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CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
NATAL
2014
MARÍLIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS
NATAL
2014
MARÍLIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Dr. Edda Lisboa Leite
Orientador
___________________________________________________
Dr. Ana Katarina Menezes da Cruz
1º Examinador
____________________________________________________
Dr. Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza
2º Examinador
____________________________________________________
Dr. Adeliana Silva de Oliveira
3º Examinador
___________________________________________________
Dr. Eduardo Henrique Cunha de Farias
4º Examinador
Dedico esta Tese:
À minha mãe, Creuza, por ser o meu anjinho de guarda e zelar tanto por mim em
todos os momentos da minha vida. Te amo!
Ao meu marido, Alexsandro, que com toda a sua paciência e amor, torna a minha
vida mais leve e feliz e que me deu o meu bem mais precioso, meu filho!
Aos meus irmãos, Abraão e Daniel, pelo apoio, torcida e amor incondicional, e a
Juju e Davi, meus sobrinhos, por colorirem minha vida.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me guiar e proteger em todos os momentos. “À ele toda honra e glória
todos os dias da minha vida.”
À minha família: aos meus avós, Lindalva e Pedro, e às Marias (in memoriam), e
aos meus tios, tias, cunhadas, primos e primas, por todo amor, apoio e presença
constante na minha vida!
Às tias Cleide e Iracema, por todo o mimo e cuidado que sempre tiveram comigo.
À minha segunda família: D. Liduina e Nivaldo, meus queridos sogros, sempre nos
ajudando e nos enchendo de amor. Grazi, Gilda, Juliana e D Alice, meu carinho
por vocês é imenso. Muito obrigada por nos cuidarem sempre tão bem e agradeço a
Deus por me trazer uma família tão especial junto com Alexsandro.
Ao pessoal do laboratório, que entre tapas e beijos, formamos uma grande família.
Hugo, Thiago, Celina, Kahena, Joedyson, Almino, Allisson, Luiza, Thuane e
Monique. Muito obrigada mesmo por exercitarem minha paciência (hahaha) e por
todos os momentos felizes que passamos juntos. E o que fica é muita saudade... E
aos antigos também: Lissandra, Cybelle, Micheline, Tarciana, Leila, Mila,
Adriane, Júlio César...
À Huguinho, por todos os momentos alegres do laboratório. Inclusive por nos provar
o quanto a bancada é resistente e por cair da cadeira sempre que necessário!
hahaha
Ao casal mais des-gracioso que existe: Allisson e Luiza. Amor, amizade e lealdade
é o que sei que transborda em vocês e que posso buscar sempre que precisar. Lu,
valeu pelas madrugadas amedrontadoras e elétricas no laboratório.
À Adriane. A vida, às vezes, nos faz tomar rumos diferentes e a distância afasta o
que é matéria. Mas essa mesma distância não consegue afastar as boas
lembranças, o carinho, a amizade e a gratidão que sentimos. Muito obrigada por
tudo e sinto sua falta.
À Thuane, uma pessoa linda que Deus colocou pra dar leveza a minha vida e pra
me mostrar que ainda existem pessoas de espírito iluminado nessa vida... Muito
obrigada pela imensa ajuda na Cultura e por me poupar de muitos cabelos
brancos...
À Monique, que me mostrou que existe “amizade à segunda vista”! Muito bom ter
descoberto essa pessoa super especial que você é e melhor ainda foi ter encontrado
uma amizade verdadeira em você!
Aos colegas do BIOPOL por toda a ajuda em todas as etapas deste trabalho.
Aos meus amigos de sempre: Jéssica, Érica, Bruna, Silvia, Álvaro, Humberto,
Géssica, Tiago DK, Roseane... Muito obrigada por tudo mesmo!
À Érica Cristina Pinheiro de Castro e ao Prof. João Paulo Santos Lima, pela
ajuda com as análises de catalase.
À Leonardo Nobre e Prof. Helena B. Nader INFAR (UNIFESP), pela ajuda com as
análises de apoptose a ciclo celular.
