UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE COAHUILA

Facultad de Ciencias Químicas

Manual de prácticas de Bioquímica

Dr. José Gerardo Gaona lozano

Departamento de Biotecnología de Enzimas
Facultad de Ciencias Químicas. UAdeC.
E-mail: jggaona@uadec.edu.mx

Saltillo, Coahuila Agosto 2016

 INSTRUCCIONES GENERALES PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO

Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales
que deben ser observadas con toda escrupulosidad.

1.- Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su
objetivo, fundamento y técnica. Los resultados deben ser anotados cuidadosamente apenas se
conozcan.

2.- El orden y la limpieza deben prescindir todas las experiencias del laboratorio. En consecuencia,
al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado.

3.- Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.

4.- Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en su etiqueta para asegurarse de que es el que
se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.

5.- No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin
consultar con el profesor.

6.- No tocar con las manos y menos con la boca los productos químicos.

7.- Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben
manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar su mecanismo.

8.- Los productos inflamables (Gases, alcohol, éter, etc. ) deben manejarse alejados de las llamas
de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará en baño María,
nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de
cerrar las llaves de paso al apagar la llama.

9.- Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con cuidado para
evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán bruscamente en los tubos de
ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared.

10.- Cuando se requiera diluir un ácido, nunca se debe echar agua sobre ellos, siempre al
contrario; ácido sobre el agua.

11.- Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma que la
etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre el líquido se deteriore dicha
etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco.

12.-No pipetear con la boca. Se debe utilizar una bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se
disponga en el laboratorio.

13.- Las pipetas se cogerán de forma que sea el dedo índice el quetape el extremo superior paa
regular la caída del líquido.
14.-Al enrasar un líquido con una determinada división de escala graduada debe evitarse el error
de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos, para que la visual al enrase
sea horizontal.

15.- Cuando se calientan a la llama los tubos de ensayo que contienen líquidos debe evitarse la
ebullición violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se acercará
a la llama inclinado, procurando que ésta actúe sobre la mitad superior del contenido y cuando se
observe que se inicia la ebullición rápida, se retirará acercándolo nuevamente a los pocos
segundos y retirándolo otravez al producirse una nueva ebullición, realizando así un calentamiento
intermitente. En cualquier caso, se evitará dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra
persona.

16.- Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo después de haberlos
calentado con el fin de evitar roturas.

17.- Los cubreobjetos y portaobjetos deben manejarse por los bordes para evitar que se engrasen.

ACCIONES QUE SE DEBEN DE TOMAR EN CASO DE ACCIDENTES

1.- En caso de que exista contacto de ácidos o bases con la piel, ojos o boca se recomienda
enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir su acción por dilución, para
ello en el laboratorio existen tarjas y regaderas especiales.

2.- En caso de ingestión de corrosivos NUNCA provocar vómito. Si existe ingestión de ácidos hacer
beber inmediatamente una solución de bicarbonato de sodio (2 cucharadas soperas en 2 vasos de
agua); en caso de ingestión de soluciones cáusticas (hidróxido de sodio o potasio)ingerir una
cucharada de vinagre o 25 ml de jugo de limón en agua.

3.-Al ingerir otras sustancias químicas hacer vomitar a la persona accidentada. Vigilar que exista
una ventilación adecuada y mantener las vías aéreas permeables.

4.-Si existe derramamiento de ácido, neutralizar agregando bicarbonato de sodio y en caso de

bases, agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar agua. Emplear bata, guantes y
gafas durante la limpieza.
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 1
Soluciones, pH y Amortiguadores

Introducción.

El catabolismo de hidratos de carbono, lípidos y aminoácidos da lugar a la producción de una gran

cantidad de ácidos relativamente fuertes en relación al pH fisiológico. Por ejemplo, la combustión
completa de hidratos de carbono y lípidos genera bióxido de carbono y agua, los cuales se
combinan para producir ácido carbónico a nivel tisular. El pH fisiológico debe conservarse por
arriba de 6.8 ya que las enzimas y en general las proteínas, tales como la insulina y la
hemoglobina, son sensibles a los cambios bruscos de pH. El intervalo de pH fisiológico aceptado
como normal es de 7.35 a 7.45 con un promedio de 7.40. Para lograr mantener prácticamente sin
cambios el pH fisiológico se necesitan no solo de sustancias capaces de amortiguar los cambios
bruscos de pH que ocurrirían en ausencia de éstas, sino que además se requiere de un mecanismo
de regulación en donde interviene el sistema nervioso, el aparato respiratorio y el aparato
genitourinario.

El objetivo del presente experimento consiste en poner en manifiesto, la existencia de

amortiguadores en ciertos líquidos biológicos y compararlos con el agua, la cual no contiene
sustancias amortiguadoras de pH. Los amortiguadores de pH se encuentran formados por un ácido
débil y su sal. Los principales amortiguadores de pH en la sangre los constituyen el par
bicarbonato / ácido carbónico, el fosfato monobásico / fosfato dibásico y la hemoglobina /
hemoglobina protonada. La manera en que los amortiguadores evitan los cambios bruscos de pH
ante la presencia de los ácidos producidos durante el catabolismo, consiste en que la base del
ácido débil, por ejemplo el bicarbonato, acepta los protones liberados por un ácido relativamente
fuerte. Una solución amortiguadora que mantenga el pH fisiológico en 7.4se logra, de acuerdo con
la ecuación de Henderson – Hasselbalch, cuando la reacción bicarbonato / ácido carbónico es
20:1, que es precisamente la reacción que se encuentra en la sangre.

Materiales y reactivos.

Líquidos biológicos: Saliva, orina.

Soluciones y suspensiones.
Agua destilada, Melox ( 1: 5) y peptobismol ( 1:5)

Reactivos
NaOH 0.01 N
HCL 0.01 N

Tiras reactivas para pH (o papel tornasol)

Tubos de ensaye 13 x 100 (con tapón)
Matraces Erlenmeyer de 50 ml.
Pipetas de 1, 5 y 10 ml.
Gradilla.
PROCEDIMIENTO.

I.- Medición del pH en diferentes soluciones (medición semicuantitativa). Una forma rápida de
medir el pH consiste en utilizar tiras reactivas diseñadas para este fin. Estas reaccionan por
contener diferentes compuestos que cambian de color de acuerdo al pH. Estas mediciones se
consideran semicuantitativas debido a que no indican el valor exacto de pH. Líquidos problema;
Saliva, orina, agua destilada, Melox (1:5) y Peptobismol (1:5)

1.- Sumergir la tira reactiva en el líquido problema y mantenerla por 10 segundos.

2.- Retirar la tira y retirar el exceso de líquido.
3.- comparar los cambios de color obtenidos con la gama de colores existentes en el frasco.
4.- Registrar los valores de pH obtenidos en las diferentes soluciones.
5.- Investigue que compuestos explican el pH de cada una de las soluciones estudiadas(*).
6.-Reporte sus resultados en una tabla con el siguiente orden: Solución – pH – Compuesto.

II. Capacidad amortiguadora de líquidos biológicos y antiácidos.

1.- Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Tubo Muestra (2.5ml) Ph NaOH HCl pH

inicial 0.01 N 0.01 N final
1 orina 0.5ml -
2 orina - 0.5 ml
3 saliva 0.5 ml -
4 Saliva - 0.5 ml
5 Melox (1:5) 0.5 ml -
6 Melox (1:5) - 0.5 ml
7 Peptobismol (1:5) 0.5ml -
8 Peptobismol (1:5) - 0.5 ml
9 Agua destilada 0.5 ml -
10 Agua destilada - 0.5ml
2.- Agitar vigorosamente las mezclas preparadas.
3.- Medir el pH de cada solución empleando tiras reactivas.
4.- Explique la capacidad amortiguadora de cada una de las soluciones.

Preguntas
1.- Explique en qué consiste el equilibrio ácido- base.
2.- Describa mediante las ecuaciones Henderson- Hasselbalch cómo se obtiene el equilibrio.
3.- Investigue los compuestos que contienen las tiras reactivas.

Reporte:
Introducción
Objetivos
Metodología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
Referencias Bibliográficas.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 2
Prueba de Fehling
Ensayo basado en el poder reductor de los ázucares

Introducción.

Los azúcares se comportan como ácidos débiles que tienen características de aldehídos o
aldehídos potenciales. Por los efectos de los álcalis en los azúcares, a los que enolizan, son
semejantes a los que ejercen en los aldehídos. En su ausencia de álcali existe posiblemente un
equilibrio entre las formas enol y ceto, si bien generalmente el equilibrio está en favor de la forma
de ceto. Al adicionar álcali, la forma ácida enol origina una sal y desplaza la reacción a la derecha
por efecto de la acción de las masas (sustracción del producto en estado de equilibrio). En
presencia de álcali puede invertirse el equilibrio adicionando ácido que descompone la sal
originando la forma enol y reestableciendo el equilibrio tautómero. La tautomerización es propia
de los azúcares que contienen un grupo aldehído o cetona libre. Dado que los azúcares sencillos
en solución se presentan en su mayor parte en forma cíclica (Piranosa) más estable, parece que el
efecto de los iones alcalinos consiste en disminuir la formación cíclica, además de riginar la
tautomerización.

La enolización de los azúcares en condiciones alcalinas es un factor muy importante para evaluar
las pruebas de reducción, sobre todo cuando son cuantitativas. Muchos reactivos oxidan el grupo
aldehído (reductor) de los azúcares. En esto se basa la reacción o prueba de Fehling para distinguir
los “azúcares reductores”. El tartrato, al unirse al cobre formando un complejo soluble, impide la
formación de hidróxido cúprico insoluble que tendría lugar si existiese cobre libre en la solución
alcalina. Como criterio de positividad de la reacción se utiliza la formación de óxido cuproso rojo
insoluble. La prueba de Fehling no es específica. Otras sustancias que dan reacción positiva son:
fenoles, aminofenoles, benzoína, ácido úrico, catecol, ácido fórmico, hidrazobenceno,
fenilhidracina, pirogalol y resorcinol.

Material y reactivos.
Solución o reactivo Fehling

Solución 1 Pesar 8.663 g de sulfato de cobre en polvo (CuSO.5H 2O) y disolver en 125 ml de agua
destilada. Solución 2: Pesar 43.25 g de tartrato sódico-potásico (C 4H4O6NaK.2H2O) y 12.5 g de
hidróxido sódico (NaOH) y disolverlos en 125 ml de agua destilada. Preparar el reactivo de Fehling
mezclando cantidades iguales de las soluciones 1 y 2, justo antes de iniciar la práctica.

Azúcares: Glucosa (dextrosa), fructosa (levulosa), sacarosa, maltosa, lactosa. Preparar soluciones
de cada reactivo disolviendo 2 g en 50 ml de agua destilada.

Material
Baño de agua
Perlas de vidrio
Balanza analítica
Procedimiento

Reacción de Fehling: A un tubo de ensaye agregar 2.5 ml de un azúcar a ensayar. Posteriormente

añadirle 2.5 ml del reactivo de Fehling. Mezclar ambas soluciones vigorosamente. Someter la
mezcla a ebullición en baño de agua durante 5 a 10 minutos. Registre sus observaciones. Reporte
los resultados.

Preguntas

1.-¿Cómo se explica el comportamiento de la sacarosa en la prueba de Fehling?

2.-¿Una prueba gravimétrica debidamente ejecutada constituiría una buena reacción cuantitativa
para los azúcares reductores?

Reporte

Introducción
Objetivos
Metodología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
Bibliografía

Dr. José Gerardo Gaona lozano

Departamento de Biotecnología de Enzimas
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E-mail: jggaona@uadec.edu.mx
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 3
Prueba de Barfoed
Ensayo basado en el poder reductor de los ázucares

Introducción.

La prueba o reacción de Barfoed se emplea para diferenciar entre mono y disacáridos. La base de
esta prueba la constituye la diferente velocidad de la reacción con el acetato cúprico. La velocidad
de la reacción se determina por la velocidad de formación de Cu 2O. Concentraciones
equimoleculares de monosacáridos y disacáridos que tienen un grupo reductor por molécula
reaccionan con el reactivo de Barfoed a velocidades distintas. Una clara diferencia entre mono y
disacáridos es su tamaño molecular, lo que parece constituir un factor limitante en la velocidad de
la reacción. También pueden estar implicados otros factores tales como una interreacción más
compleja con los dos anillos monosacáridos. Esto parece suficiente para suponer que las
moléculas más pequeñas tienen una mayor reactividad.

Material y reactivos

Reactivo de Barfoed: Disolver en 500 ml de agua destilada 33.25 g de acetato de cobre en polvo
(CH3COO)2Cu; filtrar la solución por papel Whatman n°1 y añadir 12.5 ml de ácido acético al 38% (9
ml de ácido acético glacial aforados a 25 ml con agua destilada).
Azúcares: glucosa, fructosa, lactosa maltosa y sacarosa (0.05 M, 50 ml de c/u).
Baño de agua, perlas de vidrio y cronómetro.

Procedimiento:

Reacción de Barfoed. A 2.5 ml de cada una de las soluciones de los azúcares añadir 2.5 ml del
reactivo de Barfoed. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo. Anotar el tiempo
aproximado en que aparece el precipitado rojizo en cada tubo. Preparar un gráfico de las
velocidades de reacción de cada azúcar (abscisas= nombre del azúcar; ordenadas = recíproco del
tiempo en min-1) para formar Cu2O.

Preguntas
1 ¿Cuáles son los tiempos medios de formación de Cu 2O en los mono y disacáridos empleados en
este experimento?
2 ¿Es importante el tiempo de la reacción? ¿Varía de un carbohidrato a otro? ¿Tiene esto
importancia?

REPORTE
Introducción, Objetivos, Metodología, Resultados, observaciones, Conclusiones y Bibliografía.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 4
Propiedades fisicoquímicas de los lípidos

Introducción.

Dentro de los principales grupos de biomoléculas que conforman a todo ser vivo se encuentran los lípidos.
De manera muy general, éstos se definen como un conjunto heterogéneo de compuestos que se
caracterizan principalmente por su poca o nula solubilidad en agua (de carácter polar) y por el contrario,
solubles en solventes orgánicos (de carácter no polar). Esa gran heterogeneidad estructural conlleva a una
variedad de funciones biológicas, por citar solo algunas; fuente de energía (triglicéridos), reguladores
metabólicos y fisiológicos (hormonas esteroideas y prostaglandinas), vitaminas liposolubles (A, D, E y K),
emulsificantes (sales biliares) y estructura de las membranas celulares (fosfolípidos y colesterol). El modo y
grado de interacción de éstas biomoléculas con el agua también determina aspectos importantes en los
procesos biológicos. Por ejemplo, el carácter anfipático de los ácidos grasos de los fosfolípidos favorece la
eficiente formación de micelas y bicapas; mientras que, el carácter apolar de los ácidos grasos y los
triglicéridos los hace requerir mecanismos específicos de transporte a través de la sangre mediante la
albúmina y las lipoproteínas. El objetivo de este experimento es comprobar la relación de la estructura
química con las propiedades físicas de algunos compuestos de carácter lipídico presentes en los seres vivos.

Material y Reactivos

Tubos de ensayo 13 x 100 (con tapón). Baño de agua, mechero, tripie y tela de asbesto; Pipetas de
5 ml. Gradilla. Soluciones: Glicerina, ácido acético, ácido oleico, ácido esteárico y aceite vegetal.

Procedimiento

I.- Determinar la solubilidad de lípidos con base en su grado de saturación y longitud de cadena
hidrocarbonada.

1.- Disponer de 4 tubos de ensayo. En los 3 primeros depositar 2 ml de cadauna de las siguientes
sustancias: glicerina, ácido acético y ácido oleico. En el tubo restante 0.5 g de ácido esteárico.
Observar y anotar las características de las sustancias que se están utilizando.
2.- Agregar 3 ml de agua destilada a cada uno de los 4 tubos, taparlos (con el tapón plástico o
parafilm) y mezclar vigorosamente. Realice sus observaciones.
3.-Disponer de otros 4 tubos con las mismas sustancias como en la serie anterior. Agregar 3 ml de
aceite vegetal y mezclar. Realice sus observaciones.
4.-Colocar los tubos (excepto el que contiene la mezcla de ácido acético y aceite vegetal) en un
baño de agua hirviendo, observar lo que sucede durante 5 minutos.
5.-Transcurrido ese tiempo sacar los tubos del baño de agua y dejar enfriar. Observar y anotar lo
ocurrido.

