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Manual de prácticas del laboratorio de

MICROBIOLOGÍA GENERAL

Autores:

Diana Marı́a Echeverry Arango


Olga Inés Montoya Campuzano

Universidad Nacional de Colombia


Biologı́a y Zooctenia
Medellı́n, Colombia
2013
Índice general

11.CONTROL MICROBIANO 1
11.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
11.2. Objetivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
11.3. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
11.4. Procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
11.4.1. Temperatura y Tiempo de Exposición . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
11.4.2. pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
11.4.3. Presión Osmótica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
11.5. Preparación de la cepa a estudiar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
11.5.1. Efecto del cloruro de sodio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
11.5.2. Efecto de la sacarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
11.6. Pruebas de sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
11.6.1. Antibiograma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
11.6.2. Agentes quı́micos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
11.7. Radiación Ultravioleta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
11.8. Cuestionario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

BIBLIOGRAFÍA 12
11 CONTROL MICROBIANO

11.1. Introducción
La conservación de materiales, el mejoramiento de sustratos mediante cultivos iniciadores y
una buena salud pública se logra, gracias a la combinación de diferentes métodos de control
ya sean fisicos, quı́micos y/o biológicos. Es ası́, como existen varias técnicas para controlar
las poblaciones microbianas como el efecto del calor, el pH, la luz ultravioleta, la presión
osmótica, los antibióticos, entre otros.

11.2. Objetivo
Emplear diferentes métodos para reducir, inhibir o eliminar poblaciones microbianas.

Evaluar la capacidad de inhibición, destrucción de cada uno de ellos sobre cepas Gram
negativas, Gram positivas y esporuladas.

11.3. Materiales
Cepas bacterianas Gram negativas: Escherichia coli, Klebsiella sp, Serratia sp.

Cepas bacterianas Gram positivas: Staphylococcus, Micrococcus sp.,Streptococcus


sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp.

Cultivos bacterianos en caldo nutritivo de 24 horas de incubación

Medios de cultivo: caldo nutritivo, Agar nutritivo, Agar Mueller Hinton.

Reactivos: Antibióticos, Agua oxigenada, Hipoclorito de sodio, extran, Alcohol, Fenol,


entre otros.

Mecheros

Asas

Escobillones

Pinzas estériles
2 11 CONTROL MICROBIANO

Pipetas

4 baños Marı́a temperados a 50◦ C, 60◦ C, 70◦ C, 80◦ C.

Discos de papel de filtro estériles y de antibióticos.

Medidores de pH.

Lámparas de luz Ultravioleta

Termómetros

Incubadora

11.4. Procedimiento
11.4.1. Temperatura y Tiempo de Exposición
Tomar 12 tubos de ensayo con Caldo Nutritivo, marcar cada uno con la respectiva cepa
y temperatura a trabajar ası́: 50◦ C, 60◦ C, 70◦ C, 80◦ C;
• Inocular cada tubo con 1 mL del caldo bacteriano (cepas Gram Positivas), mar-
cados previamente.
• Inocular otros cuatro tubos con el caldo bacteriano (cepas Gram Negativas), mar-
cados previamente.
• Inocular los cuatro tubos restantes con el caldo bacteriano (cepas esporuladas),
marcados previamente.
• Tomar doce cajas de petri con Agar Nutritivo y marcar cada una con la respectiva
cepa y la temperatura a trabajar ası́: 50◦ C, 60◦ C, 70◦ C, 80◦ C.
◦ Dividir la base de cada caja en cinco cuadrantes. Marcar cada cuadrante con
el tiempo de exposición ası́: Control, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min.
◦ Inocular cada caja de Agar en el segmento marcado como control, con uno de
los caldo bacteriano cepas (Gram positivas, Gram negativas y esporuladas)
contenidas en los tubos.
◦ Tomar los respectivos tubos con caldo bacteriano, previamente marcados con
la cepa y llevarlos al Baño Marı́a en la temperatura respectiva 50◦ C, 60◦ C,
70◦ C, 80◦ C.
◦ Tomar el tubo con el caldo bacteriano sometido a 50◦ C y dejar actuar por un
lapso de 5 minutos y Proceder a inocular en el segmento de la caja de petri
destinada al tiempo de exposición requerido.
11.5 Preparación de la cepa a estudiar 3

◦ Luego someter el mismo tubo con caldo bacteriano por 10 minutos pero par-
tiendo de cero tiempo y ası́, respectivamente hasta terminar todos los tiempos
y temperaturas.

11.4.2. pH
Tomar 5 tubos de ensayo con 6 mL de Caldo nutritivo cada uno.

Ajustar, el pH para cada tubo respectivamente en: 3.0, 5.0, 7.0 ,9.0 y 11.0 con HCl o
NaOH según el caso.

Inocular, cada uno de los tubos con 0.1 mL de la muestra del Microorganismo de
interés.

Incubar a 37◦ C por 24 a 48 horas.

Observar cada 24 horas.

