Biotecnología Alimentaria

Rommel Granja
1
Enzimas

2
 Enzimas
• SON Proteínas que se comportan como
catalizadores a excepción de las ribozimas
• CARACTERISITCA aceleran la velocidad de las
reacciones
• COMO LO HACEN Disminuyen la energía que
requiere la reacción para poder ser realizada = Ea.
Energía de activación
• ACTUA sobre usa molécula específica denominada
sustrato que será convertido en producto de interés
• La enzima No sufre ningún cambio durante la
reacción que participa
 DEFINICIONES
• Velocidad de reacción : Es la cantidad de
producto formado por unidad de tiempo
• Energia de activacion Es la minima cantidad
de energia que se necesita para iniciar una
reaccion quimica
• Sustrato: Es la molecula sobre la cual actua la
enzima para formar productos
• Sitio activo Es la zona de la enzima en la cual
se une el sustrato, para que se produzca la
reaccion
 Enzimas
• Apoenzima Es la parte proteica de la enzima, sin
cofactores o grupos prostéticos. Es catalíticamente
inactivo.
• Cofactor. Pequeñas moléculas orgánicas o
inorgánicas, que requiere la apoenzima para ser
activa
• Grupo prostético. Es similar al cofactor, pero esta
fuertemente unido al apoenzima
• Holoenzima Es la enzima activa. Formada por la
adición de cofactores o grupos prostéticos a la
apoenzima
 Enzima

HOLOENZIMA= APOENZIMA (parte proteica) + COFACTOR

(no proteica)
Enzima
 Enzimas como catalizadores

Apoenzima

Holoenzima
Cofactor Disociable: coenzima o
cosustrato

No disociable: grupo
prostético.

8
VITAMINAS
 Enzimas
• Las enzimas catalizan la reacción bajando la energía
requerida para pasar de sustrato a producto.
Enzimas
 Enzimas como catalizadores

• Modelo llave-cerradura (Emil Fischer, 1894).

• Modelo de ajuste inducido (Koshland, 1958).

12
 13
Lehninger, A. (2009). Principios de Bioquímica. Barcelona, España:
Omega
Triosa fosfato isomerasa

14
Triosa fosfato isomerasa

15
Triosa fosfato isomerasa

16
 Triosa fosfato isomerasa

His95
Glu165 17
18
Triosa fosfato isomerasa

19
PDB: 3UWU
 Factores que afectan la actividad
enzimática
• Temperatura
T óptima = T en la que se obtiene la máxima actividad
enzimática
T óptima en humanos = 37 ºC – 37,5ºC
 Factores que afectan la actividad
enzimática

• pH

pH opt para E intracelulares = 7

pH= 1-6, enzimas digestivas
pH= 8-12, enzimas de cavidad oral
 Factores que afectan la actividad
enzimática
• Concentración de la
enzima

• Concentración del
sustrato
 Enzimas - Inhibidores
• INHIBICIÓN REVERSIBLE -
COMPETITIVA
El inhibidor es una molécula
que presenta un cierto
parecido estructural con el
sustrato de manera que
puede competir con él por
acceder al centro activo

complejo enzima-inhibidor
 Enzimas - Inhibidores
• Inhibidores: Reducen o detiene actividad catalítica de
la enzima, bloqueando o distorsionando el sitio activo.
• Inhibición irreversible: inhibidores se combinan de
modo permanente con el enzima uniéndose
covalentemente a algún grupo funcional esencial para la
catálisis con lo que el enzima queda inactivado
irreversiblemente
• Inhibición reversible: Los inhibidores reversibles se
combinan transitoriamente con el enzima, de manera
parecida a como lo hacen los propios sustratos. Algunos
inhibidores reversibles no se combinan con el enzima
libre sino con el complejo enzima-sustrato.
"(...) Desgraciadamente, estas descripciones de las clases de enzimas se
solapan y muchos son dominados por dos o más nombres. La succinil -
CoA sintetasa, por ejemplo, es conocida también como succinato
tioquinasa; el enzima es una sintetasa en el ciclo del ácido cítrico y una
quina cuando actúa en la dirección de la síntesis de succinil - CoA. Esto
origina una nueva fuente de confusión en la nomenclatura de los enzimas.
Una enzima puede haber sido descubierto gracias a un ensayo enzimático
en el que, por ejemplo, A se convierte en B. El enzima recibe entonces un
nombre por dicha reacción. Sin embargo, se puede llegar a demostrar en
trabajos posteriores que en la célula el enzima actúa mayoritariamente
convirtiendo B en A. Normalmente continúa utilizándose el nombre inicial
aun cuando el papel metabólico del enzima estaría mejor descrito si lo
llamáramos en virtud de la reacción opuesta. (...) Comités internacionales
han hecho esfuerzos heroicos para sistematizar la nomenclatura
enzimática, pero algunos nombres sistemáticos han demostrado ser
demasiado largos, de difícil manejo y de uso no muy frecuente (...).

