Effective clean-up and ultra high-performance liquid chromatography–tandem mass

spectrometry for isoflavone determination in legumes

Limpieza efectiva y cromatografía líquida de ultra alto rendimiento: espectrometría

de masas en tándem para la determinación de isoflavonas en leguminosas

Los brotes de leguminosas como el frijol, garbanzo, rabano, soja, entre otros, son
alimentos que se consumen en todo el mundo, estos alimentos son ricos en proteínas,
carbohidratos, fibras, vitaminas, saponinas, messina, y otros fitoquímicos como las
isoflavonas. Las isoflavonas son compuestos de naturaleza polifenólica que forman parte
del grupo de fitoquímicos, los flavonoides, y tienen como principal fuente es la soja y otras
leguminosas como las lentejas, garbanzos, entre otros.

En investigaciones anteriores, los métodos analíticos desarrollados para cuantificar las

isoflavonas rara vez podían determinar todos los compuestos, especialmente las
isoflavonas "libres", debido al bajo contenido de estos productos químicos en la matriz
alimentaria o debido a supresión de alta señal causada por la falta de pasos de limpieza
en el procedimiento de extracción. En el presente artículo, se investigó un método
analítico para la determinación de Cinco compuestos de isoflavona, tres agliconas,
daidzeína, genisteína y biocanina A, y dos glicosiladas, daidzina y genistina, en lentejas y
legumbres. El método utiliza la congelación como un paso de limpieza con cromatografía
líquida de alto rendimiento: espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS triple
cuadrupolo) se aplicó a 48 muestras de lentejas cultivadas en campos a diferentes
altitudes y otros pulsos (garbanzos, frijoles, habas, guisantes, una mezcla de frijoles y
escanda, y una mezcla de frijoles y lentejas) del centro de Italia para el análisis del
contenido de isoflavonas.

La selección de la solución de extracción y la técnica extractiva es un punto clave en el

proceso analítico. El disolvente perfecta sólo extrae los compuestos diana, pero este ideal
es muy difícil de lograr, porque siempre hay interferencias de otros componentes.
Encontraron que la mejor eficiencia de extracción para la mayoría de las isoflavonas se
obtuvo con una solución de extracción de MeOH: H2O (80:20, v/v), con este enfoque, fue
perfectamente posible extraer y analizar los analitos. La adición de un paso de limpieza
por congelación, después de la extracción de la muestra y antes del análisis de MS,
resultó fundamental para reducir la interferencia y la supresión de la señal. Los
experimentos se realizaron con y sin el paso de limpieza para evaluar el efecto de la
matriz. Las muestras se dispararon antes del procedimiento de extracción y después de la
extracción de la muestra (inmediatamente antes de la inyección de HPLC). Sin el
procedimiento de limpieza por congelación, las isoflavonas glucosiladas daidzina y
genistina mostraron un alto efecto de matriz, con una pérdida de señal debida a la
supresión de iones del 87% y 79%, respectivamente, mientras que los compuestos
aglicónicos daidzeína, genisteína y biochanina A no mostraron Efecto matricial
significativo.

Las muestras de lentejas fueron suministradas por agricultores locales, específicamente

camerino, montecavallo, capriglia, preci, fiastra, visso, norcia, castelsantangelo sul nera,
castellucío dii norcia, y otras legumbres como (soja, garbanzo, frijoles canellini, fava
frijoles, borlotti frijoles, guisantes, y mezclas de leguminosas), fueron elegidos porque son
los de mayor consumo en países mediterráneos . las mezclas seleccionadas fueron
molidas usando un mezclador Jolly y luego se tamizó a través de un tamiz Endecotts a
425μm para reducirlos a polvo fino. Después se pesó en un tubo de centrifuga con tapón
de rosca un 1g de la harina homogénea y 10 ml de disolvente de extracción (MeOH:H2O,
80:20 v/v). Posteriormente, la mezcla se homogenizó durante 10s y se centrifugó a
5000rpm durante 20 min. El sobre nadante se recogió y el residuo se lavo 2 veces y se
centrifugó nuevamente hasta recoger un volumen de 25 mL.

