LABORATORIO DE BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

ESPECTROFOTOMETRÍA.

Fecha de entrega 11/09/2019

Isabella Fernández, Steven Agredo, Jean Carlos Orozco, Diego Montaño

Universidad Santiago de Cali.

Informe presentado a la docente: Luz Dary Caicedo

e-mail:jeankrlosorozco5@hotmail.com, medicina2017@outlook.es,lusizerafin@hotmail.com

En el siguiente informe se hablará sobre la espectrofotometría y el proceso que se llevó a cabo durante la elaboración, donde
se mostrara la absorbancia del azul de bromotimol y el rojo Congo , al mismo tiempo hallando la concentración de estos dos
reactivos ( azul de bromotimol y rojo Congo ). Dando como resultado de estos dos que su absorbancia es directamente
proporcional a su concentración, donde su mayor absorbancia fue de 0,704 , concluyendo que sí se cumplió la ley de Lambert
y Beer , luego se llevó acabo la preparación y los cálculos para determinar la concentración de la muestra problema que nos
dio como resultado 2,43 mg/L

The following report will talk about the spectrophotometry and the process that was carried out during the
elaboration, where the absorbance of bromothymol blue and Congo red will be shown, at the same time finding
the concentration of these two reagents (bromothymol blue and Congo red). Giving as a result of these two that its
absorbance is directly proportional to its concentration where its highest absorbance was 0.704, concluding that
effectively the law of lambert and beer is fulfilled, then the preparation and calculations to determine the
concentration of the sample problem that resulted in 2.43 mg / L

PALABRAS CLAVE: ABSORBANCIA, CONCENTRACIÓN, ESPECTROFÓMETRO, LONGITUD DE ONDA

I. INTRODUCCIÓN

La espectrofotometría es uno de los métodos de

análisis más usados, y se basa en la relación que
existe entre la absorción de luz por parte de un
compuesto y su concentración. Cuando se hace
incidir luz monocromática (de una sola longitud de
onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la
luz incidente es absorbida por el medio y otra
transmitida, como consecuencia de la intensidad del
rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la
intensidad de la luz incidente y P la intensidad del
rayo de luz transmitido.[1]
Figura 1. Espectro electromagnético
En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a
la forma visible de radiación electromagnética, sino
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es
también a las formas UV e IR, que son invisibles.
la relación entre la cantidad de luz transmitida que
En espectofotometría de absorbancia se utilizan las
llega al detector una vez que ha atravesado la
regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400
muestra, It, y la cantidad de luz que incidió sobre
nm) y el visible (400-780 nm). [2]
ella, Io, y se representa normalmente en tanto por
ciento: % T = It/Io x 100 La transmitancia nos da
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
una medida física de la relación de intensidad
incidente y transmitida al pasar por la muestra. La
relación entre %T y la concentración no es lineal,
pero asume una relación logarítmica inversa.
La absorbancia (A) es un concepto más relacionado
con la muestra puesto que nos indica la cantidad de
luz absorbida por la misma, y se define como el
logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T =
-log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y
transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es
del 100% e indica que la muestra no absorbe a una
determinada longitud de onda, y entonces A vale
log 1 = 0.
Ley de Lambert-Beer : Esta ley expresa la relación
entre absorbancia de luz monocromática (de
longitud de onda fija) y concentración de un
cromóforo en solución: A = log I/Io = ε·c·l La
absorbancia de una solución es directamente
proporcional a su concentración –a mayor número
de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-;
también depende de la distancia que recorre la luz
por la solución –a igual concentración, cuanto
mayor distancia recorre la luz por la muestra más
moléculas se encontrará-; y por último, depende de
ε, una constante de proporcionalidad -denominada
coeficiente de extinción- que es específica de cada
cromóforo. Como A es adimensional, las
dimensiones de ε dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm
mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea
posible, en M, con lo que las dimensiones de ε
resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así
expresado, en términos de unidades de
concentración molar (o un submúltiplo apropiado),
se denomina coeficiente de extinción molar (εM).
Cuando, por desconocerse el peso molecular del
soluto, la concentración de la disolución se expresa
en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1,
las dimensiones de ε resultan ser distintas, por
ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado
se denomina coeficiente de extinción específico
(εs). La ley de Lambert-Beer se cumple para
soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía
con la concentración, debido a fenómenos de
dispersión de la luz, agregación de moléculas,
cambios del medio [2].
UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI
II. MÉTODOLOGÍA
Al iniciar la práctica nos asignaron para trabajar con
el reactivo azul de bromotimol (100 mg/litro) a pH
ácido, en primer lugar se realizó la determinación de
los espectros de absorción mediante la preparación
de dos tubos de ensayo, uno con 10 ml de agua
destilada que sirvió como blanco y en el otro se
mezcló bien 1 ml de azul de bromotimol(100
mg/litro) con 9 ml de agua destilada y una gota de
ácido acético al 5%. El espectro se realizó midiendo
la absorción de luz cada 30 nm, empezando desde
400 hasta 700 nm, cada lectura con una calibración
previa con el blanco a 100 de transmitancia.
Posteriormente se realizaron las gráficas
correspondientes de absorvancia vs longitud de
onda en nm.
Seguidamente se comprueba la ley de Beer-
Lambert, donde se analiza la variación de absorción
con respecto a la concentración de la sustancia que
se absorbe. Todo esto se realizó de la siguiente
manera: Primero se colocó el botón de longitud de
onda en el valor correspondiente a la longitud
máxima de absorción, se calibró con el blanco al
100% de transmitancia, se sustituye el blanco por
las soluciones de diferente concentración del Azul
de bromotimol(100 mg/litro), no se calibró el blanco
de nuevo. Posterior a esto se preparó las
disoluciones de la sustancia, a partir de la solución
original del Azul de bromotimol de 100mg, a cada
una de estas disoluciones se les agrega una de ácido
acético. En cada caso se tabularon los datos , se
elaboraron graficas de absorbancia vs.
Concentración en mg/l y se estableció la
concentración problema.
III. CALCULOS Y RESULTADOS
Los resultados obtenidos en la práctica de
laboratorio de absorbancia están registrados en la
siguiente tabla.
 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