Arnaldo Antunes
RESUMO
Compounds derived from fungi has been the subject of many studies in order
to broaden the knowledge of their bioactive potential. Polysaccharides from Caripia
montagnei have been described to possess anti-inflammatory and antioxidant
properties. In this study, glucans extracted from Caripia montagnei mushroom were
chemically characterized and their effects evaluated at different doses and intervals
of treatment. It was also described their action on colonic injury in the model of colitis
induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), and its action on cells of the
human colon carcinoma (HT-29). Compounds extracted of C. montagnei contain
high level of carbohydrates (96%), low content of phenolic compounds (1.5%) and
low contamination with proteins (2.5%). The (FT-IR) and (NMR) analysis showed
that polysaccharides from this species of mushroom are composed of α- and β-
glucans. The colonic damage was evaluated by macroscopic, histological,
biochemical and immunologic analyses. The results showed a reduction of colonic
lesions in all groups treated with the glucans of Caripia montagnei (GCM). GCM
significantly reduced the levels of IL-6 (50 and 75 mg/kg, p < 0.05), a major
inflammatory cytokine. Biochemical analyses showed that such glucans acted on
reducing levels of alkaline phosphatase (75 mg/kg, p < 0.01), nitric oxide (p < 0.001),
and myeloperoxidase (p < 0.001). These results were confirmed microscopically by
the reduction of cellular infiltration. The increase of catalase activity suggest a
protective effect of GCM on colonic tissue, confirming their anti-inflammatory
potential. GCM displayed cytostatic activity against HT-29 cells, causing
accumulation of cells in G1 phase, blocking the cycle cell progression. Those glucans
also showed ability to modulate the adhesion of HT-29 cells to Matrigel® and
reduced the oxidative stress. The antiproliferative activity against HT-29 cells
displayed by GCM (p <0.001) can be attributed to its cytostatic activity and induction
of apoptosis by GCM.
FIGURA 11: Espectro FT-IR dos polissacarideos obtidos por extração aquosa
seguido de precipitação com etanol do fungo montagnei Caripia......................62
FIGURA 21: Análise de citometria de fluxo com dupla marcação para anexina
V-FITC e PI em células do carcinoma de cólon humano (HT-29). As células foram
tratadas com 50 ou 100 μg de GCM por 24 horas. (A): controle negativo (sem
tratamento), (B): células tratadas com 50 μg de GCM, (C): células tratadas com 100
μg de GCM. Quadrante superior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC
e positiva para PI (células não viáveis – necrose); quadrante superior direito:
marcação positiva para anexina V-FITC e PI (células não viáveis – apoptose tardia);
quadrante inferior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC e PI (células
viáveis); quadrante inferior direito: marcação positiva para anexina V-FITC e
negativa para PI (células não viáveis – apoptose precoce).......................................76
µg micrograma
µL microlitro
CAT Catalase
CACRN Neoplasia colorretal associada a colite
CCR Câncer colorretal
CIN Instabilidade cromossômica
COX2 Ciclooxigenase 2
CUC Colite ulcerativa crônica
DC Doença de Crohn
DCFH Diclorofluoresceína
DCFH-DA Diclorofluoresceina-diacetato
DII Doença inflamatória intestinal
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FA Fosfatase alcalina
FT-IR Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier
GCM Glucanas de Caripia montagnei
H2O2 Peróxido de hidrogênio
H&E Hematoxilina e Eosina
ICAMs Moléculas de adesão intercelulares
IFN-γ Interferon gamma
IL-1 Interleucina 1
IL-2 Interleucina 2
IL-6 Interleucina 6
iNOS Óxido nítrico sintetase induzível
MEC Matriz extracelular
MPO Mieloperoxidase
MTT brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio
NF-κB Fator nuclear κB
nm Nanômetros
NO Óxido nítrico
NO2 íon nitrito
NO3 íon nitrato
ºC graus centígrados
PI Iodeto de propídio
PPT Precipitado
RMN Ressonância magnética nuclear
ROS Espécies reativas de oxigênio
TNBS Ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico
UC Colite ulcerativa
VCAMs Moléculas de adesão vascular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 18
1.1 INFLAMAÇÃO 18
1.2 DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS 24
1.3 CÂNCER 29
1.4 COLITE E CÂNCER COLORRETAL (CCR) 32
1.4.1 Tratamentos atuais 36
1.5 POLISSACARÍDEOS FÚNGICOS E SEU POTENCIAL BIOATIVO 37
2 OBJETIVOS. 43
2.1 OBJETIVO GERAL 43
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 43
3 MATERIAIS E MÉTODOS 45
3.1 MATERIAIS 45
3.1.1 Fungo 45
3.1.2 Animais 46
3.1.3 Reagentes e aparelhos 46
3.2 MÉTODOS 47
3.2.1 Extração aquosa dos polissacarídeos de Caripia montagnei 49
3.2.2 Caracterização química dos polissacarídeos do fungo Caripia
montagnei 51
3.2.2.1 Análises colorimétricas 51
3.2.2.1.1 Açúcares totais 51
3.2.2.1.2 Proteínas 51
3.2.2.1.3 Sulfato 51
3.2.2.1.4 Fenóis totais 51
3.2.2.2 Análise da composição monossacarídica 52
3.2.2.3 Análise de infravermelho 52
3.2.2.4 Ressonância magnética nuclear (R.M.N) 52
3.2.3 Avaliação das atividades farmacológicas de GCM 53
3.2.3.1 Avaliação do efeito de GCM no modelo de colite ulcerativa induzida por
ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) 53
3.2.3.1.1 Tratamento 53
3.2.3.1.2 Análise macroscópica 54
3.2.3.1.3 Avaliação da atividade da mieloperoxidase 55
3.2.3.1.4 Avaliação da atividade da fosfatase alcalina 55
3.2.3.1.5 Avaliação da atividade da catalase 56
3.2.3.1.6 Análise de citocinas 56
3.2.3.1.7 Análises histológicas 56
3.2.4 Ação de GCM sobre células do carcinoma de cólon humano (HT-29)
56
3.2.4.1 Ação de GCM na proliferação celular in vitro (Ensaio de MTT) 56
3.2.4.2 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI) e distribuição do ciclo celular nas
células do carcinoma de cólon humano (HT-29) 57
3.2.4.2.1 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI 57
3.2.4.2.2 Ensaio da distribuição das células no ciclo celular 58
3.2.4.3 Ensaio de atividade antioxidante in vitro 59
3.2.4.4 Ensaio de adesão 59
3.2.5 Análises estatísticas 60
4 RESULTADOS 61
4.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA 61
4.1.1 Espectro FT-IR 62
4.1.2 Ressonância Magnética Nuclear 63
4.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO DE GCM NO MODELO DE INFLAMAÇÃO
COLÔNICA INDUZIDA POR TNBS EM RATOS WISTAR 65
4.2.1 Análise macroscópica 65
4.2.2 Atividade da mieloperoxidase 67
4.2.3 Atividade da fosfatase alcalina 68
4.2.4 Atividade da catalase 69
4.2.5 Óxido nítrico 70
4.2.6 Análise de citocinas 71
4.2.7 Análises histológicas 72
4.3 EFEITO DE GCM SOBRE CÉLULAS DO CARCINOMA DE CÓLON
HUMANO (HT-29) 74
4.3.1 Ação de GCM na viabilidade celular in vitro (Ensaio de MTT) 74
4.3.2 Ensaio de apoptose 75
4.3.3 Ensaio de distribuição do ciclo celular 77
4.3.4 Ensaio de adesão 79
4.3.5 Ensaio de atividade antioxidante 80
5 DISCUSSÃO 82
6 CONCLUSÕES 92
REFERÊNCIAS 94
1 INTRODUÇÃO
1.1 INFLAMAÇÃO
1.3 CÂNCER
Tanto a colite ulcerosa (UC) e doença de Crohn (DC) estão associadas com
um risco aumentado de câncer colorretal (CCR) (ULLMAN; ITZKOWITZ, 2011).
Bargen, em 1928, foi o primeiro a relatar 20 casos de CCR em conseqüência da UC.
Em 1971, Dombal relatou um risco cumulativo de desenvolvimento de CCR em
pacientes com UC extensa em 5% depois de 10 anos e 41,8% após 25 anos. Trinta
anos mais tarde, uma estudo de meta-análise descobriu que o risco cumulativo de
CCR para qualquer paciente com UC foi de 2% em 10 anos, de 8% em 20 anos, e
18% em 30 anos (EADEN; ABRAMS; MAYBERRY, 2001).
O risco de câncer colorretal (CCR) na colite ulcerativa crônica (CUC) parece
depender de um equilíbrio de fatores diagnósticos e de proteção. Foi sugerido que a
inflamação crônica promove o carcinoma como seqüência da CUC (ITZKOWITZ;
YIO, 2004). Na DC, é aceita a hipótese de que a instalação precoce e a longa
evolução da doença inflamatória sejam fatores associados de risco associados ao
desenvolvimento do câncer (RIBEIRO et al., 1991; LASHNER, 1992; MARCHETTI,
FAZIO, OZUNER, 1996; RAMOS et al., 1997).
Mesmo com esse conhecimento, permanece incerto os motivos pelos quais
somente alguns pacientes irão desenvolver CCR mesmo em um grupo em cuja
duração da inflamação do cólon e a extensão da colite sejam similares. Ao
investigar a importância de algumas variáveis para CCR dentro da população do
mesmo estudo, importantes estratégias de prevenção do câncer e subgrupos de alto
risco podem ser identificados.
A importância dos vários conhecidos fatores de proteção associados com
CCR não é bem descrito. Isso pode ser em parte porque esses fatores não têm sido
avaliados dentro do mesmo estudo. Muitos estudos são preliminares, tornando-se
difícil de avaliar e ajustar essas diversas variáveis simultaneamente. O início da
CUC, histórico familiar de CCR, alergia a sulfa, colangite esclerosante primária
(PSC) e a atividade clínica foram relatados por serem fatores preditivos do risco de
câncer apenas em alguns casos. Já os estudos populacionais, consultas médicas
regulares, tabagismo, ácido fólico, colonoscopia de vigilância, e terapia crônica com
Ácido 5-aminossalicílico (5-ASA), têm sido relatados por serem protetores em
apenas alguns estudos. (GREENSTEIN 1979; PRIOR et al., 1982; LASHNER et al.,
1989; EKBOM et al., 1990; BERNSTEIN et al., 1994; PINCZOWSKI et al., 1994;
LOFTUS et al., 1996; KORNFELD et al., 1997; KARLEN et al., 1998; NUAKO et al.,
1998a; NUAKO et al., 1998b; SHETTY et al., 1999; EADEN et al., 2000; ASKLING et
al., 2001; HEUSCHENET et al., 2001; BERNSTEIN, 2003; RUTTER et al., 2004).
Evidências da forte ligação genética entre a doença inflamatória intestinal
(DII) e câncer são escassas e o risco de transformação neoplásica está mais
relacionada à duração e extensão da colite e confirmação histológica da inflamação
da mucosa (GUPTA et al., 2007).
Apesar dos dados implicarem a inflamação no desenvolvimento da
tumorigênese, a avaliação de risco em pacientes individuais permanece imprecisa.
No entanto, a consideração do papel da inflamação na patobiologia da
transformação neoplásica tem implicações tanto para a compreensão da progressão
da doença quanto para a prática clínica (CAMPBELL; MAXWELL, 2009).
Relatos na literatura atestam que a inflamação tem um papel na homeostase
do tumor e, também é a chave para a transformação neoplásica (KORNFIELD,
1997; PERWEZ, HARRIS, 2007; GUPTA et al., 2007b).
Inversamente, as drogas anti-inflamatórias podem inibir o desenvolvimento de
tumores (ORII et al., 2003). Os radicais livres produzidos pela resposta inflamatória
são altamente reativos com praticamente todos os tipos de biomoléculas, incluindo o
DNA. O estresse oxidativo crônico pode promover eventos de mutação, incluindo
instabilidade cromossômica (CIN) (LIMOLI; GIEDZINSKI, 2003). Apesar da
instabilidade de microssatélites, as mudanças de metilação e outros eventos
mutacionais também estão envolvidos. CIN é considerada por representar a principal
via de carcinogênese na DII. As anormalidades moleculares na neoplasia colorretal
associada a colite (CACRN) são semelhantes a aqueles envolvidos no CCR embora
diferenças substantivas ocorram na temporização dos eventos (ITZKOWITZ; YIO,
2004).
Foi visto que CIN seminais, em particular, pode ocorrer em estágios iniciais de
desenvolvimento de CACRN (WILLENBUCHER et al., 1999).
A inflamação pode induzir diferentes categorias de proliferação celular em
tecidos afetados, dependendo da gravidade da lesão induzida. Citocinas pró-
inflamatórias tem um efeito mitogênico direto, enquanto a necrose do tecido é
normalmente seguida por uma cura regenerativa (PANJA et al., 1998; FARBER,
1995). Estudos utilizando o fígado como órgão modelo demonstraram que a
proliferação regenerativa de células têm um papel significativo na inflamação
associada a tumorigênese. Por outro lado, a proliferação mitogênica tem um risco
pouco demonstrável (LEDDA-COLUMBANO et al., 1992; 1993).
No intestino ou cólon, o fenômeno notável de rápida melhora após a lesão
inflamatória com restauração completa da morfologia da cripta/vilosidade em todas
as linhagens celulares ocorre pelo processo de regeneração da mucosa (PATEL et
al., 1996; POTTEN, 1991). As cicatrizações regenerativas recorrentes na colite, no
entanto, podem conferir aumento do risco de câncer (OKAYASU et al., 2002).
Uma evidência suportou o conceito de que a cura regenerativa por si só
contribui para a instabilidade do genoma. O DNA isolado a partir da mucosa
regenerativa não-neoplásica na colite apresenta microssatélites de instabilidade,
considerados como indicativos de uma hipermutabilidade transiente, em vez que
mimetisa a reparação de genes do DNA sem qualquer alteração prévia (HEINEN,
1997).
A colite recorrente pode promover o desenvolvimento e expansão de
manchas mutantes das mucosas, antes da formação do tumor. Assim, a
regeneração poderia aumentar a tumorigênese por diminuição metabólica das
defesas contra as espécies oxidativas mutagênicas ou por aumento da frequência
de mutação celular e expansão clonal mutante. Episódios recorrentes poderiam
promover o desenvolvimento de subclones cada vez mais instáveis que re-
epitelizariam áreas ulceradas, levando, finalmente, para displasia multifocal ou
câncer, típico de CACRN (DONNELLY et al., 2004; 2005).
A transformação neoplásica na colite funciona em um longo curso
caracterizado por instabilidade genômica progressiva. A displasia progride através
da displasia de baixo grau para a displasia de alto grau (HGD) por aquisição de
mutações adicionais em k-ras, APC e outros genes. Manchas displásicas podem
atingir um tamanho grande (AHNEN, 1992).