Preguntas
1 Escriba las estructuras químicas de los compuestos empleados en esta práctica.
2 Investigue la composición del aceite vegetal, manteca, mantequilla, margarina y aceite de oliva.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 5
Complejos de la urea con los ácidos grasos

Introducción.

Los complejos de urea con los ácidos grasos constituyen unos derivados relativamente nuevos y
útiles para la identificación, preparación y aislamiento de los ácidos grasos de mezclas sencillas o
complejas. La urea forma también complejos con los ésteres, alcoholes, hidrocarburos saturados y
no saturados, cetonas y haluros alquílicos. No puede expresarse con una ecuación la reacción que
tiene lugar a causa de sus proporciones macromoleculares, si bien pueden formularse las
relaciones entre el número de moléculas de ácido graso y de urea. Los complejos de urea cumplen
casi todas las condiciones de los derivados ideales. Las temperaturas de disociación de los
complejos que contienen ácidos grasos íntimamente relacionados, son lo suficientemente
característicos como para permitir su estimación. La reacción se verifica igual a nivel semimicro o
micro y el ácido graso que forma parte del complejo es fácilmente recuperable. Los cristales son
grandes y fácilmente manejables y los complejos brutos normalmente son puros y no necesitan
recristalización ulterior alguna.

Las moléculas que poseen menos de 3 ó 4 átomos de carbono no forman complejos con la urea y
cada átomo de carbono del ácido graso o del derivado alquílico necesita 0.7 moles de urea, hecho
que sitúa a los complejos de urea al margen de los compuestos químicos ordinarios. Para iniciar la
compleja reacción de la urea con los ácidos grasos se necesitan 2 moléculas de urea. El complejo
de urea deriva su carácter en el tamaño, más que en la forma de sus moléculas. Cuanto más larga
es la cadena hidrocarbonada, mayor es la cantidad de urea necesaria para la formación del
complejo. Cuando se forma el complejo, la estructura de la urea cambia y sus cristales
tetragonales normales pasan a hexagonales, disponiéndose en forma helicoidal.

Material y reactivos

Capilares de vidrio, portaobjetos y cubreobjetos.

Parilla de calentamiento eléctrica.
Microscopio óptico.

Ácido esteárico
Ácido oleico (cis)
Metanol absoluto
Alcohol isopropílico
Urea
Hielo
Procedimiento:

1.-Disolver 3 g de urea en 20 ml de metanol absoluto (un matraz por cada ácido graso a ensayar).
2.-Añadir 1 g de ácido esteárico y 1 ml de ácido oleico, en sus respectivos matraces. Preparar
blancos que contengan sólo metanol y el ácido graso a ensayar (sin urea).
3.-Calentar en la parrilla eléctrica a una temperatura moderada, hasta que la solución se observe
transparente, si la sustancia no se disuelve completamente adicionar alcohol isopropílico gota a
gota a la solución caliente hasta alcanzar homogeneidad completa.
4.-Enfriar al chorro de agua o introducir los matraces en hielo para aumentar la producción de
cristales, sobre todo si no se obtiene precipitado a temperatura ambiente.
5.-Observar los cristales al microscopio. Dibuje perfectamente o fotografíe los cristales obtenidos.

Preguntas:

1.-¿Sería éste un buen método para investigar los componentes de las grasas?
2.-Escriba las estructuras químicas desarrolladas de la urea, ácido oleico y ácido esteárico.
3.-Describa y esquematice la estructura química del complejo urea-ácido graso.

Dr. José Gerardo Gaona lozano

Departamento de Biotecnología de Enzimas
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 6
Pruebas para la identificación de aminoácidos

Introducción.

Las proteínas son macromoléculas de elevado peso molecular, ya que su estructura consta de
cadenas de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos entre el grupo alfa carboxilíco de un
aminoácido y el grupo alfa amino del otro. Aunque en la naturaleza existen más de trecientos
aminoácidos, en las proteínas solo se encuentran 20 difieren en su tamaño, forma, carga,
capacidad de formar puentes de hidrógeno o disulfuro y reactividad química. Las múltiples
probabilidades de combinación de los veinte aminoácidos en las cadenas peptídicas, permiten la
gran diversidad de las funciones proteínicas. La presencia de grupos químicos ionizados en los
aminoácidos permite a las proteínas presentar características fisicoquímicas específicas en el
microambiente biológico. De ahí la importancia de su estudio. El objetivo de esta práctica es
realizar las pruebas de laboratorio que permitan el estudio de las propiedades fisicoquímicas de
aminoácidos y proteínas, así como su identificación.

Material y reactivos

Parrilla de calentamiento eléctrica.

Matraces Erlenmeyer de 125ml.
Tubos de ensaye 13 x 100
Pipetas de 10, 5 y 1 ml.
Baño María
Gradilla

Solución de Ninhidrina al 0.2 %

Reactivo de Biuret
Solución de glicina al 1%
Solución de fenilalanina al 1 %
Solución de triptófano o tirosina al 1 %
Solución de albúmina de suero de bovino al 0.5 mg/ml
Hidóxido de sodio al 40 %
Hidóxido de sodio al 10 %
Ácido nítrico concentrado
Ácido sulfúrico concentrado
Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Sulfato de cobre pentahidratado
Yoduro de potasio
Etanol al 95%
Preparar los reactivos como se indica:
Solución de Ninhidrina al 0.2%, disolver 0.2 g de ninhidrina en 10 ml de etanol al 95 % y completar
a 100 mlcon agua destilada.
Reactivo Biuret.;Disolver en 25 ml de agua destilada 0.75 g de sulfato de cobre, 3g de tartrato de
sodio y potasio tetrahidratado y 0.5g de yoduro de potasio (K l). Añadir con agitación constante
150 ml de hidróxido de sodio al 10 %. Diluir hasta 500 ml con agua destilada y mezclar.