Evaluar el crecimiento.

NOTA: repetir el mismo procedimiento para cada tipo de cultivo bacteriano. Gram
positivas, Gram negativas y esporuladas.

11.4.3. Presión Osmótica


El alumno manejará las técnicas para observar el efecto de la presión osmótica que
ejerce el Cloruro de sodio y la Sacarosa sobre el crecimiento bacteriano.

5 Tubos de 16X 150 mm, en cada uno 10 mL de caldo nutritivo que se diferencia según
la concentración de NaCl ya sea al 0 %, 5 %, 10 % y 15 %.

5 Tubos de 16X 150 mm, en cada uno 10 mL de caldo nutritivo que se diferencia según
la concentración de sacarosa ya sea al 0 %, 5 %, 10 % y 15 %

Nefelómetro de Mac Farland.

Pipetas de 5 mL y de 1 mL estériles.

Agua destilada estéril. CEPAS: Gram Negativas, Gram Positivas y Esporuladas.

11.5. Preparación de la cepa a estudiar


Preparar una suspensión concentrada de la respectiva cepa bacteriana.
4 11 CONTROL MICROBIANO

11.5.1. Efecto del cloruro de sodio


1. Colocar en una gradilla en orden creciente de concentración una serie de 5 tubos con 10
mL, cada uno con caldo nutritivo y su respectiva concentración de NaCl (0 %,5 %,10 %
y 15 %).

2. Rotular los tubos de acuerdo a la concentración y nombre de la cepa que se va a


inocular en ellos.

3. Inocular en cada tubo 0.l mL de la suspensión bacteriana correspondiente.

4. Repetir los pasos del 1 al 4 para cada cepa proporcionada.

5. Incubar los cultivos a 37◦ C durante 24 a 48 horas.

6. Homogeneizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo con base a su turbiedad.

11.5.2. Efecto de la sacarosa


Colocar en una gradilla en orden creciente de concentración una serie de 5 tubos con
10 ml cada uno con caldo nutritivo y su respectiva concentración de sacarosa (0 %,5 %,
10 % y 15 %).

Rotular los tubos de acuerdo a la concentración y nombre de la cepa que se va a


inocular en ellos.

Inocular en cada tubo con el caldo nutritivo 0.l mL de la suspensión bacteriana corres-
pondiente.

repetir los pasos del 1 al 4 para cada cepa proporcionada.

Incubar los tubos a 37◦ C durante 24 a 48 horas.

Homogeneizar el cultivo bacteriano.

Leer el resultado de cada tubo con base a su turbiedad.

11.6. Pruebas de sensibilidad


Se realizan empleando discos de sensibilidad grado comercial impregnados con antibióticos
y discos de papel filtro impregnado con cada agente quı́mico a estudiar.
11.6 Pruebas de sensibilidad 5

11.6.1. Antibiograma
Tomar las cajas de petri con Agar Müeller Hinton o Agar Nutritivo.

Marcar cada caja en su base con la cepa de interés y con los respectivos antibióticos a
estudiar.

Coger el tubo de ensayo con el respectivo cultivo bacteriano y proceder asépticamente


según indicaciones de la figura ?? en la página ??.

Sumergir un hisopo estéril al cultivo bacteriano.

Tomar la caja de petri y proceder a inócular sobre el medio de cultivo con escobillón
de algodón estéril, por el metódo de agotamiento en superficie.

Empleando pinzas previamente esterilizadas coger los discos sensitive con el respectivo
antibiótico.

Colocar sobre la superficie del cultivo microbiano, discos de sensibilidad de diferentes


antibióticos, de manera que haya una distribución uniforme, la distancia entre cada
disco no debe ser menor a 2 cm. (Figura 11-1)

Incubar a 37◦ C durante 24-48 horas.

Observar cada 24 horas la formación de halos de inhibición.

Figura 11-1: Control por antibióticos


6 11 CONTROL MICROBIANO

11.6.2. Agentes quı́micos


Tomar las cajas de petri con Agar Müeller Hinton o Agar Nutritivo.

Marcar cada caja en su base con la cepa de interés y con los respectivos agentes
quı́micos a estudiar.

Coger el tubo de ensayo con el respectivo cultivo bacteriano y proceder asépticamente


según indicaciones de la figura ?? en la página ??..

Sumergir un hisopo estéril al cultivo bacteriano.

Coger la caja de petri y proceder a inócular sobre el medio de cultivo con escobillón de
algodón estéril, por el metódo de agotamiento en superficie o diseminación con hisopo.

Coger otra caja de petri con cuatro divisiones y depositar en cada cuadrante los agente
quı́micos a estudiar previamente marcados.

Coger con la pinza previamente estéril, los discos de papel filtro y colocarlos en cada
cuadrante de la caja de petri para impregnarlos del respectivo agente quı́mico.

Tomar con las pinzas individualmente los discos de papel filtro impregnados con los
agentes quı́micos a estudiar.