Os cânceres são considerados por surgir dentro dessas manchas displásicas
circunscritas em 78-94% dos casos (CONNEL et al., 1994; VONHERBAY; OTTO,
1994). A displasia de alto grau tem 83% de valor preditivo positivo para câncer
(CONNEL et al., 1996). Em pacientes com estabelecida displasia de alto grau ou
câncer, CIN é detectável na mucosa morfologicamente normal em toda a área
lesionada ou no cólon inteiro (RABINOVITCH et al., 1999).
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Fungo
Reino: Fungi
Filo: Basidiomycota
Classe: Holobasídiomycetes
Ordem: Aphylloporales
Família: Podoscyphaceae
Gênero: Caripia
Espécie: Caripia montagnei
3.2 MÉTODOS
2V acetona 80%
25 °C/24 h
Filtração
SOBRENADANTE PPT
Clorofórmio-metanol,
60 ºC/2 h
Filtração
SOBRENADANTE PPT
Água destilada
100 °C/3 h
Filtração
SOBRENADANTE PPT
2V etanol
Centrifugação
8000 rpm/20 min
Secagem e pulverização
3.2.2.1.2 Proteínas
3.2.2.1.3 Sulfato
O teor de sulfato total foi determinado após hidrólise ácida (HCl 6 N, 6 horas,
100 ºC) por turbidimetria pelo método da gelatina-bário (DODGSON; PRICE, 1962).
O sulfato de sódio (1 mg/mL) foi utilizado como curva padrão sendo submetido as
mesmas condições das amostras em estudo.
3.2.3.1 Avaliação do efeito de GCM no modelo de colite induzida por ácido 2,4,6-
trinitrobenzeno sulfônico (TNBS)
A colite experimental é um modelo de inflamação intestinal bem estabelecido
e foi induzida em ratos Wistar (n=10) como descrito por MORRIS et al., (1989).
Animais em jejum por 24 horas antes do experimento e com livre acesso à solução
de glicose 5%, foram anestesiados com a administração intreperitonial de ketamina
(80 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg). A indução da colite foi realizada pela
administração intracolônica de 30 mg de ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico em
0,25 mL de solução de etanol a 40% (v/v) através de um catéter de polietileno
inserido no lúmen do cólon. Este mesmo procedimento foi realizado nos grupo
controle negativo, entretanto, os animais controle receberam 0,25 mL de solução
salina (0,9%) (FIGURA 9).
3.2.3.1.1 Tratamento
3.2.4.2 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI) e distribuição do ciclo celular nas
células do carcinoma de cólon humano (HT-29)
Células HT-29 foram incubadas a uma densidade de 3x10 4 células por poço
em placas de 96 poços a uma atmosfera de 5% CO2 por 24 horas. Após esse
período, as células foram incubadas com 25, 50 ou 100 µg/100 µL de GCM
juntamente com 100 μL de DCFH-DA a 25 µM e deixadas ao abrigo da luz por 4
horas. Após esse período, o sobrenadante foi removido e os poços foram lavados 2
vezes com PBS (0,1M, pH 7,4). Para avaliar o efeito protetor de GCM, peróxido de
hidrogênio (15 µM) foi adicionado e deixado por 30 minutos em contato. A leitura foi
realizada em leitor de microplacas sigma D-6883, sob excitação de 485 nm e
emissão de 530nm.
FIGURA 10: Composição química do composto extraído dos corpos de frutificação do fungo
Caripia montagnei.
4.1.1 Espectro FT-IR
A análise de FT-IR (FIGURA 11) revelou a banga larga em torno de 3500 cm-
1
, cujo sinal é característico do estiramento axial do grupo OH. O sinal existente na
faixa de 2900 e 2800 cm-1 demonstrou a presença do grupamento aldeído (C-H) em
deformação axial. As análises também revelaram absorções entre 1300-1800 cm-1,
características da presença de carboidratos (PAGLIA; VALENTINE, 1967;
WORTHINGTON; ROSEMEYER, 1974). Além disso, foi observada a presença da
banda entre 1000 e 1100 cm-1, ou seja, 1045 cm-1 sendo característico da presença
de β-glucanas devido aos resíduos de glucose O-substituídos (MATHLOUTHI;
KOENIG, 1986; STONE; CLARKE, 1992). Um sinal foi encontrado na faixa dos 855
cm-1 o qual corresponde a presença de α-glucanas (FANG et al., 2012).
FIGURA 11: Espectro FT-IR dos polissacarideos obtidos por extração aquosa seguido de
precipitação com etanol do fungo Caripia montagnei.
4.1.2 RMN
FIGURA 13: Lesões macroscópicas no cólon de ratos (n = 3) com colite induzida por ácido
2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS). (A): Animais do controle positivo - TNBS, (B): controle
negativo, (C e D): tratado a cada 12 e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F):
tratado a intervalos 12 e 24 h, respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12
e 24 h, respectivamente, com 75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h,
respectivamente, com 1 mg / Kg de dexametasona; (K) o efeito de GCM na inflamação do cólon. Os
dados são expressos como a média ± desvio padrão. *** p <0,001.
4.2.2 Atividade da mieloperoxidase
FIGURA 15: Avaliação do efeito de GCM sobre a atividade da fosfatase alcalina no tecido do
colônico de animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a
média ± desvio padrão. * p < 0,05; ** p < 0,01.
4.2.4 Atividade da catalase (CAT)
FIGURA 16: Efeito de diferentes doses de GCM na catalase do tecido do cólon em animais
com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. ** p <
0,01; *** p < 0,001
4.2.5 Óxido nítrico
FIGURA 17: Efeito de diferentes doses de GCM no teor de óxido nítrico no tecido do cólon no
modelo de colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. ***
p < 0,001
4.2.6 Análise de citocinas
FIGURA 19: Análise histológica do cólon de diferentes grupos de animais com colite induzida
por TNBS. (A): animais do controle positivo - TNBS, (B): controle negativo, (C e D): tratado a cada
12 h e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F): tratado a intervalos de 12 h e 24 h,
respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com
75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com a 1 mg / Kg de
dexametasona.
4.3 EFEITO DE GCM SOBRE CÉLULAS DO CARCINOMA DE CÓLON HUMANO
(HT-29)
FIGURA 21: Análise de citometria de fluxo com dupla marcação para anexina V-FITC e PI em
células do carcinoma de cólon humano (HT-29). As células foram tratadas com 50 ou 100 μg de
GCM por 24 horas. (A): controle negativo (sem tratamento), (B): células tratadas com 50 μg de GCM,
(C): células tratadas com 100 μg de GCM. Quadrante superior esquerdo: marcação negativa para
anexina V-FITC e positiva para PI (células não viáveis – necrose); quadrante superior direito:
marcação positiva para anexina V-FITC e PI (células não viáveis – apoptose tardia); quadrante
inferior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC e PI (células viáveis); quadrante inferior
direito: marcação positiva para anexina V-FITC e negativa para PI (células não viáveis – apoptose
precoce).
FIGURA 22: Efeito de GCM na viabilidade das células de carcinoma de cólon humano (HT-29)
avaliada por citometria de fluxo. Células viáveis: marcação negativa para anexina V-FITC (V) e PI;
Células não viáveis: marcação positiva para anexina V-FITC e negativa para PI (células em apoptose
precoce); marcação negativa para anexina V-FITC e positiva para PI (células em necrose); marcação
positiva para anexina V-FITC e PI (células em apoptose tardia). Valores foram expressos por médias
± desvio padrão. (a): p < 0,005; (b): p < 0,001.
FIGURA 23: Análise da distribuição no ciclo celular das células do carcinoma de cólon humano
(HT-29). (A): distribuição do ciclo celular das células não tratadas (células controle), (B): distribuição
do ciclo celular das células tratadas com 50 μg de GCM, (C): distribuição do ciclo celular das células
tratadas com 100 μg de GCM.
TABELA 1: Avaliação do efeito de GCM na distribuição das células do carcinoma de cólon
humano (HT-29) no ciclo celular. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. Fases
do ciclo celular - G1: gap 1; G2: gap 2; S: fase de síntese.
Este ensaio foi realizado visto que, eventos de adesão célula-célula e célula
matriz extracelular (MEC) são de grande importância no organismo.
Matrigel® é um composto constituído por diferentes proteínas da matriz
extracelular que incluem laminina, colágeno IV e entactina (KLEINMAN; MARTIN,
2005). A capacidade de células tumorais de alterar a sua migração e adesão aos
componentes da matriz extracelular (MEC), faz com que essas células contornem
obstáculos mais facilmente e alcançem a circulação, não se depositando em outros
locais do organismo.
Foi investigado a capacidade do tratamento com GCM de alterar a aderência
das células HT-29 (FIGURA 24). Os resultados mostram que o tratamento com as
glucanas na concentração de 25 mg/mL afetou de forma moderada (68,72%) a
aderência das células HT-29 ao matrigel. Além disso, o aumento das concentrações
para 50 e 100 mg/mL, reduziu significativamente em cerca de 84,75% e 85,25%,
essa aderência ao Matrigel.
FIGURA 24: Efeito de GCM sobre a adesão de células do carcinoma de cólon humano (HT-29)
ao matrigel. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. *** p < 0,001.
A ação citostática foi promovida por GCM, uma vez que atuaram na inibição
da proliferação de células HT-29, fato este que pode ter sido ocasionado pela
parada do ciclo celular (não progressão da fase G1 para fase G2);
ADAMS, D. Fungal cell wall chitinases and glucanases. Microbiology, 150( 7):
2029-2035, 2004.
AHNEN, D.J. Abnormal DNA content as a biomarker of large bowel cancer risk and
prognosis. J Cell Biochem Suppl, 16G: 143-50, 1992.