25
Lehninger, A. (2009). Principios de Bioquímica. Barcelona, España:
Omega
 CLASIFICACION - ENZIMAS
• Primer número = mecanismo de acción.
• Hay 6 grandes clases de enzimas:

– EC1: oxidorreductasas
– EC2: transferasas
– EC3: hidrolasas
– EC4: liasas
– EC5: isomerasas
– EC6: ligasas http://www.brenda-
enzymes.org/ 26
 CLASIFICACION - ENZIMAS

• Se dividen en 6 clases acorde a la reacción

que catalizan
1. Oxidoreductasas
2. Transferasas
3. Hidrolasas
4. Liasas
5. Isomerasas
6. Ligasas o Sintetasas
CLASIFICACION - ENZIMAS
1.Oxidoreductasas

• Cataliza reacción de oxidación y reducción

 CLASIFICACION - ENZIMAS
2.Transferasas

Transfiere un grupo funcional de un sustrato a

otro sutrato

Hexocinasa fosforila a la hexosa etapa importante

inicio de la glucolisis
 CLASIFICACION - ENZIMAS
3. Hidrolasas

• Hidroliza ésteres, éteres, enlaces peptídicos, enlaces

glucosídicos adicionando agua para romper el enlace
• Realizan hidrolisis de polímeros obteniendo
monómeros
• Todas las enzimas digestivas son hidrolasas
 CLASIFICACION - ENZIMAS

4. Liasas

• Remueven grupos de sustratos o rompen enlaces por

mecanismos diferentes a la hidrolisis
 CLASIFICACION - ENZIMAS
5. ISOMERASAS

• Producen isómeros ópticos geométricos o

posicionales de sustratos

C3H7O6P.
 CLASIFICACION - ENZIMAS
6. Ligasas

• Unen dos sustratos, generalmente con la hidrolisis

simultanea de ATP
• Sintetasa. Son enzimas ATP-dependientes que
catalizan reacciones de biosíntesis
• Sintasas. Son enzimas que catalizan reacciones de
biosíntesis, pero no requiere ATP directamente

Acetil CoA carboxilasa

CLASIFICACION - ENZIMAS
 CLASIFICACION - ENZIMAS
• Enzimas que procedan de organismos diferentes, pero
que catalicen la misma reacción, recibirán el mismo
número.
• Los números representan una clasificación progresiva
más específica de la enzima.
• Ejemplo: enzima tripéptido aminopeptidasa (EC
3.4.11.4):
• 3 = hidrolasa.
• 3.4 = hidrolasa, que actúa sobre los enlaces peptídicos.
• 3.4.11 = actúan sobre el terminal amino de aa.
• 3.4.11.4 = actúan sobre el terminal amino final de un
tripéptido.
35
 Aplicación de enzimas en la
industria alimentaria
• Industria panadera
• Producción de lácteos
• Producción de bebidas
• Elaboración de cerveza
 Industria panadera
• Mercado de $695.1 millones de dólares creciendo
en 8.2% para el 2019
• Proporcionar mejora de la harina, Estabilidad de
la masa, mejora de la textura, volumen y color,
suavidad de la miga, estructura de miga uniforme
y prolongar la frescura del pan
Enzima uso

