11/4/2020 Arias Palacios

Revista Cubana de Farmacia, Vol. 50, No. 4

(2016)

ARTÍCULO ORIGINAL

Valoración microbiológica de un aceite

ozonizado ® antibacterial y reparador
mediante prueba de eficacia
antimicrobiana

Microbiological assessment of a antibacterial,

repairing ozonized oil through an antimicrobial
efficacy test

Arias Palacios Janeth,I Murcia Rubiano FernandoII

I Grupo Biotecnología Ambiental e Industrial. Facultad de Ciencias.

Pontificia Universidad Javeriana.
II Director Científico Laboratorios Biotrends. SAS.

RESUMEN

Objetivo: evaluar la eficacia del aceite ozonizado antibacterial.

Métodos: se evaluó el aceite ozonizado frente a cepas de
microorganismos, Aspergillus níger ATCC 16404, Candida albicans
ATCC 10231, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli
ATCC 8739 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. La valoración
se realizó mediante el test de eficacia descrito en la Farmacopea
USP 36; de acuerdo con la cantidad de microorganismo eliminados
o cuya proliferación sea inhibida a lo largo de un plan de muestro
(28 días).
Resultados: se encontró una reducción de 99,10 % (2,05 ciclos
logarítmicos) a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los
28 días de incubación para todos los microorganismos.
Conclusión: el preservante es efectivo frente a la eliminación de
microorganismos.

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Palabras clave: aceite ozonizado; eficacia antimicrobiana; gel

reparador.

ABSTRACT

Objective: To evaluate the efficacy of an antimicrobial ozonized

oil.
Methods: The effect of an ozonized oil against Aspergillus níger
ATCC 16404, Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus
aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739 and Pseudomonas
aeruginosa ATCC 9027 strains was evaluated. For this end, the
efficacy testing described in Pharmacopeia USP 36 was used, on
account of the amount of killed microorganisms or their growth
inhibited throughout a sampling plan (28 days).
Results: A 99.10 % reduction was found at 14 days of incubation
(2.05 log cycles) which was kept up to 28 days for all the
microorganisms.
Conclusion: The ozonized oil is efficacious to eliminate
microorganisms.

Keywords: Ozonized oil, antimicrobial efficacy, repairing gel.

INTRODUCCIÓN
La interacción del ozono con moléculas insaturadas —entre ellas
las de los aceites de origen vegetal— genera la formación de una
mezcla de compuestos químicos tales como ozónidos, trioxolanos y
peróxidos. Estos tienen carácter germicida; propiedad que los hace
útiles para el tratamiento de heridas infectadas, fístulas, y otros
procesos sépticos locales. Por esto, se han convertido en un medio
adecuado para el tratamiento local de cierto número de
enfermedades.1

Un preservativo antimicrobiano es una sustancia que se adiciona a

las formas farmacéuticas no estériles, para protegerlas del
crecimiento de microorganismos que sean introducidos
inadvertidamente durante o posteriormente al proceso de
manufactura. Todos los agentes antimicrobianos presentan
propiedades tóxicas; por lo que para la máxima protección del
paciente, la concentración de preservativo en el producto final
debe ser considerablemente más baja que la concentración que
pueda ser tóxica para el hombre.2

Los agentes antimicrobianos no sustituyen las buenas prácticas de

manufactura. Estos solo se adicionan a los productos para
disminuir el riesgo de una posible contaminación subsiguiente a la
fabricación.

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Un sistema preservante involucra tanto los preservativos como la

constitución físico-química del producto. Factores como pH, Aw,
disponibilidad de nutrientes, concentración de agentes
tensoactivos, agentes secuestrantes, componentes no acuosos,
ingredientes insolubles y materiales interferentes influirán en la
preservación de cualquier fórmula cosmética.3,4