ALMEIDA, V.L.; LEITÃO, A.; REINA, L.C.B.; MONTANARI, C.A.; DONNICI, C.L.;
LOPES,M.T.P. Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e ciclo-
celular não específicos que interagem com o DNA: uma introdução. Quim. Nova,
28(1):118-129, 2005.
BAI, A.P.; OUYANG, Q. Probiotics and inflammatory bowel diseases. Post grad Med
J, 82:376–82, 2006.
BARGEN, J.A. Chronic ulcerative colitis associated with malignant disease, 1928.
Dis Colon Rectum, 37:727–730, 1994.
BATTLE, J.; HA, T.; LI, C.; DELLA BEFFA, V.; RICE, P.; KALBFLEISCH, J.;
BROWDER, W.; WILLIAMS, D. Biochem. Biophys. Commun., 249: 499-504, 1998.
BELL, C.J.; GALL, D.G.; WALLACE, J.L. Disruption of colonic electrolyte transport in
experimental colitis. Am J Physiol., 268: 622-30, 1995.
BELLINI, M.F.; ANGEL, J.P.F. I.; MATUO, R.; TEREZAN, A.P.; RIBEIRO, L.R.;
MANTOVANI, M.S. Antigenotoxicity of Agaricus blazei mushroom organic and
aqueous extracts in chromosomal aberration and cytokinesis block micronucleus
assays in CHO-k1 and HTC cells. Toxicology in Vitro, 20: 355–360, 2006.
BERNSTEIN, C.N.; BLANCHARD, J.F.; METGE, C.; YOGENDRAN, M. Does the use
of 5-aminosalicylates in inflammatory bowel disease prevent the development of
colorectal cancer? Am J Gastroenterol., 98:2784 –2788, 2003.
BERNSTEIN, C.N.; SHANAHAN, F.; WEINSTEIN, W.M. Are we telling patients the
truth about surveillance colonoscopy in ulcerative colitis? Lancet, 343:71–74, 1994.
BJELLAND, S.; SEEBERG, E. Mutagenicity, toxicity and repair of DNA base damage
induced by oxidation. Mutation Research – Fundamental and Molecular
Mechanisms of Mutagenesis, 531: 37–80, 2003.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram
quanties of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 7:
248–254, 1976.
BRATTON, D. L.; FADOK, V. A.; RICHTER, D. A.; KAILEY, J. M.; GUTHRIE, L. A.;
HENSON, P.M. Appearance of phosphatidylserine on apoptotic cells requires
calciummediated nonspecific flip-flop and is enhanced by loss of the
aminophospholipid translocase. Journal of Biological Chemistry, 272(42): 26159–
26165, 1997.
BRUNNER, T., WASEM, C., TORGLER, R., CIMA, I., JAKOB, S., & CORAZZA, N.
Fas (CD95/Apo-1) ligand regulation in T cell homeostasis, cell-mediated cytotoxicity
and immune pathology. Seminars in Immunology, 15(3): 167–176, 2003.
CHENG, H.; XIA, B.; GUO, Q.S.; ZHANG, L.; WANG, F.; JIANG, L.; WANG, Z.L.;
ZHANG, Y.X.; LI, C. Sinomenine attenuates 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid-
induced colitis in mice. International Immunopharmacology, 7: 604–611, 2007.
COLLINO, M.; ARAGNO, M.; MASTROCOLA, R.; GALLICCHIO, M.; ROSA, A.C.;
DIANZANI, C.; DANNI, O.; THIEMERMANN, C.; FANTOZZI, R. Modulation of the
oxidative stress and inflammatory response by PPAR-gamma agonists in the
hippocampus of rats exposed to cerebral ischemia/reperfusion. European of
Journal Pharmacology, 530: 70–80, 2006.
CONNELL, W.R.; LENNARD-JONES, J.E.; TALBOT, I.C. et al. Low grade dysplasia
is an important predictive marker of malignancy or high grade dysplasia in ulcerative
colitis. Gastroenterology, 106: A667, 1996.
DAS, U.N. Critical advances in septicemia and septic shock. Crit Care Med, 4: 290-
296, 2000.
DIAS, E.S.; ABE, C.; SCHAWN, R.F. Truths and miths about the mushroom Agaricus
blazei. Sci Agric., 61 (5): 545-549, 2004.
DIPIRO, J.T.; TALBERT, R.L.; YEE, G.C.; MATZKE, G.R.; WELLS, B.G.; POSEY,
L.M. In: Pharmacotherapy, A Pathophysiologic Approach. fifth ed. The McGraw-
Hill companies, 2002. pp. 625–369.
DOMBAL, F.T. Ulcerative colitis: epidemiology and aetiology, course and prognosis.
Br Med J, 1:649–650, 1971.
DONNELLY, E.T.; BARDWELL, H.; THOMAS, G.A. et al. Metallothionein crypt-
restricted immunopositivity indices (MTCRII) correlate with aberrant crypt foci (ACF)
in mouse colon. Br J Cancer, 92: 2160-65, 2005.
