto tan (6). Esta ~ 2,5 hr plazo
resultó en una reducción de la producción ex vivo de esplenocitos de tanto Th1 (IL-2, IFN γ y IL-12) y Th2
(IL-10) citoquinas en el Día 2, pero no el día 7 (excepto para IL-12), la infección posterior (19). Por otra parte,
Kapasi et al (2004) encontraron que, o bien sola o multi-
108 • El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones

PLE episodios de ejercicio exhaustivo disminuyeron T CD8 + fibras No. de orden célula LCMV-específicos y su
producción de IFN γ en respuesta a la infección por LCMV en ratones de edad joven, pero no (18). Las
consecuencias clínicas de esta, sin embargo, no se INED ejem-. Estos datos son consistentes con el examen de
nuestros datos en vivo respuestas a la gripe en el pulmón, excepto que no documentó una disminución de la IL-10.
Es interesante observar los diferentes efectos de dosis-respuesta de ejercicio moderado (aumento de la
supervivencia) vs ejercicio prolongado (disminución de la supervivencia) sobre la mortalidad a pesar de cambios
similares en la producción de citoquinas.

El empleo de un paradigma ejercicio diferente, Davis et al. (2004) encontraron que 1 hr de ejercicio moderado
realizó al día durante 6 días antes de la infección HSV-1 como resultado una disminución de 45% en la morbilidad y
38% en la mortalidad cuando En comparación con los ratones sedentaria (7). Un papel mecanicista para los cambios
inducidos por el ejercicio en la función de los macrófagos alveolares se confirmó recientemente cuando este grupo
demostrar trado que el agotamiento de los macrófagos alveolares con liposomas clodronato encapsulado podría derogar
la moderado aumento inducido por el ejercicio de la morbilidad y la mortalidad (28). Al parecer en desacuerdo con la
reducción inducida por el ejercicio en IFN γ visto en nuestro estudio, Kohut et al. (2004) encontró que 8 semanas de
entrenamiento de ejercicio moderado antes de la infección por HSV-1 aumentó IFN γ y la producción de IL-2 en cultivos
de esplenocitos estimulados con HSV-1 una semana después de la infección en los años de edad, pero no en ratones
jóvenes (20). Este efecto fue mediado probablemente por los aumentos inducidos por el ejercicio en las catecolaminas
actuando a través β- receptores adrenérgicos, al menos en ratones de edad (21). Los diferentes resultados de su estudio
en comparación con la nuestra probablemente se puede atribuir a diferentes ratones viejos, los protocolos de ejercicio
(entrenamiento vs aguda) y la exposición al virus.

Mientras que las bases mecanicistas de la respuesta a la dosis diferencial para el ejercicio son difíciles
de conciliar, puede ser que el ejercicio moderado y formación previa reducen el daño inmune mediada sin
afectar gravemente las funciones efectoras inmunes. El ejercicio extenuante, por el contrario, puede ser de
intensidad suficiente para reducir las funciones efectoras que permiten la progresión de la enfermedad
infecciosa. En apoyo de esto, hemos encontrado que el ejercicio moderado, cuando se aplica durante las etapas
iniciales de una respuesta inmune de montaje a la gripe, provoca un cambio en la respuesta inmune de
distancia de una Th1 y hacia una respuesta Th2 sin alterar principios de las defensas anti-virales. Esto puede
ser responsable del aumento de las tasas de supervivencia en ratones ejercido debido a una fuerte respuesta
Th1 puede conducir a inmune mediada por la patología y la muerte.
 El ejercicio y la respuesta inmune a la infección por virus de la gripe en ratones • 109

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