La solución obtenida se almacenó inmediatamente en el congelador durante la noche a

-24 ° C para precipitar los residuos proteicos o lipídicos que pueden interferir durante el
análisis UHPLC-MS / MS. Después de esta etapa, la solución metanólica se separó por
residuo y el metanol se evaporó utilizando un baño de agua con evaporador rotatorio
Büchi R 200 de Labortechnik Antes de la extracción, los cartuchos se activaron con 4 ml
de metanol y se acondicionaron con 4 ml de agua Milli-Q. Luego se cargaron 3 ml de
extracto acuoso en el cartucho, que luego se lavó con 4 ml de agua milli Q y se secó al
vacío durante al menos 10 minutos para crear una muestra final sin agua. Finalmente, las
isoflavonas libres y conjugadas se eluyeron con 4 ml de metanol y la solución final se
inyectó en el sistema UHPLC-MS / MS.

Los estudios de UHPLC-MS / MS se realizaron utilizando una serie Agilent 1290 Infinity y
un triple cuadrupolo 6420 de Agilent Technology, La separación de isoflavonas se logró
en una columna analítica Kinetex C18. ). La fase móvil para los análisis UHPLC-MS / MS
fue una mezcla de 10% de acetonitrilo de grado HPLC (A) y solución de tampón acuosa al
90% (B). El tampón estaba hecho de ácido fórmico al 0,05% y mM de formiato de amonio
que fluye a 0,5 ml / min con 0 min (10% B), 8 min (50% B), 12 min (10% B) y constante
hasta el final. De la carrera (18 min). Todos los disolventes y soluciones se filtraron a
través de un filtro de membrana de nylon de 0,2 um de Whatman (Dassel Alemania) antes
de su uso. Además, las muestras se filtraron antes del análisis UHPLC a través de un
filtro de jeringa de un solo uso de 0,2 um de Minisart RC 4, Sartorius Stedim (Goettingen,
Alemania). El volumen de inyección fue elución en gradiente 5 ul. La temperatura de la
columna fue de 30 ° C y la temperatura del gas de secado en la fuente de ionización fue
de 300 ° C. El flujo de gas fue de 12 l / min, la presión del nebulizador fue de 60 psi y el
voltaje capilar fue de 4000 V (negativo y positivo). La detección se realizó mediante
ionización por electrospray (ESI) -MS en el modo de "monitoreo de reacción múltiple"
(MRM). Las áreas de picos MRM fueron cuantificación integrada.

Para Revelar la relación entre las diferentes muestras de lentejas. basado en el contenido
de isoflavona según lo determinado por UHPLC / MS – MS, e identificar los principales
compuestos que influyen en la variabilidad, la matriz de datos de composición de cuarenta
y ocho muestras (5 variables 48 muestras = 240 datos) se analizó mediante el análisis de
componentes principales (PCA) con el paquete de software STATISTICA 7.1. Los valores
propios se calcularon utilizando una matriz de covarianza entre 5 variables como entrada,
y la Biplot PCA bidimensional, que permite la visualización de la posición de muestras de
lentejas e isoflavonas entre sí, fue generado.

El método utilizado incluye un procedimiento de extracción que congela el paso y el

análisis de "limpieza" mediante el uso de UHPLC-MS/MS. Estos procedimientos de
limpieza fueron importantes para superar el efecto matriz. La concentración de isoflavonas
totales en lentejas varió de 1.1 a 95.6 µg kg-1. La genisteína, que tiene una importante
actividad antioxidante, fue la isoflavona presente en la concentración más alta en lentejas.
Con respecto a otras leguminosas mediterráneas, los garbanzos mostraron el nivel más
alto de isoflavonas con 913.8 µg kg-1, con la biochanina A como la isoflavona más
abundante. Además, parece que el consumo de legumbres y cereales juntos en la misma
comida proporciona un complemento ideal de isoflavonas.