En el diseño de la formulación cosmética, es necesario conocer

muy bien todas las posibles interacciones del sistema preservativo
para asegurar el cumplimiento del objetivo primordial de la
preservación: asegurar que el producto es microbiológicamente
seguro y estable. La reacción del ozono con los aceites vegetales
ozonizados ocurre casi exclusivamente por el doble enlace
carbono-carbono presente en los ácidos grasos insaturados. En la
ozonización de los ácidos grasos insaturados se forma el
compuesto 1,2,3-trioxolano, el cual se descompone rápidamente
para dar un compuesto carbonílico y un aldehído. Estas dos
especies se recombinan para dar ozónidos, hydroxihidroperóxidos,
peróxido de hidrógeno y aldehído. En los estudios realizados por
Díaz Gómez y otros, 5 han sugerido que los compuestos
peroxídicos, en unión con los ozónidos, están involucrados en los
efectos biológicos de los aceites vegetales ozonizados. Diferentes
aceites ozonizados han sido estudiados por el Centro de
Investigaciones del Ozono de Cuba.5 Alguno de ellos, tal como el
aceite de girasol ozonizado, presentan un remarcable efecto
germicida de acuerdo a las investigaciones realizadas en este
Centro.2 La eficacia de estos productos contra los hongos,
bacterias y virus, ha sido ampliamente verificada. También la
actividad antimicrobiana del aceite de teobroma ozonizado ha sido
demostrada contra la Candida albicans y sus aplicaciones para
infecciones por candidiasis ha sido recomendada.5

El ensayo de la eficacia para este producto pretendió conocer la

capacidad del mismo frente a diferentes cepas de
microorganismos, como parte esencial en la garantía de la calidad
del producto cosmético. La meta de este ensayo, determinar el
tipo y la concentración mínima efectiva que se requiere para
preservar satisfactoriamente el producto. El objetivo del trabajo
fue evaluar la eficacia del aceite ozonizado antibacterial.

MÉTODOS

CEPAS DE REFERENCIA ATCC

Las cepas a usar no deben tener más de cinco (5) repiques en

relación con el cultivo original ATCC.

- Escherichia coli (ATCC 8739): En la evaluación se utilizó este

microorganismo como representante de bacilos Gram negativos

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fermentadores, que son indicadores de contaminación fecal y de

fallas de higiene.

- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027): En la evaluación se

utilizó este microorganismo debido a su patogenicidad, a su
presencia en diferentes ambientes y por su capacidad de proliferar
en el agua y adaptarse a varios sustratos, a su alta resistencia a
varios sistemas de preservativos, a su potencialidad de
degradación del producto, y por ser representativo de fallas de
higiene en los procesos de manufactura.

- Staphylococcus aureus (ATCC 6538): En la evaluación se utilizó

este microorganismo como representante de cocos Gram positivos
que son patógenos, están presentes en la piel y pueden presentar
inconvenientes en los productos cosméticos durante el uso.

- Candida albicans (ATCC 10231): En la evaluación se utilizó este

microorganismo debido a su patogenicidad y porque representa
resistencia a los preservativos.

- Aspergillus niger (ATCC 16404): En la evaluación se utilizó este

microorganismo debido a que, a menudo, los hongos filamentosos
son agentes causales de daño a productos preservados.

PREPARACIÓN DEL INÓCULO (Fase 1)

Se alistó una vasija con el sanitizante en uso, un asa bacteriológica

plástica estéril, gradilla con 3 tubos de agar inclinado Triptona de
Soya (TSA) o Plate Count (PC), o caja de petri con agar TSA o PC,
2 tubos de agar inclinado o caja de petri con Saboureaud +
Cloranfenicol, las cepas de referencia ATCC anteriormente
mencionadas. Se encendió la cabina y se dejó circular el aire por
espacio de 10 minutos. Se rotularon cada uno de los tubos o cajas
con el nombre, código de las cepas ATCC, fecha y responsable. Se
realizó repique de las cepas ATCC en los tubos de agar inclinado o
cajas de TSA-PC para bacterias y Saboureaud más cloranfenicol
para el hongo y la levadura. Los medios de cultivo fueron
sometidos a pruebas de esterilidad y promoción de crecimiento de
acuerdo con lo que esta descrito en la USP.2,4

ESTANDARIZACIÓN DE LAS CEPAS (Día 2)

A partir de la cepa de cada microorganismo, se realizó una

suspensión inicial, en solución salina 0,85 %, equivalente al tubo 1
de la escala de Mc Farland (3 × 108 UFC/mL) para las bacterias y
una suspensión de levadura y moho (el inoculo del moho realizarlo
en solución salina al 0,85 % con adición de tween 80 al 0,05 %)
las cuales se llevaron a recuento en placa para conocer la
concentración de dicho inoculo. (La suspensión bacteriana y de
levadura puede ser almacenada hasta por 24 h en refrigeración

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antes de ser utilizada en la prueba, la suspensión del moho puede

ser almacenada en refrigeración hasta 7 días).

Se debe tener en cuenta que el volumen del inoculo empleado

debe ser del 0,5 a 1 % del volumen de la muestra y este volumen
de inóculo debe asegurar que se presente una concentración final
de 1 × 105 a 1 × 106 UFC/mL de producto (esto para productos de
categoría 1,2 3). Para productos de categoría 4, la concentración
final debe estar entre 1 × 103 a 1 × 104 UFC/mL.

Para llegar a obtener la concentración requerida en los productos

de categoría 1, 2, 3; los recuentos de levadura y moho deben
tener una concentración del inoculo sea de aproximadamente 9 ×
107 UFC/mL. Para el caso de las bacterias, al tener una
concentración de 3 × 108 UFC/mL en la suspensión inicial, se
tomaron 3 mL de la suspensión y se llevaron a 7 mL de agua
peptonada para obtener una concentración final de 9 × 107
UFC/mL.

INOCULACIÓN DEL PRODUCTO

En cinco frascos estériles se pesaron o midieron 20 g/mL del

producto. Se rotularon cada uno de los frascos con el número de
referencia interno de la muestra, fecha y con cada uno de los
nombres de los microorganismos o asignándoles un número. (1=
E. coli, 2= S. aureus, 3= P. aeruginosa, 4= C. albicans, 5= A.
niger).

A partir de los inóculos de los microorganismos en concentración 9

× 107 UFC/mL, se tomaron 0,2 mL y se adicionaron en cada uno
de los respectivos frascos de producto. Se homogenizó
uniformemente el inóculo sobre la totalidad del producto. Mediante
esta adición de 0,2 mL del inoculo a una concentración de 9 × 107
UFC/mL, se obtuvo una concentración final de 9 × 105 UFC/mL en
el producto.

Adicionalmente, al montaje de la muestra se trabajó un control

positivo.6,7 Para esto fueron tomados cinco frascos con solución
salina estéril o caldo tripticasa de soya con un volumen de 20 mL,
se inocularon 0,2 mL de las suspensiones de los microorganismos.
Finalizado el proceso de inoculación de la muestra se tomaron
tubos de dilución de 9 mL de caldo Letheen (agente inactivador o
neutralizante-lecitina), se hicieron las respectivas diluciones (10-2,
10-3) para realizar recuento en placa y estimar las
concentraciones de los microorganismos. Estos fueron llevados a
incubación a 35+/-2 ºC durante 24-48 h para bacterias y 22+/-2
ºC durante 5 días, para mohos y levaduras. El mismo
procedimiento fue realizado para el control positivo pero las
diluciones se realizaron en tubos de 9 mL de agua peptonada. (Se
sugiere realizar diluciones (10-3 y 10-4)). Los frascos con muestra
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inoculados y el control positivo se llevaron a incubación a 22 +/- 2

ºC, durante el periodo establecido según la categoría del producto.

Nota: La periodicidad de siembra se debe realizar en base al tipo

de categoría del producto. Para esto, en los frascos incubados
previamente inoculados, se confirmó la concentración mediante
recuento en placa. Se debe tener en cuenta que teóricamente la
concentración debe disminuir en al menos 1 ciclo logarítmico por lo
que las diluciones a servir deben ser inferiores a las realizadas en
el día 0.

RESULTADOS
La muestra que se analizó se expuso a los microorganismos en las
concentraciones recomendadas:

Aspergillus níger (ATCC 16404): Se encontró una reducción de

99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación
que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. De esta
manera, se cumplen los requisitos de USP, que exige que no se
presente incremento del recuento inicial durante el periodo de
evaluación.

Candida albicans (ATCC 10231): Se encontró una reducción de

99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación
que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. De esta
manera, se cumplen los requisitos de USP que exige que no se
presente incremento del recuento inicial durante el periodo de
evaluación.

Staphylococcus aureus (ATCC 6538): Se encontró una

reducción de 99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos) a los 14 días
de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación.
Se cumplió con los requisitos de reducción según USP, en el
que se debe presentar una reducción de bacterias del 99 % a
los 14 días de incubación y mantenerse en este margen luego
de 28 días de estudio.

Escherichia coli (ATCC 8739): Se encontró una reducción de

99,10 % (2,05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación
que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. Se cumplió
con los requisitos de reducción según USP, en el que se debe
presentar una reducción de bacterias del 99 % a los 14 días de
incubación y mantenerse en este margen luego de 28 días de
estudio.

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027): Se encontró una

reducción de 99,10 % (2.05 ciclos logarítmicos) a los 14 días
de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación.

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Cumpliendo con los requisitos de reducción según USP, en el

que se debe presentar una reducción de bacterias del 99 % a
los 14 días de incubación y mantenerse en este margen luego
de 28 días de estudio.

DISCUSIÓN
La prueba de eficacia de preservativos requiere que se inoculen
individualmente especies determinadas de microorganismos. Este
enfrentamiento debería incluir representantes de especies de
bacterias Gram positivas, Gram negativas, mohos y levaduras y en
suficiente cantidad como para permitir que se obtenga información
sobre la cinética de la reacción.2,4

Para fines de la prueba, los productos se definen en 4 categorías:

- Categoría 1. Inyectables, otros parenterales

incluyendo emulsiones, productos ópticos, productos
nasales estériles y productos oftálmicos con bases o
vehículos acuosos.

- Categoría 2. Productos empleados de manera tópica

preparados con bases o vehículos acuosos, productos
nasales no estériles y emulsiones, incluyendo aquellos
que se aplican a membranas mucosas

- Categoría 3. Productos orales a excepción de

antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos.

- Categoría 4. Antiácidos preparados con una base

acuosa.

CRITERIOS PARA EVALUACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

- Categoría 1: Para Bacterias a los 7 días, se debe

presentar una reducción logarítmica de no menos de
1,0 desde el recuento calculado en el inicio; a los 14
días, una reducción logarítmica de no menos de 3.0
del recuento inicial; y ningún incremento del recuento
entre los 14 y 28 días. Ningún para levadura y moho
incremento a los 7, 14 y 28 días respecto al recuento
inicial.

- Categoría 2: Para bacterias a los 14 días, una

reducción logarítmica de no menos de 2,0, desde el
recuento inicial; y ningún incremento del recuento
entre los 14 y 28 días. En levadura y moho ningún
incremento a los 14 y 28 días respecto al recuento
inicial.

- Categoría 3: En Bacterias a los 14 días una reducción

logarítmica de no menos de 1,0 del recuento inicial y
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ningún incremento del recuento entre los días 14 y 28.

Para levadura y moho ningún incremento a los 14 y 28
días respecto al recuento inicial.

- Categoría 4: Para bacterias, levadura y moho ningún

incremento a los 14 y 28 días respecto al recuento
inicial.

Este procedimiento determina si una solución puede eliminar los

microorganismos inoculados en la solución dentro de un período de
tiempo específico. Después de que los organismos han sido
inoculados en la solución por el tiempo recomendado, el producto
deben reducir estos organismos por tres log para las bacterias y
un log completo para los hongos. Un log equivale a una reducción
del 90 %, o 900,000 organismos muertos; una disminución de dos
log denota una reducción del 99 %, o 990,000 organismos
muertos; tres log una reducción del 99,9 %, o 999,000
organismos muertos; cuatro log equivalen a una reducción del
99,99 %, o a 999,900 organismos muertos; y cinco log una
disminución del 99,999 %, o 999,990 organismos muertos. El
único requisito es una reducción específica en los números
microbianos, expresados como reducción de log, dentro del tiempo
especificado por el fabricante al entrar en contacto el
microorganismo con la solución.

Después de observar el comportamiento microbiológico de la

muestra con el preservante, se encontró una disminución de 2,05
ciclos logarítmicos en todos los casos; frente a los diferentes
microrganismos probados y hasta los 28 días de incubación. Se
cumplen los requisitos de United States Pharmacopeia (USP) que
exige que no se presente incremento del recuento inicial durante el
periodo de evaluación.

Esto contribuye así con la protección, estabilidad microbiológica y

seguridad del producto, favorece al futuro la vida útil del producto
y garantiza su buen desempeño durante su vida de estantería. Se
concluye que el sistema preservante es efectivo frente a la
eliminación de microorganismos.

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7. Martínez Sánchez G. Los retos de la ozonoterapia y el acceso a

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Recibido:1 de enero de 2015.

Aprobado:31 de mayo de 2016.

Arias Palacios Janeth. Grupo Biotecnología Ambiental e Industrial.

Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana.
Correo electrónico: jdcarias@javeriana.edu.co

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