Transglutaminasa Mejorar la calidad de la harina

Se añade a la harina de pan para retener la humedad
de manera más eficiente para aumentar la suavidad, la
Amilasa frescura y la vida útil
Lipasa y Xilanasa Para la estabilidad y acondicionamiento de la masa
glucosa oxidasa y la para mejorar el fortalecimiento de la masa y la
lipoxigenasa blancura.
 Producción de lácteos
• Enzimas lácteas ayudan al desarrollo y mejora de las características
organolépticas (aroma, sabor y color) y mayor rendimiento de los
productos lácteos.
• Rennet : Es una combinación de quimosina y pepsina, se utiliza para la
coagulación de la leche en cuajada sólida para la producción de queso y
suero lıquido
 Industria de bebidas
• Enzimas industriales se utilizan en
las fábricas de cerveza como
coadyuvantes de elaboración y para
producir productos consistentes y de
alta calidad.
• En las industrias cerveceras, las
enzimas microbianas se utilizan para
digerir la pared celular durante la
extracción de material vegetal para
proporcionar un rendimiento, color y
aroma mejorados y productos más
claros
 Industria de bebidas
• Aplicación de celulasas, amilasas y
pectinasas durante el procesamiento de
zumos de frutas para maceración,
licuefacción y clarificación, mejora el
rendimiento y la rentabilidad
• La calidad y la estabilidad de los jugos
fabricados se potencian mediante la adición
de enzimas.
• Las enzimas digieren pectina, almidón,
proteínas y celulosa de frutas y verduras y
facilitan rendimientos mejorados,
acortamiento del tiempo de procesamiento
y mejora de las características sensoriales
Industria de bebidas
Rol de las enzimas en la industria
Cinética enzimática

43
 Actividad enzimática

• La cuantificación enzimática se basa en la

medición de la velocidad de reacción:
S⎯
⎯→ P E

• Entonces:
dp ds
act  v = =−
dt dt
44
 Actividad enzimática

• Si medimos la aparición de producto en el

tiempo, se observa que la v (pendiente de la
curva) disminuye gradualmnte:
– Inactivación
– Reversión
– Inhibición por producto
– Desaturación (agotamiento) del sustrato

45
46
Actividad enzimática

47
 Actividad enzimática
• Se “normaliza” la medición.
• La velocidad de reacción es siempre la
velocidad inicial:

 dp   ds 
act  vt →0 =   = − 
 dt t →0  dt t →0

• Representa, entonces, el máximo potencial

catalítico para alguna condición dada. 48
 Actividad enzimática

• La facilidad de obtener la velocidad depende de

las técnicas de cuantificación de sustrato o
producto.
Medición
Medición continua
discontinua

Un solo ensayo Varios ensayos

Requiere detener la
No requiere detener la
reacción a un tiempo
reacción
específico

El blanco puede ser la

Requiere de blanco
muestra a t=0 49
50
Sustratos sintéticos:
p-Nitrofenil-R

51
52
 Actividad enzimática

• La medición puede ser continua a discreta.

• En ambos casos se obtiene una curva que
inicialmente lineal.
• En el caso de realizar una medición
discontinua hay que averiguar primero el rango
de linealidad.
• El rango de linealidad depende de la
concentración enzimática.
53
 Actividad enzimática

• Tiempos usuales de rango de linealidad son de

10 a 30 minutos.
• Se debe usar un blanco.
• El método espectrofotométrico es el más
usado.
• Cofactores son de utilidad. (NAD y FAD)

54
55
 Actividad enzimática

• La unidad internacional (Unión Internacional

de Bioquímica) la definió como:
– La cantidad de enzima que cataliza la conversión
de 1 µmol de sustrato por minuto, en condiciones
definidas.
• Las condiciones definidas son:
– Concentración de sustrato saturante
– pH y T óptima

56
 Actividad enzimática

• Su símbolo es “U” y se utiliza también en

combinación con otras unidades:
– U/mg de proteína (actividad enzimática específica)
– U/mL (concentración de actividad enzimática).
• 60 x 106 U ≈ 1 katal (símbolo kat).
• 1 katal es la unidad del SI para la actividad
catalítica. Es la actividad catalítica responsable
de la transformación de 1 mol de compuesto
por segundo.
57
 Relación velocidad vs. [S]

V
Velocidad de la reacción (v)

𝑉𝑚𝑎𝑥 ⋅ 𝑠
𝑣=
V/2 𝐾𝑀 + 𝑠

K Concentración de Sustrato [S]

58
 Significado de K

1. Constante de equilibrio de disociación del complejo

ES (equilibrio rápido)
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el
sustrato (equilibrio rápido)
3. Mide la función de fijación (equilibrio rápido)
4. Concentración de sustrato para la que la v es igual a
la mitad de vmax
5. Se define para una pareja enzima-sustrato
6. Tiene unidades de concentración