Procedimiento
Prueba de la Ninhidrina

Fundamento; La ninhidrina reacciona específicamente con el grupo alfa-amino de los

aminoácidos, ya sean libres o bien unidos mediante enlace peptídico. La ninhidrina a un pH entre 4
y 8 es un oxidante muy fuerte y siempre reacciona con los compuestos alfa-amino para dar un
compuesto coloreado que varía de azul violeta al púrpura. Esta reacción se conoce como
condensación de la ninhidrina.

Método
1.- Enumerar tres tubos de ensayo
2.- En el tubo 1 colocar 1 ml de agua destilada que servirá de blanco.
3.- En el tubo 2 colocar 1 ml de la solución de glicina al 1 % (o cualquier otro aminoácido)
4.- En el tubo 3 colocar 1ml de la solución de albúmina de huevo al 1 %
5.- agregar a cada tubo 10 gotas de solución de ninhidrina al 0.2 %
6.- Mezclar y colocar en baño María durante 5 minutos.
7.- Observar y registrar los resultados.

Prueba de Biuret

Fundamento: La prueba llamada Biuret nos sirve para investigar la presencia de enlaces
peptídicos, unión específica entre los aminoácidos de las proteínas. Se basa en la formación de
bases complejas de color violáceo al añadir sulfato cúprico en solución alcalina. El complejo está
formado por enlaces de coordinación, donde los pares electrónicos proceden de los grupos amino
de los aminoácidos de la cadena polipeptídica.

Método:

1.-Enumerar tres tubos de ensayo.

2.-En el tubo 1 colocar 2 ml de agua destilada (blanco).
3.-En el tubo 2 colocar 2 ml de la solución de fenilalanina al 1 % (u otro aminoácido).
4.-En el tubo 3 colocar 2 ml d la solución de albúmina de huevo al 1 %.
5.-Agregar a cada tubo 2 ml del reactivo de Biuret.
6.-mezclar, observar y registrar sus resultados.

Reacción xantoprotéica para la identificación de aminoácidos aromáticos.

Fundamento: Los aminoácidos que contienen anillos aromáticos (fenilalanina, tirosina y

triptófano) se someten a nitración, los compuestos nitroderivados son de color amarillo. La
coloración amarilla se vuelve anaranjada con un tratamiento alcalino.
Método:

1.-Enumerar tres tubos de ensayo.

2.-En el tubo 1 colocar 1 ml de agua destilada (blanco).
3.-En el tubo 2 colocar 1 ml de la solución de triptófano o tirosina al 1 %.
4.-En el tubo 3 colocar 1 ml de la solución de albúmina de huevo al 1 %.
5.-Añadir sucesivamente a los 3 tubos: 0.5 ml de ácido nítrico concentrado y posteriormente una
gota de ácido sulfúrico.
6.-Clocar en baño maría durante 5 minutos.
7.-dejar enfriar y agregar posteriormente 1 ml de hidróxido de sodio al 40 %.
8.-Observar y registrar sus resultados.

Preguntas

1. Describa l mecanismo de reacción de cada una de las pruebas ensayadas.

2. Investigue los métodos que se emplean para la secuenciación de proteínas.

Dr. José Gerardo Gaona lozano

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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 7
Determinación de la concentración de proteína por el
metodo de Peterson (Lowry modificado)

Introducción.

En muchas ocasiones, cuando deben analizarse múltiples muestras, se prefiere el empleo de un

procedimiento analítico sencillo y rápido para determinar el nitrógeno proteico o “equivalentes”
de la proteína. A menudo la concentración de nitrógeno protéico se determina por la microtécnica
de Kjeldahl o por el micrométodo de Dumas. Estos métodos, sin embargo exigen demasiado
tiempo para la obtención de valores empíricos no lo suficientemente exactos. Una forma de
resolver este problema consiste en la determinación de los grupos reactivos de las proteínas
intactas. De estos grupos los más importantes son los ácidos y básicos (-COOH y NH 2) que no
permiten el empleo de procedimientos rápidos. El grupo imidazol de la histidina puede
determinarse fácilmente en la cadena peptídica, lo mismo que el grupo hidroxilo fenólico de la
tirosina, el sulfhidrilo de la cisteína y el guanidino de la arginina.

Dado que la tirosina se presenta en muchas proteínas a intervalos regulares, el método de Lowry
(Folin-Ciocalteu) para la determinación de los grupos hidroxifenólicos, constituye una técnica para
estimar a proteína total. La reacción de una proteína en solución con el reactivo de Folin se lleva a
cabo en dos etapas que llevan a la aparición final de color: (i) reacción con el cobre alcalino y (ii)
reducción del reactivo de Folin (fosfomolíbdico-fosfotúngstico) por la proteína tratada con el
cobre. La primera fase de la reacción de Folin se asemeja a la del Biuret o tiene una configuración
semejante. En cuanto a la reducción del reactivo de Folin, el máximo color se obtiene cuando la
reacción se lleva a cabo a un pH de 10, a este pH el reactivo solamente es activo durante poco
tiempo.