Colocar los discos de papel filtro sobre la superficie del cultivo bacteriano de manera que
haya una distribución uniforme entre cada disco y con espacios prudenciales mı́nimo
de 2 cm (Figura 11-2).

Incubar a 37◦ C durante 24 a 48 horas.

Observar cada 24 horas la formación o no de halos de inhibición.


11.7 Radiación Ultravioleta 7

Figura 11-2: Control por agentes quı́micos

11.7. Radiación Ultravioleta


Tomar las cajas de petri con Agar Nutritivo.

Marcar las cajas con las diferentes cepas a estudiar en la base.

Tomar el inóculo del cultivo bacteriano con un escobillón previamente esterilizado.

Inocular la cepa a estudiar con escobillón de algodón estéril sobre la superficie del
medio de cultivo.

Asépticamente quitar la tapa de la caja de Petri.

Colocar una hoja de papel filtro estéril, a la cuál se le ha hecho un recorte central en
forma de estrella, sobre el cultivo bacteriano.
8 11 CONTROL MICROBIANO

Sin la tapa, exponer individualmente cada cultivo bacteriano a la radiación ultravioleta


corta, por 20 minutos.

Al terminar quitar el papel de filtro y colocar nuevamente la tapa a la caja de Petri


(Figura 11-3).

Incubar a 37◦ C durante 24 a 48 horas.

Observar el crecimiento, cada 24 horas.

Figura 11-3: Control por radiación


11.8 Cuestionario 9

11.8. Cuestionario
1. ¿Qué diferencia hay entre desinfectar y esterilizar?

2. ¿Que sucedió con el cultivo microbiano cuando se incremento la concentración del NaCl
y sacarosa en los distintos caldos nutritivos?

3. ¿Que nombre reciben las bacterias que soportan grandes presiones osmóticas?

4. ¿Cómo actúan en la celula bacteriana los antibióticos utilizados?

5. ¿Que son los antibiogramas y cuál es su función?

6. ¿Menciona dos causas del porque los microorganismos pueden llegar a hacerse resis-
tentes a los antibióticos?
10 11 CONTROL MICROBIANO

Tabla 11-1: FORMATO DE REPORTE No 8 (Control bacteriano)

2*Microorganismo TEMPERATURA

1.
2.
3.
4.
Determine las con-
diciones óptimas
de crecimiento y
de control para los
diferentes genéros
bacterianos.
2*Microorganismo DIFERENTES pH

1.
2.
3.
4.
Determine las con-
diciones óptimas
de crecimiento y
de control para los
diferentes genéros
bacterianos.
2*Microorganismo % NaCl

1.
2.
3.
4.
Determine las con-
diciones óptimas
de crecimiento y
de control para los
diferentes genéros
bacterianos.
11.8 Cuestionario 11

Microorganismo PORCENTAJE % SACAROSA

1.
2.
3.
4.
Determine las condicio-
nes óptimas de crecimien-
to y de control para los
diferentes genéros bacte-
rianos.—

Microorganismo AGENTE QUÍMICO

Tamaño de halo de inhibición / Respuesta: Sensible (S) ó Resistente (R)


1.
2.
3.
4.
Determine las condicio-
nes óptimas de crecimien-
to y de control para los
diferentes genéros bacte-
rianos.

Microorganismo AGENTE ANTIBACTERIANO

Tamaño de halo de inhibición / Respuesta: Sensible (S) ó Resistente (R)


1.
2.
3.
4.
Determine las condicio-
nes óptimas de crecimien-
to y de control para los
diferentes genéros bacte-
rianos

Microorganismo RADIACIÓN
Respuesta: Sensible (S) ó Resistente (R)
1.
2.
3.
4.
Determine las condicio-
nes óptimas de crecimien-
to y de control para los
diferentes genéros bacte-
rianos
BIBLIOGRAFIA
VERA GARCÍA. Introducción a la microbiologı́a. Editorial Universidad estatal
a distancia. p, 229. http://books.google.com.co/books?id=K_ETVnqnMZIC&pg=
PA50&dq=estructura+del+esporo&hl=en&sa=X&ei=ZLUeUuuOO6fTsAStuIHoBw&ved=
0CEkQ6AEwBQ#v=onepage&q=estructura%20del%20esporo&f=false ALVÁREZ, Li-
liana y otros. Manual de Laboratorio de Bacteriologı́a. Universidad de Antioquia, 1990.

ALZATE, Ruben. Microbiologı́a: Practicas de Laboratorio. Universidad Nacional


de Colombia, Sede Palmira, 1996.

BARRIOS DE MORENO, Ada. Microbiologı́a General. Mérida- Venezuela; Con-


sejo de publicaciones. 1996.

BRADSHAW I, Jack. Microbiologı́a de laboratorio. El Manual Moderno. México,


1976.

BROCK, Thomas D. y otros. Microbiologı́a. Ed. Prentice Hall Hispanoamericana


S.A., séptima edición, 1996.

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