59
 Significado de V=k3e

1. Velocidad asintótica para s

2. Directamente proporcional a la concentración de

enzima (actualmente se caracteriza una enzima
por k3)

3. Mide función de transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

60
En la conversión de sacarosa en glucosa y fructosa mediante la
enzima invertasa, se ha obtenido el resultado que muestra la
tabla:
Tiempo (min) Glucosa (g/L)
0 0
1 0,084
1,5 0,119
2,0 0,152
2,5 0,198
3,0 0,238
5,0 0,415
8,0 0,661
10 0,895
15 1,251

Determine la actividad enzimática volumétrica de un

preparado enzimático líquido, si la reacción se lleva a cabo con
0,5 mL del preparado enzimático (diluido 7 veces), y 9,5 mL de
sacarosa 250 g/L, siendo inactivada en un baño a ebullición por
3 minutos. 61
La enzima β-galactosidasa (EC 3.2.1.23) cataliza la hidrólisis de lactosa en
glucosa y galactosa, y es muy utilizada en la industria láctea. Una preparación
comerical líquida de β-galactosidasa obtenida de Kluyveromyces marxianus var
lactis está siendo utilizada para la producción de leche baja en lactosa. Se
conoce que 500 UI de β-galactosidasa por litro de leche se requiere para
reducir el contenido de lactosa en la leche en un 80% durante el
almacenamiento (considerado satisfactorio) y se pide calcular la dosis
enzimática requerida para este proceso en unidades de mL del preparado
enzimático a ser añadido por litro de leche.
Para ello, la actividad enzimática del preparado de β-galactosidasa deber
determinado. El ensayo enzimático se basa en la determinación de la glucosa
liberada mediante HPLC con un detector de índice refractario. El
procedimiento analítico consiste en añadir 0.3 mL del preparado enzimático,
diluido tres veces, en 1.2 mL de una solución de lactosa a una concentración de
150 g/L e incubar la mezcla a 35 °C y un pH de 6.4. Se toman muestras a
diferentes tiempos de la reacción y se somenten a una inactivación enzimática
por ebullición, para finalmente filtrara las muestras antes del ensayo en el
HPLC. Los siguientes resultados se han obtenido:

62
 1400
1200
t (min) g (mM) 1000
0 0 800
2 150 600
4 307 400
y = 19.655x + 321.41
6 461 200 R² = 0.6633
8 597 0
0 20 40 60
12 912
18 942
26 976 1000
36 999 800
48 1015
600

400

200 y = 75.75x + 0.5

R² = 0.9997
0
0 5 10 15
 Inhibición enzimática

• Modulador: sustancia que interactúa de manera

reversible con la enzima modificando su
comportamiento cinético.
• La mayoría ejercen un efecto negativo
(inhibidor).
• Inhibidor: sustancia que interactúa
reversiblemente con la enzima disminuyendo
su potencial catalítico.

64
 Inhibición enzimática

e i d
E+ I 
⎯→ EI
• Si el proceso no fuese reversible se habla de inactivación.

V s VAP  s
v= Inhibición v=
K +s K AP + s

65
 Inhibición enzimática

• Competitivo: K AP = f (i)
VAP = V
afecta la afinidad

• No competitivo: K AP = K
VAP = f (i)
afecta la reactividad

• Mixto (acompetitiva) K AP = f (i)

afecta la afinidad y reactividad VAP = f (i )
66
Inhibición competitiva

67
Inhibición Mixta

k3 ' = 0 INC total

k3  k3 '  0 INC parcial
68
 Inhibición no competitiva

• El inhibidor afecta tanto la afinidad como la

reactividad, en estos casos:

𝐾𝐼 = 𝐾𝐼 ′ 𝐾 = 𝐾′

69
 Inhibición acompetitiva

k3 ' = 0 IA total k3  k3 '  0 IA parcial

70
Inhibición competitiva Inhibición mixta
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ 𝑠 𝑖 𝑠
𝑣= 1+
𝑖 𝐾𝐼 ′
𝐾𝑀 1+ +𝑠 𝑣=
𝐾𝐼 𝑖
1+
𝐾𝐼
𝐾𝑀 𝑖 +𝑠
1+
𝐾𝐼 ′

Inhibición acompetitiva
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑖 𝑠 Inhibición no competitiva
1+
𝐾𝐼 ′ 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑣= 𝑖 𝑠
𝐾𝑀 1+
𝑖 +𝑠 𝑣=
𝐾𝐼
1+ 𝐾𝑀 + 𝑠
𝐾𝐼 ′
71
 Inhibición por sustrato
• La inhibición se da por el mismo sustrato, cuando
éste se halla a elevadas concentraciones.

𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ 𝑠
𝑣=
𝑠2
𝐾𝑀 + 𝑠 +
𝐾′

𝑠 ∗= 𝐾𝑀 ⋅ 𝐾′

72
En un cultivo de bacterias, la velocidad de reacción de un
enzima E fue de 20 μg/min para una concentración de
sustrato de 3 mM. Si la concentración de sustrato es igual o
superior a 7 mM, la velocidad no supera los 40 μg/min. Al
añadir un inhibidor competitivo, la velocidad de la reacción
fue de 20 μg/min para una concentración de sustrato de 8
mM. Calculese la Km, la Vmax y la Ki para este enzima,
sabiendo que la concentración de inhibidor añadido es de 6
mM.

R. KM= 3 mM; V max= 40 μg/min; Ki= 3,6 mM

73
1. Habiéndose conseguido aislar de Salmonella tyfpimurium una
enzima que cataliza la reacción A→P, se decidió hacer un estudio
estructural y cinético de dicha enzima:

[A] mM 1,00 0,55 0,25 0,20

V (mmol P/ min) 1,00 0,71 0,50 0,41
V (nmol P/min) con J 0,66 0,41 0,25 0,20

donde J es un inhibidor de E cuya influencia como tal se quiere

estudiar. [J] = 0,25mM
Determinar: a) KM de la enzima estudiada para A, y Vmax para
la transformación A→P. b) ¿Qué tipo de inhibidor es J?. Calcular
Ki.

R. a) Vmax = Vmax APARENTE= 1,66 mmol P/min, KM= 0,5 mM y

KM APARENTE= 1,25 mM b) Inhibidor Competitivo, Ki= 0,16 nM
74
Desarrollo de biocatalizadores

75
Inmovilización de enzimas

76
Dumitriu, S. & Chornet, E. (1998). Inclusion and release of proteins
from polysaccharide-based polyion complexes. Advanced Drug
77
Delivery Reviews, Volume 31, Issue 3, 4 May 1998, Pages 223-246
 Enzimas inmovilizadas
✓ Eficiencia de uso
✓ Flexibilidad operacional
✓ Control de reacción
✓ Pureza del producto
✓ Costo fabricación X

Costo biocatalizador Costo proceso

E. inmovilizadas E. agregadas

78
 Soporte de inmovilización

✓ alta razón
✓regenerabilidad
superficie/volumen
✓ flexibilidad
✓ alta capacidad de
unión de proteína ✓ compatibilidad
✓ hidrofilicidad ✓ disponibilidad
✓ insolubilidad ✓ bajo costo
✓ estabilidad
✓ rigidez

79
 Enzimas inmovilizadas

O
Grupos aldehído Grupos ε-amino
(soporte activado)
C
H + NH2
lisinas

pH 10

CH N C N
Reducción

Base de Schiff Derivado enzimático

80
 Enzimas inmovilizadas

Estabilización de la enzima
por unión covalente multipuntual
A través de:

- varios residuos de la enzima

- unidos por brazos cortos al soporte

Rigididización Reduce los cambios conformacionales

3D inducidos por codisolventes, temperatura ...

81
Enzimas inmovilizadas

CLEA

Cross – Linked Enzyme Aggregates

82
 A
PEG Glutaraldehído

Enzima Soluble Enzima Precipitada CLEA

B

PEG Glutaraldehído

Enzima Soluble + Enzima Precipitada CLEA DP

83
PEI + DS
 CLEA G PVA

Enzima Soluble Enzima Precipitada CLEA CLEA LentiKatsTM

PRECIPITACION ENTRECRUZAMIENTO ENCAPSULACION

84
Ingeniería de enzimas

85
Ingeniería de enzimas

86
 Exposiciones enzimas en industria alimentaria

Amylases and bread firming an integrated view

Lipase applications in food industry

Potential Applications of Immobilized beta Galactosidase in Food

Processing Industries

Protein hydrolysis using proteases An important tool for food

biotechnology

Rennet-Induced Coagulation of Milk

Uses of Laccases in the Food Industry

87