El método de Lowry para la determinación de la concentración de proteína es de 10 a 20 veces

más sensible que la estimación por absorción ultravioleta a 280 nm, varias veces más sensible que
la reacción de la ninhidrina y más fácil de realizar a microescala. El reactivo de Folin da más color
con las proteínas que con los aminoácidos y es 100 veces más sensible que la reacción de Biuret.
Peterson G.L., modificó el método de Lowry sólo añadiendo a la técnica el reactivo SDS (dodecil
sulfato de sodio) que permite una rápida determinación de la concentración de proteínas de la
membrana y de proteolípidos de las células de microorganismos en soluciones diluídas.

Material y reactivos.

Reactivo A (cobre alcalino):

Pesar 0.6 g de SDS y disolverlos en 12 ml de agua destilada. Posteriormente añadir 6 ml de
hidróxido de sodio (NaOH) 0.8 N. Añadir a la mezcla anterior 6 ml de la solución de cobre alcalino
preparada como sigue; a 5 ml de carbonato de sodio ( Na 2 CO3) al 20 % agregar 1 ml de sulfato de
cobre (CuSO4. 5 H2O) al 1 % : 1ml de tartrato de sodio y potasio al 2 % y 3 ml de agua destilada.
Mezclar de forma moderada para evitar la formación de excesiva espuma.
Reactivo B ( Folin – Ciocalteu, diluido 1: 5 ).
Albumina de suero de Bovino (Solución estándar, de 0.1 mg/ ml = 100 µg/ml). Preparar 100 ml.
Espectofotómetro.

Procedimiento

Construcción de la curva de calibración

A partir de la solución estándar de albúmina de suero de bovino, (100 µg / ml) tomar 1.0, 0.9, 0.8,
0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2,0.1 ml y completar a 1 ml de agua destilada para cada tubo ( 9) . Como
control o blanco añadir 1 ml de agua destilada a un tubo por separado.

Modo de Peterson (Lowry Modificado).

A 1 ml de muestra problema, al blanco y a las soluciones estándar para la curva de calibración,

añadir 1 ml de reactivo A, mezclar y dejar reposar por 10 min. Posteriormente agregar 0.5 ml del
Reactivo B, mezclar y dejar reposar por 30 minutos. Al cabo de ese tiempo leer la absorbancia de
cada solución a una longitud de onda de 750 nm en el espectofotómetro. Al inicio, antes de leer
las muestras problema y estándar en el espectrofotómetro, ajustar a cero de absorbancia con el
blanco.

Determinación de la concentración de proteína en la muestra problema.

Construir la curva de calibración graficando en papel milimétrico la absorbancia (abscisas) vs la

concentración estándar de cada solución de albúmina de suero bovino (ordenadas). Trazar una
línea recta que incluya la mayoría de los puntos determinados y posteriormente extrapolar la
lectura de absorbancia de la muestra problema para determinar la concentración de proteína.

Dr. José Gerardo Gaona lozano

Departamento de Biotecnología de Enzimas
Facultad de Ciencias Químicas. UAdeC.
E-mail: jggaona@uadec.edu.mx

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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 8
Determinación de la actividad enzimática (amilasa y catalasa)

Introducción.

Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza protéica. Todas las reacciones químicas del
metabolismo celular se realizan gracias a la acción de catalizadores o enzimas. La sustancia sobre
la cual actúa una enzima se denomina sustrato. Pasteur descubrió que la fermentación del azúcar
mediante levaduras, con su conversión en alcohol etílico y anhídrido carbónico es catalizada por
enzimas. En 1897 Buchner logró extraer de las células de levadura las enzimas que catalizan la
fermentación alcohólica. Summer en 1926 aisló en forma cristalina la enzima ureasa a partir de
extractos obtenidos de Cannavalia enzyformis. En 1930, Northrop aisló en forma cristalina las
enzimas digestivas; pepsina, tripsina y quimiotripsina. En la actualidad se conocen más de 2000
enzimas que han sido aisladas en forma cristalina. Antiguamente las enzimas fueron nombradas
atendiendo al sustrato sobre el que actuaban, añadiéndole el sufijo –asa o haciendo referencia a la
reacción catalizada. Así tenemos que la ureasa, cataliza la hidrólisis de la urea; la amilasa, la
hidrolisis del almidón; la lipasa, la hidrólisis de lípidos; la ADNasa, la hidrólisis del ADN; la ATPasa,
la hidrólisis del ATP, etc. Debido al gran número de enzimas conocidas en la actualidad, se ha
adoptado una clasificación y nomenclatura más sistemática, en la que cada enzima tiene un
número de clasificación que la identifica:

1.- Oxidorreductasas. Reacciones de transferencia de electrones.

2.- Transferasas. Transferencia de grupos funcionales. Ej. UDP-glucotransferasa.
3.- Hidrolasas. Reacciones de hidrólisis. Ej. Lipasa, proteasa, celulasa, etc.
4.- Liasas. Adición a dobles enlaces. Ej. Carboxilasa, fenilalanina amonioliasa.
5.- Isomerasas. Reacciones de isomerización. Ej. Fosfoglucosa isomerasa.
6.- Ligasas (sintetasas). Participan en la formación en la formación de enlaces con hidrólisis
de ATP.

Material y reactivos

Mechero, tripie y tela de asbesto

Tubos de ensaye 13x100
Baño de agua a 37 °C
Pipetas de 5 y 10 ml
Termómetro
Gradilla
Muestras biológicas: Saliva, levadura deshidratada (para preparar pan), hígado (de res o pollo) y
papa (cambray).
Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3 %
Solución fisiológica (NaCl 0.85 %)
Almidón soluble al 1%
Isodine (solución I/KI) diluido 1:2
Hielo.

Procedimiento

Ensayo enzimático: Amilasa

La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la

degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por
dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. Para medir la
actividad enzimática de la α-amilasa, se utilizará una prueba colorimétrica que detecta el
almidón. Para ello se contará con una solución de yodo/yoduro de potasio, ya que almidón en
presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Por lo tanto, en este
ensayo mediremos la desaparición de sustrato para determinar la actividad de la enzima.

1.- Recolectar 2.5 ml de saliva (concentrada) en un tubo de ensaye (A) y colocarlo en hielo. En otro
tubo (B) diluir 1/50 (0.1 ml con 4.9 ml de solución fisiológica) la muestra de saliva y dejar en hielo.
En el otro tubo (C) colocar 1 ml de la muestra de saliva concentrada y calentar hasta ebullición por
1 minuto, luego deje el tubo en la gradilla.

2.- Enumerar 3 tubos de ensayo. Agregar a los 3 tubos 1 ml de la solución de almidón soluble al 1
%. Posteriormente agregar a cada tubo 1 gota de la solución yodo/ yoduro de potasio (Isodine
1:2). Mezclar vigorosamente.

3.- En el tubo 1 añadir 1 ml de la muestra de saliva concentrada (A). En el tubo 2 añadir 1 ml de la

muestra de saliva diluida 1/50 (B). En el tubo 3 añadir 1 ml de la muestra de saliva concentrada
previamente calentada hasta ebullición (C) –control- . Tapar los tubos y mezclar por inversión
lentamente.

4.- Colocar inmediatamente los tres tubos en un baño de agua a 37 °C.

5.- Registre sus observaciones y resultados.

Ensayo enzimático: Catalasa.

El peróxido de hidrógeno (agua oxigenada, H 2O2) es un residuo del metabolismo celular de muchos
organismos vivos, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos
peligrosos. Para ello interviene con frecuencia la enzima catalasa (abundante en el hígado de
muchos animales y presente en la mayoría de las células vegetales y microorganismos), que
cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

La enzima catalasa que se ensayará provendrá de 3 fuentes diferentes:

A) Microbiana.
B) Animal: hígado de res o pollo.
C) Vegetal: papa
1.- Corte en trozos pequeños el hígado y la papa.
2.- Enumere 2 series (A y B) de 3 tubos de ensayo (6 tubos en total).
3.- En los tubos 1A y 1B agregue 0.5 g de levadura deshidratada.
4.- En los tubos 2A y 2B agregue 0.5 gr de hígado en trozos.
5.- En los tubos 3A y 3B agregue 0.5 gr de papa en trozos.
6.- Sólo para los tubos de la serie A (controles), añadir 3 ml de agua destilada caliente hasta
ebullición por 1 minuto. Luego deseche el agua, y deje reposar un momento.
7.- A continuación añada a las dos series de tubos 3 ml de peróxido de hidrógeno.
8.- Registre sus observaciones y resultados.

Preguntas:

1. Describa el concepto de catálisis enzimática.

2. Describa el mecanismo de la reacción enzimática de la amilasa y catalasa de acuerdo al
sustrato sobre el que actúan.
3. ¿Qué efecto tienen el pH y la temperatura sobre las enzimas?

Dr. José Gerardo Gaona lozano

Departamento de Biotecnología de Enzimas
Facultad de Ciencias Químicas. UAdeC.
E-mail: jggaona@uadec.edu.mx

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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 9
Aislamiento de ADN (Ácido desoxirribonucléico)

Introducción.

Los ácido nucleicos son polímeros denucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster. Por su
composición química, los ácidos nucleicos se han clasificado en dos tipos: el ácido
desoxirribonucléico (DNA) y el ácido ribonucleico (RNA). Los nucleótidos que forman el DNA está
constituido por el azúcar 2’-desoxirribosa unido mediante un enlace glucosídico a una base
nitrogenada (adenina, guanina, timina y citosina), las cuales a su vez forman dos cadenas de
polímeros generando una molécula de doble hélice. Los nucleótidos del RNA se encuentran
formados por el azúcar ribosa que se une a una base nitrogenada (adenina, guanina, uracilo y
citosina) formando moléculas de una sola cadena.

El genoma se encuentra organizado en forma diferente en las células procarióticas y eucarióticas,

presentándose en estas últimas un mayor grado de complejidad. El genoma de las células
procarióticas está comprendido dentro de una sola molécula de DNA circular, dispuesta de modo
compacto en una zona nuclear denominada nucleoide. El tamaño del genoma bacteriano se puede
ejemplificar con el de Escherichia coli cuyo tamaño es de 1 360 nm y se encuentra constituido por
cerca de 4 700 pares de bases (pkb).

Según el tipo de célula en estudio, el aislamiento de los ácidos nucleicos requiere romper la
membrana y la pared celular mediante el empleo de métodos físicos, químicos o enzimáticos con
el fin de liberar las moléculas de DNA al medio extracelular. Posteriormente, se realiza la
purificación de los ácidos nucleicos extrayendo las proteínas y los lípidos con solventes orgánicos,
para finalmente recuperarlos mediante la precipitación con alcohol (isopropanol o etanol).

Material

 Gradilla con 2 tubos de ensayo.

 Pipetas de 1 y 5 ml.
 NaOH 0.2 N – SDS (lauril sulfato de sodio) a 1 %.
 Bacteias en cultivo (E. coli).