Tabla. N° 1. Lectura de absorbancia en función

de los mg/L de azul de bromotimol y rojo Congo.

XCONCENTRACI ABSORBANCI
ÓN (mg/L) A
2,5 0,819
5 0,256
10 0,378
15 0,704
20 0,82
30 2,12
40 2,95

Grafica N°1
Seguidamente se calculó la concentración con la
siguiente ecuación: La grafica permite inferir que la absorbancia es
C 1 V 1=C 2 V 2 (Ecu. 1) directamente proporcional a la concentración y
que hay una media correlación entre la
Despejando esta ecuación obtenemos entonces: concentración y la absorbancia. Además se pudo
determinar mediante la ecuación de la recta y la
(C 1 ×V 1 ) curva de calibración.
C 2=
V2
Y =0,0673 X−0,0278 (Ecu. 3)
(Ecu. 2)
Al despejar la Ecu.3 y reemplazando el valor de
(100 mg× 0.5 mL) Y=0,135 y los valores de pendiente e intercepto
a)C 2= =5
10 mL de la ecuación de la recta se obtuvo lo siguiente:
(100 mg ×0.5 mL ) Y −m
b) C 2= =5 X=
10 mL b

(100 mg× 1.0 mL) (Ecu.4)

c) C 2= =10
10 mL
Entonces se tendría:
(100 mg× 2.0 mL)
d) C 2= =20 0,135−0,0673
10 mL X= =2,43 mg/ L
0,0278
(100 mg× 3.0 mL)
e) C 2= =30 Lo que nos permitió establecer el valor de la
10 mL
concentración de la solución problema que fue de
(100 mg× 4.0 mL) 2,43 mg/L.
f) C 2= =40
10 mL
V. DISCUSIÓN.
Una vez realizados los cálculos se hizo la gráfica
que se presenta a continuación.
 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

Al realizar el análisis de los resultados obtenidos [2] Espectrofometría: Espectros de absorción y

en la práctica, se puede observar que son cuantificación colorimétrica de biomoléculas
completamente satisfactorios debido a que el [vist.10 de sep 2019, 6:50]
momento de hacer la lectura de la absorbancia en
[3] Harold F. Walton, Jorge Reyes [1983] Análisis
cada 30nm de rango de la longitud de onda (λ) químico e instrumental modern [Vist. 10 de sep 2019,
de 400 nm a 700 nm, se determinó así que la 7:15pm]
máxima absorbancia fue de 0,704 , por lo tanto se
verifica que la respuesta es lineal, donde se puede
afirmar que dentro de las concentraciones de
trabajo se cumple con la Ley de Lambert y Beer,
con lo cual ´podemos calcular la absortividad,
obteniendo el cociente entre la pendiente y la
longitud del paso óptico.

La absorbancia es directamente proporcional a la

concentración, por tanto, siempre que la
concentración aumente la absorbancia también.

El uso adecuado del espectrofotómetro permitió

obtener en el laboratorio resultados con alta
calidad, sin embargo, el uso inadecuado de las
diferentes cantidades al elaborar las sustancias
problema pueden llevar a tener errores en el
laboratorio, donde se tiene en cuenta también la
calibración del instrumento, ya que si no cuenta
con los estándares solicitados pueden arrojar
errores en los resultados.

VI. CONCLUSIONES.
La longitud de onda y la absorbancia son directamente
proporcional hasta que alcanza el punto máximo de
longitud de onda.
Se pudo observar que dependiendo de la longitud de
onda en la que se aplique el rayo, se puede alcanzar
un punto máximo de absorción.

REFERENCIAS

[1]Guia TP química 2 [2010] [Visit. 8 de sep. 2019,

6:30pm]
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI