UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL INGENIERÍA
AGROINDUSTRIAL

TITULO :

“CONCENTRACIÓN DE AGPI n-3 POR HIDRÓLISIS

ENZIMÁTICA A PARTIR DE ACEITE RESIDUAL DE
ANCHOVETA (Engraulis ringens)”

AUTOR :

ENCINAS ESTRADA GREISSY STEFHANY

ASESOR :

ING. CASTILLO CALDERON AUGUSTO

NUEVO CHIMBOTE-PERU

2018
 ÍNDICE

I. GENERALIDADES........................................................................................4
1.1 Título.......................................................................................................4
1.2 Equipo Investigador..............................................................................4
1.2.1 Estudiante........................................................................................4
1.2.2 Asesor..............................................................................................4
1.3 Tipo De Investigación...........................................................................4
1.4 Lugar De Ejecución...............................................................................4
1.5 Duración Del Proyecto..........................................................................4
1.6 Cronograma de Trabajo........................................................................5
1.7 Recursos................................................................................................6
1.7.1 Personal...........................................................................................6
1.7.2 Equipos............................................................................................6
1.7.3 Materia prima...................................................................................6
1.8 Presupuesto...........................................................................................7
1.9 Financiamiento......................................................................................7
II. PLAN DE INVESTIGACIÓN..........................................................................8
2.1 Problemática..........................................................................................8
2.2 Importancia y justificación de la Investigación.................................9
2.3 Objetivos de la Investigación.............................................................11
2.4 Marco Referencial...............................................................................12
2.4.1. Aceites Marinos............................................................................12
2.4.2. Aceite Residual de Pescado (ARP).............................................13
2.4.3. Enzimas Lipolíticas......................................................................13
2.4.4. Hongos y levaduras como fuentes de lipasas..........................14
2.4.5. Antecedentes de la investigación...............................................15
2.5 Formulación de Hipótesis..................................................................17
2.5.1. Definición de variables.................................................................17
2.6 Materiales y Métodos..........................................................................18
2.6.1 Muestra..........................................................................................18
2.6.2 Métodos.........................................................................................18
 2.6.2.1 Determinación de Acidez en aceite de pescado (Método NTP
209. 005 1968).............................................................................................18
2.6.2.2 Determinación de sólidos, estearina y humedad (A.O.A.C, 1990)
18
2.6.2.3 Determinación del contenido de jabón (NMX-F-492-1987,
CONVENIN 710:1997).................................................................................19
2.6.2.4 Determinación de índice de yodo (Método Oficial A.O.A.C. 920.
158.) 19
2.6.2.5 Determinación de índice de anisidina (ISO 6885:2006).............20
2.6.2.6 Determinación de ácidos grasos (AOAC – Official Method
969.33- Fatty Acids in oil and Fats).............................................................20
2.6.3 Equipos e Instrumentos...............................................................21
2.6.4 Metodología...................................................................................22
2.6.5 Descripción de los procesos.......................................................24
2.6.6 Diseño Experimental....................................................................25
Referencias Bibliográficas..............................................................................28
ANEXOS.............................................................................................................29
 PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

I. GENERALIDADES
1.1 Título
“Concentración de Ácidos Grasos Poliinsaturados por Hidrólisis
Enzimática A Partir De Aceite Residual De Anchoveta (Engraulis
ringens)”

1.2 Equipo Investigador

1.2.1 Estudiante
Greissy Stefhany Encinas Estrada

1.2.2 Asesor
Ing. Augusto Castillo Calderón

1.3 Tipo De Investigación

Investigación Experimental

1.3.1 Área
Ingeniería y Tecnología

1.3.2 Línea
Investigación y Desarrollo de productos Agroindustriales

1.4 Lugar De Ejecución

Nuevo Chimbote, Laboratorio De Química Orgánica de la Universidad
Nacional del Santa.

1.5 Duración Del Proyecto

11 meses

4
 1.6 Cronograma de Trabajo

SEMINARIO DE TESIS I SEMINARIO DE TESIS II EJECUCIÓN DE PROYECTO

MESES
ACTIVIDADES MAYO JUNIO JULIO AGOSTO SETIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE DICIEMBRE ENERO FEBRERO MARZO
1. ELECCIÓN DEL TEMA X X X X                                                                                
2. REVISION BIBLIOGRAFICA X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X      
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA     X X                                                                                
4. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS     X X                                                                                
5. DISEÑO ESTADÍSTICO         X X X X X X X X                                                                
6. METODOLOGÍA                       X X X X X X                                                      
7. APROBACIÓN DEL PROYECTO                                   X X X X X X                                          
8. EJECUCIÓN DEL PROYECTO                                     X X X X X X X X X X X                              
9. ANÁLISIS DE RESULTADOS Y
                                                    X X X X X X X X                    
CONCLUSIONES
10. REDACCIÓN FINAL DEL INFORME                                                           X X X X X X X X X X X X      
11. SUSTENTACIÓN DEL TRABAJO                                                                                   X X  
12. PUBLICACIÓN                                                                                       X

5
1.7 Recursos
1.7.1 Personal
 Asesor : Ing. Augusto Castillo Calderón
 Estudiante : Encinas Estrada Greissy Stefhany

1.7.2 Equipos
 Cromatógrafo de Gases
 Mini reactor

1.7.3 Materia prima

 Aceite residual de Anchoveta
 Lipasa AY “AMANO” 30SD

6
 1.8 Presupuesto

DESCRIPCIÓN DE ASIGNACIONES SUBTOTA TOTAL

CÓDIGO
ESPECÍFICAS L (S/.) (S/.)
2.3.1 BIENES
2.3.15 Materiales de escritorio 50.00
2.3.11.12 Materias primas e insumos 800.00
1150.00
2.3.199.1 Materiales de impresión 250.00
2.3.199.1 Material fotográfico 50.00

2.3.18 MATERIALES DE LABORATORIO

2.3.18 Viales cromatográficos 280.00
2.3.18 Pipetas Pasteur 80.00 500.00
2.3.15.3 Materiales de limpieza 40.00
2.3.18.199 Otros 100.00
2.1.21.2 SERVICIOS
2.1.21.21 Movilidad 100.00
2.3.22.44 Impresiones 200.00 600.00
2.3.22.44 Encuadernación 100.00
2.1.31.16 Otros 200.00
TOTAL 2250.00

1.9 Financiamiento
El desarrollo del presente proyecto de investigación será
autofinanciado por la tesista y con apoyo de la empresa AMANO
ENZYME.

7
II. PLAN DE INVESTIGACIÓN
II.1 Problemática
Actualmente la industria que rige en aceite residual de anchoveta se
aprovecha los ácidos grasos poliinsaturados del aceite residual de
anchoveta utilizando reactivos altamente corrosivos. Este método
tradicional se usa por ser más barato, en CHIMBOTE encontramos
empresas aceiteras que emplean este método tradicional como
CAMAR PERU, DOIL INTERNATIONAL, ROVSAC y SHEKINA.
Estas empresas utilizan el proceso de neutralización alcalina, pero
tiene importantes inconvenientes, el rendimiento es del 70%
aproximadamente ya que se producen pérdidas de aceite debido a la
emulsión y saponificación de los aceites neutros (jabones sódicos).
También se genera una cantidad considerable de efluente líquido.
Los jabones sódicos obtenidos en el neutralizado se disocian
generalmente con ácido sulfúrico, obteniéndose así los ácidos
grasos libres junto con sulfato sódico y vapor de agua ácida que
contiene grasa. (FAO, 2009)

El planteamiento de hidrólisis enzimática en este proyecto de

investigación del aceite de anchoveta residual constituye un método
verde de obtener ácidos PUFA’s concentrados, en desarrollo para
darle un mayor valor agregado al aceite residual de anchoveta. Por
lo tanto, para poder ejecutarlo industrialmente es necesario tener los
parámetros que determinen la mejor concentración a pequeña
escala y poder así emplearlos a escala industrial.

2.1.1 Formulación del Problema

¿Cuáles son los parámetros de operación de un mini reactor
enzimático por lote para obtener la mejor concentración de AGPI
a partir de aceite residual de la industria de la anchoveta
(Engraulis ringens)?

8
II.2 Importancia y justificación de la Investigación
Tradicionalmente, el aceite de pescado se obtenía como
subproducto de la industria de harina de pescado. Pero actualmente
los peces más pequeños con un contenido de grasa relativamente
alto como las anchoas, sardinas, el arenque, las anguilas y la
anchoveta están siendo el centro de atención como materia prima en
la industria del aceite de pescado para el consumo. Sin embargo, la
producción de harina y aceite de pescado es una alternativa para el
aprovechamiento del pescado, pero no se está utilizando
directamente para el consumo humano, así que los residuos
procedentes de las plantas de procesamiento de pescado se están
procesando como aceites para el consumo animal.

El aceite de pescado es la principal fuente natural de ácido graso de

cadena larga (LC) Omega-3 que contiene dos AGPI importantes
para la salud humana estos son el ácido eicosapentaenoico (EPA) y
ácido docosahexaenoico (DHA).[ CITATION Har81 \l 10250 ]

Está científicamente probado que EPA y DHA tienen un impacto

positivo en la salud humana, reducen la posibilidad de enfermedades
cardíacas y vasculares, cáncer, diabetes, disminuir el riesgo de
depresión, así como fortalecer el sistema inmune, y asegurar el
correcto funcionamiento neuronal en desarrollo. Existen más de
31,000 artículos científicos revisados que se han publicado sobre los
ácidos grasos Omega-3 [CITATION Har99 \l 10250 ] . El aceite de
pescado actualmente representa aproximadamente el 2% del
consumo mundial de grasas y aceites.

Debido a la tendencia por consumir EPA Y DHA por sus efecto

benéficos está naciendo una gran demanda por concentrados en
cápsulas de ácidos grasos omega-3 en el mercado como
suplemento alimenticio, en la actualidad la producción de estos se
encuentra seriamente limitada por falta de métodos y técnicas
factibles sin embargo, La empresa TASA S.A.C ya obtiene estos
concentrados usando aceite crudo de anchoveta derivado de sus

9
plantas de harina pero esta empresa por su alto prestigio eleva los
costos y el acceso de estos concentrados pero esto puede cambiar
si se aumenta la fuente de materia prima para la obtención de estos
concentrados, utilizando el aceite residual que obtienen diversas
plantas en Chimbote y aprovechando así el contenido de ácidos
grasos que tiene. Existen diversos métodos desde tiempos remotos
para la concentración de estos ácidos grasos como “Solexol”
descrito por (Dickinson et. al, 1952), Fraccionamiento de fluidos en
condiciones supercríticas utilizando CO2 como solvente (Krukonis,
1984), cristalización de ésteres metílicos de los AGPI con solución
de úrea (Haagsma et. al., 1982), método Freeman utilizando furfural
como solvente y el método “emersol” (Bernardini y Franco, 1981).
Todos estos métodos mencionados anteriormente no se pudieron
aplicar de manera industrial debido a su alto costo de los equipos y
de los solventes, el gran volumen que se emplearía de estos y de los
residuos indeseables que dejaban en el producto final.

Actualmente el uso y comercialización de enzimas va en aumento

debido a su eficiencia, especificidad y las condiciones amigables y
controlables en su interacción con los sustratos. En esta
investigación se fomenta:

- Impulsar el uso de enzimas microbianas a escala industrial para la

obtención de ácidos AGPI que constituye un método de extracción
verde de condiciones amigables para el medio ambiente y una
buena alternativa de reemplazo a los métodos tradicionales.
- Darle un mayor valor alimenticio al aceite residual de anchoveta,
para que no solo sea destinado para consumo animal sino
también utilizado para consumo humano.

10
II.3 Objetivos de la Investigación
Los ácidos grasos Omega-3 EPA y DHA, tienen un alto valor
económico en el mercado internacional debido a su importancia en
la alimentación tanto humana como animal. La principal fuente son
los recursos marinos específicamente especies pelágicas como la
anchoveta (Engraulis Ringens) donde la concentración de estos
ácidos grasos poliinsaturados es mayor.
En Chimbote hoy en día el aceite de anchoveta ha dejado de ser un
sub producto sin valor nutricional en las harineras y se ha convertido
en el principal producto de exportación de empresas como HAYDUK,
TASA, COPEINCA, CFG INVESTMENT, EXALMAR Y DIAMANTE,
sin embargo, hay empresas a nivel local que procesan harina de
menor calidad como son el caso de QUIAZA, PANAFOODS,
MIGUEL ANGEL, YA VENGO DEL MAR Y BELTRAN, el sub
producto de estas empresas que procesan harina de menor calidad
es el aceite residual, lo cual no es considerado como un alimento de
CHD. Por lo tanto, el objeto de investigación es darle un mayor valor
alimenticio al aceite residual de anchoveta en base a la
concentración de sus ácidos grasos poliinsaturados a escala de
laboratorio mediante una hidrólisis enzimática.

a. Objetivo General
o Determinar los parámetros de operación de un mini reactor
enzimático por lote para obtener la mejor cantidad de ácidos
Grasos poliinsaturados mediante hidrólisis enzimática.

b. Objetivo Específico
o Determinar el rango de linealidad y actividad enzimática
(actividades volumétrica y específica) de la enzima comercial
AMANO 30 SD
o Determinar los parámetros cinéticos de la enzima comercial
AMANO 30 SD.

11
 o Determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad
enzimática de la enzima comercial.
o Determinar la estabilidad térmica de la enzima comercial.
o Caracterizar fisicoquímicamente el aceite residual de
anchoveta.
o Determinar la concentración de lipasa AY AMANO 30SD
(U/g) óptima para la hidrólisis enzimática.
o Determinar el tiempo de reacción óptima para la hidrólisis
enzimática.
o Determinar y cuantificar la concentración final % de ácidos
AGPI mediante cromatografía de gases.

II.4 Marco Referencial

2.4.1. Aceites Marinos
Se entiende por aceite a todas aquellas sustancias que son
estructuralmente grasas y que se obtienen a través del prensado
de determinada materia prima, en este caso los aceites pueden
ser de origen animal o vegetal.
Los aceites de pescado son aceites obtenidos a partir de los
tejidos de algunas especies de peces. Los pescados que son
especialmente ricos en los aceites que son beneficiosos para el
organismo y son conocidos con el nombre de ácidos grasos
omega-3 incluyen a la macarela o caballa, el atún, el salmón, el
esturión, el mújol, la anchoa, las anchovetas, las sardinas, el
arenque, la trucha y el menhaden. Proporcionan alrededor de 1
gramo de ácidos grasos omega-3 en alrededor de 3,5 onzas (100
gramos) de pescado.
Los aceites o grasas, químicamente hablando, son combinaciones
de 3 moléculas de ácidos grasos con una molécula de alcohol
(glicerina). (Colpex, 2014).
Originalmente estos aceites eran solo un sub-producto de la
fabricación de harina de pescado. Sin embargo, la investigación

12
en los últimos años ha demostrado sus importantes beneficios en
la salud tanto humana como animal. Los ácidos grasos que
componen los aceites en general son ácidos grasos saturados
(AGS) e insaturados (AGÍ). Los insaturados a su vez pueden ser
monoinsaturados (AGMI) o poliinsaturados (AGPI). Desde el
punto de vista de su uso nutricional, los AGPI se clasifican a su
vez en las llamadas familias o series de ácidos grasos. Las tres
familias más importantes son la omega-9, omega-6 y omega-3.
(Valenzuela A, Sanhueza J, 2009).

2.4.2. Aceite Residual de Pescado (ARP)

Como su nombre lo indica, no constituye un producto del
procesamiento de pescado, sino un residuo de la etapa de
recuperación de materiales y limpieza del agua de cola, por lo que
constituye una mezcla de aceite con un alto nivel de acidez y
agua (EXALMAR, 2016).
La materia prima residual generalmente se define porque está
constituido por pieles, carne oscura o carne en proceso de
descomposición que ya no es apta para el consumo en conservas
o en algún otro tipo de consumo en fresco. [CITATION Rod93 \l 10250 ]

2.4.3. Enzimas Lipolíticas

Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica que catalizan
reacciones químicas siempre que sea termodinámicamente
posible, por lo cual se les denomina biocatalizadores. Casi todos
los procesos químicos celulares utilizan enzimas o
biocatalizadores. Como todos los catalizadores, las enzimas
funcionan disminuyendo la energía de activación para una
reacción, acelerándose substancialmente la velocidad de la
reacción. Las enzimas difieren de otros catalizadores por ser más
específicas, siendo su actividad afectada por agentes ambientales
como: temperatura, pH, presión y/o agentes operacionales como
la aireación.

13
En los últimos años, la utilización de biocatalizadores ha
aumentado considerablemente al presentar importantes ventajas
respecto a los procesos químicos convencionales. Son selectivas
y específicas, presentan condiciones de trabajo de fácil manejo
(temperatura y presión, ambiental o cercana a ellas en la mayoría
de los casos, pH de fácil regulación), evitan la formación de
productos secundarios típicos de procesos químicos,
consiguiendo la reducción de pasos de purificación del producto
deseado y la recuperación del biocatalizador, y generan menos
residuos, por ejemplo, no suelen necesitar cantidades importantes
de solventes orgánicos. Por todos estos motivos, actualmente, las
enzimas son usadas comercialmente en un sinfín de aplicaciones.
[ CITATION Ala08 \l 10250 ]

2.4.4. Hongos y levaduras como fuentes de lipasas

Los hongos filamentosos y las levaduras son excelentes
productores de enzimas lipolíticas. La mayoría de las enzimas
fúngicas son extracelulares y se extraen más fácilmente
reduciendo significativamente los costos de recuperación. Por lo
tanto, la producción y la extracción a bajo costo hace de las
lipasas fúngicas un objeto de interés industrial (Nagarajan, 2012).
Los principales géneros productores de lipasas son Rhizopus,
Aspergillus, Penicillium, Geotrichum, Humicola, Ashbya,
Fusarium, Rhizomucor, Acremonium, Alternaria, Beauveria y
Metarhizium (Jaeger, et al. 2002). Debido a su facilidad de cultivo
y extracción, termoestabilidad, estabilidad de pH, especificidad de
sustrato y actividad catalítica en presencia de solventes
orgánicos, las lipasas fúngicas de Aspergillus niger, Candida
cylindracea, Candida antarctica, Rhizopus arrhizus, Rhizopus
delemar, Rhizopus japonicus y Rhizopus oryzae actualmente se
explotan comercialmente (Houde et al. 2004).

14
2.4.5. Antecedentes de la investigación

Presenta una revisión de los avances más recientes, con

respecto a la producción de concentrados de omega-3 de la
primera materia prima que los contiene y de la cual deben
extraerse al omega-3. En el medio, un buen número de
diferentes tecnologías que están siendo industrialmente
aplicados, o aún bajo investigación, son revisados en este
artículo, lo cual destaca la hidrólisis enzimática. [ CITATION Nur10 \l
10250 ].

Se intentó concentrar el contenido de ácidos grasos

poliinsaturados (n-3 AGPI) en aceite de salmón, hidrolizando con
tres tipos de lipasas nativas (Aspergillus niger, Rhizopus
javanicus y Penicillium solitum), con respecto a las variables de
reacción; temperatura (X1), cantidad de lipasas (X2) y relación
agua / aceite (X3). En esta investigación, la lipasa óptima fue
Aspergillus niger, ya que fue la más efectiva en obtener una
máxima concentracion n-3 PUFA. El grado de hidrólisis (60%) se
eleva a un aumento en el ácido docosahexaenoico (DHA) de un
contenido inicial del 14.4% en el aceite original al 34.0% en
condiciones óptimas: concentración de enzima de 500 U g-1
aceite, temperatura de reacción de 45 ° C y relación de agua /
aceite de 2: 1 (w/w) y tiempo de hidrólisis de 24 horas. [ CITATION
Car09 \l 10250 ]

En esta investigación se utiliza dos tipos de aceite de Menhaden

y grasa de foca, en donde se pretende concentrar ácidos grasos
omega 3 mediante hidrólisis enzimática. Las variables
independientes fueron concentración de enzima, tiempo de
reacción y temperatura de reacción. En el análisis de resultados
las temperaturas óptimas para obtener la mayor concentración
son de 37 y 38 °C con una concentración final de 54.5% y 54.3

15
% de omega 3 con un tiempo de hidrólisis de 40 y 45 horas.
[ CITATION Uda98 \l 10250 ]
Se enriqueció aceite de salmón con ácidos grasos
poliinsaturados omega 3 por hidrólisis catalizada por la lipasa
Candida Rugosa. Se logró obtener una concentración final de
50.58% de PUFA´s, lo cual nos muestra que la hidrólisis
efectuada por levaduras es efectiva para concentrar ácidos
grasos de omega 3 en aceite de pescado. [ CITATION Der11 \l
10250 ].

El aceite de atún es una de las fuentes naturales más ricas en

ácido docosahexaenoico (DHA) con propiedades potencialmente
saludables. El DHA también se conoce como alimento cerebral y
también es útil en la prevención y el control de diversas
enfermedades humanas y trastornos. El presente trabajo
investigó el estudio cinético del aceite de atún catalizado por la
lipasa Candida rugosa (CRL). El cual fue en un tiempo de
hidrólisis de 24 horas lo cual logró 80.1 % de hidrólisis en base a
los ácidos grasos libres formados. Las condiciones fueron ph
6.5, temperatura de 35 °C, velocidad de agitación 800 rpm, 40
mg de enzima y 1:10 (w / v) relación de aceite a agua. [ CITATION
Bha17 \l 10250 ].

16
II.5 Formulación de Hipótesis
Los mejores valores de los parámetros de operación del mini reactor
por lote son: concentración de la lipasa AY “AMANO” 30SD de 300
(U/g) y un tiempo de hidrólisis en 24 (horas) para obtener una
concentración de 35% de AGPI en base EPA Y DHA

2.5.1. Definición de variables

Concentración de enzima (U/g)

VARIABLE INDEPENDIENTE
Tiempo de Hidrólisis (horas)

Concentración final de AGPI

VARIABLE DEPENDIENTE
(%)

17
II.6 Materiales y Métodos
II.6.1 Muestra
 Materia prima: Aceite residual de Anchoveta, será
adquirida de la planta PANAFOODS, ubicada en Santa-
Áncash.
 Enzima: La lipasa comercial AY “Amano” 30 SD será
adquirida de la empresa AMANO ENZYME.

Especificaciones:
Actividad lipídica : 30 000 u/g
pH : 3.0 – 8.0
Temperatura (°C) : 40 - 50
II.6.2 Métodos
II.6.2.1 Determinación de Acidez en aceite de pescado (Método
NTP 209. 005 1968)
Reactivos

 Solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 0.25 N

 Fenolftaleína al 1%.
 Alcohol etílico al 95% neutralizado.

Materiales

 Bureta de 10 ml
 Pipeta de 10 ml.
 Matraz Erlenmeyer de 100 ml.

II.6.2.2 Determinación de sólidos, estearina y humedad (A.O.A.C,

1990)
Materiales

 Vaso de precipitación de 300ml.

 Estufa.

18
II.6.2.3 Determinación del contenido de jabón (NMX-F-492-1987,
CONVENIN 710:1997)
Reactivos

 Acetona Neutralizada, grado para análisis, con 2% de

agua incorporada.
 Ácido clorhídrico, grado para análisis, 0.01 N,
exactamente normalizado.
 Solución de azul de bromofenol al 1 % en etanol de 95
% (v/v)
 Solución de trabajo: Azul de bromofenol al 1% en
solución acuosa de acetona (v/v).

II.6.2.4 Determinación de índice de yodo (Método Oficial A.O.A.C.

920. 158.)
Reactivos

 Solución Hanus.
 Solución de KI al 15%.
 Cloroformo (CH3Cl3).
 Solución de almidón al 1%.
 Solución de Tiosulfato de sodio 0.1 N.

Materiales

 Bureta de 25 ml.
 Pipeta volumétrica de 10 ml y 25 ml.
 Matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapa.
 Probeta de 100 ml

19
II.6.2.5 Determinación de índice de anisidina (ISO 6885:2006)
Reactivos

 Isooctano (C8H18), grado espectroscópico.

 Ácido acético glacial (CH3COOH), grado reactivo.
 p-anisidina (CH3O.C6H4.NH2), grado reactivo.

Materiales

 Espectrofotómetro y celdas de cuarzo

 Celdas de cuarzo de 1 cm de espesor.
 Balanza con 0.0001 g de precisión.
 Fiolas de 25 mL.
 Pipetas de 1 ml y 5 ml.
 Tubos de ensayo.

II.6.2.6 Determinación de ácidos grasos (AOAC – Official Method

969.33- Fatty Acids in oil and Fats)
Reactivos

 Solución trifloruro de boro al 20% en metanol

 Hidróxido de sodio NaOH 0.5 N en metanol.
 Metanol CH3OH, grado reactivo.
 Cloruro de sodio, grado reactivo.
 Isooctano C8H18, grado reactivo.

Materiales

 Baño María de Temperatura constante.

 Balanza analítica, sensiblidad ± 0.0001 g.
 Fuente de nitrógeno seco, con válvula reguladora.
 Campana extractora.
 Tubos de vidrio con tapa rosca.
 Viales de 2 ml, y septas.
 Pipetas Pasteur.

20
21
II.6.3 Equipos e Instrumentos
 Agitador de Tubos: Barnstead Thermolyne M37615
 Agitador Magnético: Thermolyne Nuova II Stirrer S18520-
26
 Balanza Analítica: Prease Gravimetrics AG 221LX
 Balanza Digital: Precisa XB-320M
 Baño María: Electronic Thermo Stat BTR-65
 Biorreactor: Biostat Aplus Sartorius
 Centrífuga: P-selecta 209
 Centrífuga Refrigerada: Sigma Sartorius 2-16PK
 Espectrofotómetro UV/VISIBLE: Unico SR-2800
 Estufa Eléctrica: P-selecta 209
 pH metro: Orion Star A211 Thermo Scientific
 Refrigerador
 Cromatógrafo de Gases: Shimadzu

22
 II.6.4 Metodología

Aceite Recepción de
Residual de la Materia
Anchoveta Prima

Determinación Baño María

Acidez Humedad
(80 °C, 10 min)
Solidos, Estearina
Humedad
Anisidina
Jabón Centrifugado
Sólidos
Yodo (3500 rpm x
sedimentados
Peróxidos 15')
Ácidos Grasos

Hidrólisis
Determinación
Enzima AY Enzimática
del Grado de
MANO 30 SD (500 U/g, 24
Hidrólisis
horas y 40 °C)

Aceite Determinación de
concentrado con Ácidos Grasos por
PUFA¶s Cromatografía

Figura 1: Diagrama de Flujo del Proceso Experimental Principal en el Proyecto

de Trabajo de Investigación

23
 Tabla 1. Parámetros de la metodología

 Determinación Acidez
(%FFA)
 Determinación de
sólidos y Estearina
 Determinación de
 Concentración enzima
Humedad  Temperatura (80 °C)  3500 rpm
500 U/g
 Determinación Anisidina  Tiempo (10 minutos)  Tiempo 15 minutos
 Tiempo (24 horas)
 Determinación Jabón
 Temperatura (40 °C)
 Determinación Yodo
 Determinación Peróxidos
 Determinación Perfil
Lipídico (AGPI)

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II.6.5 Descripción de los procesos

 Recepción de Materia Prima

El aceite residual de anchoveta (Engraulis ringens) será adquirida
de la Empresa PANAFOODS, será colocado en una botella de
polietileno nueva, aislada de la luz y del calor. Será transportada
hacia el laboratorio de Química Orgánica de la Universidad
Nacional del santa, para su almacenamiento.

Almacenamiento:

El aceite residual de anchoveta será almacenado en refrigeración

y forrado con papel aluminio para evitar la exposición a la luz,
hasta su uso (máx. 3 meses) para los respectivos análisis.

 Baño María

El baño maría se realizará con el fin de poder facilitar la

separación de la estearina contenida en el aceite.

 Centrifugado
Luego de haber realizado el baño maría, el aceite se llevará a
centrifugación para separar los sólidos suspendidos y estearina
del aceite.
 Hidrólisis Enzimática
Luego de haber acondicionado el aceite para la hidrólisis se
ajustará el pH a trabajar 7.0, a la temperatura de constante de 40
°C durante el proceso y se le adicionará la solución buffer junto a
la lipasa para el inicio de la hidrólisis.

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ANEXOS

28
a) Biorreactor BIOSTAT- M

b) Aceite Residual de Anchoveta (Engraulis Ringens)

29
c) Lipasa AY “AMANO” 30 SD

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