Procedimiento

1. Tomar 5 ml de un cultivo de bacterias y centrifugar durante 5 minutos a 1,500 rpm.

Descartar el sobrenadante.
 2. Resuspender perfectamente (de preferencia con la ayuda de un vórtex) el sedimento
bacteriano en 0.8 ml de H2O.
3. Adicionar 1.6 ml de una solución de NaOH 0.2 N – 1 % de SDS.
4. Invertir el tubo suavemente tres veces.

5. Agregar 2.4 ml de etanol frío.

6. Invertir nuevamente el tubo tres veces y observar cómo se precipitan los filamentos del
DNA.
7. Colectar el DNA filtrando la solución y con una varilla de vidrio (girándola suavemente)
llevar el DNA a un tubo pequeño que contenga 0.2 ml de agua.
8. El DNA aislado se guarda en el refrigerador a -20 °C, resuspendido en agua para ser
utilizado en la práctica de electroforesis de ácidos nucleicos.
9. En caso de no poder recoger el DNA con la varilla, como se indica, proceder a centrifugar 5
minutos a 3,000 rpm. Descartar el sobrenadante y al sedimento agregándole 0.2 ml de
agua.

Preguntas

1.- ¿Dónde se encuentra el DNA en una bacteria y cuántas barreras hay que romper para liberarlo?
2.- ¿Cómo actúa un detergente para la extracción de DNA?

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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica No. 10
Electroforesis de ácidos nucleicos

Introducción.

Uno de los campos más importantes en la biología molecular lo constituye la ingeniería genética
(tecnología del DNA recombinante) que hace posible aislar un gen en su entorno, reproducirlo en
grandes cantidades, determinar su secuencia, modificarlo y reinsertarlo en un organismo, ya sea
para observar el alcance de la alteración o para producir grandes cantidades de su producto. El
potencial de esta tecnología es enorme y extremadamente poderoso con un sinfín de
aplicaciones a problemas biológicos, genéticos, médicos, agrícolas e industriales.

No es exagerado afirmar que uno de los elementos básicos del desarrollo de la ingeniería genética
ha sido la posibilidad de separar fragmentos del DNA mediante electroforesis en geles de agarosa.
Este método permite: a) El análisis rápido y preciso de mezclas de varios fragmentos del DNA en
función de su tamaño (para ajustar los fragmentos de un rompecabezas, primer lugar hay que
conocer sus dimensiones); b) La recuperación de las bandas (fragmentos de DNA del mismo
tamaño) de determinado tamaño para su posterior utilización. En la electoforesis, los fragmentos
de DNA son depositados en un extremo del gel de agarosa y se someten a un campo eléctrico; los
fragmentos migran al ánodo debido a su carga negativa.

Para hacerlo tienen que pasar a través de los poros formados por la estructura reticulada del gel,
lo cual los frena cuanto más grandes son. De esta manera se obtiene una separación en la que los
fragmentos pequeños migran más lejos que los grandes. La posición de los fragmentos después
de la migración se pone en evidencia mediante un colorante fluorescente muy sensible y
específico; Bromuro de etidio. El DNA que será utilizado en la electroforesis ha sido aislado
previamente en las prácticas; Aislamiento del DNA.

 Material.
 Cámara de electroforesis
 Lámpara de UV y máscara protectora.
 Guantes desechables
 Solución amortiguadora de Tris- Boratos EDTA (TBE)
 Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio 5 µg/ml.
 Amortiguador de muestra (azul de bromofenol 0.1 %, glicerol 20%, ETDA 50 mmol /L)
 Muestras control de DNA; Marcador de peso molecular (Molécula cuyo tamaño y
migración electroforética se conoce).
  Muestras de DNA Y ARN aislados previamente.

Procedimiento

Precaución; el Bromuro de etidio es tóxico, por lo que el manejo del gel que lo contiene debe
hacerse con guantes.

Preparación del gel de agarosa; Un gramo de agarosa se disuelven amortiguador de TBE en

ebullición: Una vez disuelta la agarosa, esperar a que la temperatura descienda a 40- 50 °C
aproximadamente y adicionar el bromuro de etidio a una concentración final de 0.5 µg/ml. Valorar
la mezcla sobre el molde portagel de la cámara. Una vez solidificado el gel, quitar el peine.

1.- Seleccionar las mejores muestras de DN, previamente aislado. De cada una de las muestras
tomar 0.05 ml ( ul).
2.- Vaciar estos 0.05 ml a un tubo pequeño y agregarle 0.05 ml de amortiguador de muestra.
Mezclar con cuidado, sin hacer burbujas.
3.- Poner el portagel en la cámara de electroforesis y agregar el amortiguador TBE hasta cubrir
completamente el gel.

Nota: Colocar los pozos del gel orientados hacia el polo negativo (terminal negra).

4.- En los pozos 1 y 6 del gel aplicar 10 µl de las muestras control del DNA con la ayuda de una
pipeta automática o de un tubo capilar; cuidar de no dejar burbujas de aire. En los pozos restantes
aplicar 20 µl de las muestras del DNA ya mezcladas con el amortiguador de muestra (pasos 1 y 2)
y tapar la cámara.

5.- Colocar los cables de los electrodos (cable rojo al polo positivo y negro al negativo) a la fuente
de poder y encenderla. A partir de este momento por ningún motivo debe tocarse la cámara de
electroforesis mientras este funcionando.

6.- Realizar la electroforesis a 50 miliamperes (ó 100 volts) durante aproximadamente 30 minutos.

El frente (coloreado de azul) no debe salir del gel.

7.- Terminada la electroforesis apagar la fuente de poder, desconectar los cables de los electodos
y retirar el portagel de la cámara.

8.- Determinar la posición de las bandas observando los geles en una lámpara de luz ultravioleta
(observar solo con los protectores).

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