EADEN, J.A.; ABRAMS, K.R.; MAYBERRY, J.F. The risk of colorectal cancer in
ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut, 48:526–535, 2001.
EKBOM, A.; HELMICK, C.; ZACK, M.; ADAMI, H.O. Ulcerative colitis and colorectal
cancer. A population-based study. N Engl J Med., 323:1228 –1233, 1990.
FANG, J.; WANG, Y.; LV, X.; SHEN, X.; NI, X.; DING, K. Structure of the β-glucan
from Grifola frondosa and its antitumor effect by activating dectin-1/Syk/NF-κB
signaling. Glycoconjugate J., 29: 365–377, 2012.
FARBER, E. Cell proliferation as a major risk factor for cancer: a concept of doubtful
validity. Cancer Res, 55: 3759-62, 1995.
FAUCI , A.S.; BRAUNWALD, E.; KASPER, D.L.; HAUSER, S.L. Harrison´s Principles
of internal medicine. McGraw Hill, 2008.
FIOCCHI, C. Genetics of IBD: impact on immune function. In: Willians CN, editor.
Trends in inflammatory bowel disease therapy 1999. Dordrecht: Kluwer Academic
Publisher; 2000. p.23-35.
GEBOES, K.; RIDDELL, R.; OST, A.; JENSFELT, B.; PERSSON, T.; LOFBERG, R.
A reproducible grading scale for histological assessment of inflammation in ulcerative
colitis. Gut, 47:404–9, 2000.
GHOSH, K.; CHANDRA, K.; OJHA, A.K.; ISLAM, S.S. NMR and MALDI-TOF
analysis of the water-soluble glucan from an edible mushroom, Volvarielladiplasia.
Carbohyd. Res., 343: 2834–2840, 2008.
GREENSTEIN, A.J.; SACHAR, D.B.; SMITH, H.; PUCILLO, A.; PAPATESTAS, A.E.;
KREEL, I.; GELLER, S.A.; JANOWITZ, H.D.; AUFSES, A.H.JR. Cancer in universal
and left-sided ulcerative colitis: factors determining risk. Gastroenterology, 77:290 –
294, 1979.
HAN, S.B.; LEE, C.W.; JEON, Y,J. et al. The inhibitory effect of polysaccharides
isolated from Phellinus linteus on tumor growth and metastasis.
Immunopharmacology. 41(2):157–164, 1999.
HAN, W.K.; LAW, H.K.; LIN, Z.B.; LAU, Y.L;, CHAN, G.C. Response of human
dendritic cells to different immunomodulatory polysaccharides derived from
mushroom and barley. Int Immunol , 19(7):891-899, 2007.
HANAHAN, D.; WEINBERG, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell,
144(5): 646–674, 2011.
HARMAN, D. Role of free radicals in aging and disease. Annals of the New York
Academy of Sciences, 673, 126–141, 1992.
HAWIGHORST, T.; VELASCO, P.; STREIT, M.; HONG, Y.K.; KYRIAKIDES, T.R.;
BROWN, L.F.; BORNSTEIN, P.; DETMAR, M.. Thrombospondin-2 plays a protective
role in multistep carcinogenesis: a novel host anti-tumor defense mechanism. EMBO
J., 20: 2631–2640, 2001.
HAWKSWORTH, D.L. The magnitude of fungal diversity: The 1,5 million species
estimate revised. Mycological Research, 105: 1422-1432, 2001.
HERRE, J.; MARSHALL, A.J.; CARON, E.; EDWARDS, A.D.; WILLIAMS, D.L.;
SCHWEIGHOFFER, E.; et al. Dectin-1 utilizes novel mechanisms for yeast
phagocytosis in macrophages. Blood, 104: 4038–4045, 2004.
HEUSCHEN, U.A.; HINZ, U.; ALLEMEYER, E.H.; STERN, J.; LUCAS, M.;
AUTSCHBACH, F.; HERFARTH, C.; HEUSCHEN, G. Backwash ileitis is strongly
associated with colorectal carcinoma in ulcerative colitis. Gastroenterology,
120:841– 847, 2001.
HIBI, T.; OGATA, H.; SAKURABA, A. Animal models of inflammatory bowel disease.
J. Gastroenterol. 37:409–41, 2002.
HOFFMANN, J.C.; PAWLOWSKI, N.N.; KUHL, A.A.; HOHNE, W.; ZEITZ, M., Animal
models of inflammatory bowel disease: an overview. Pathobiology. 70: 121–130,
2002.
HSIAO, Y.C.; HSIEH, Y.S.; KUO, W.H.; CHIOU, H.L.; YANG, S.F.; CHIANG, W.L.;
CHU, S.C. The tumor-growth inhibitory activity of flavanone and 2-OH flavanone in
vitro and in vivo through induction of cell cycle arrest and suppression of cyclins and
CDKs. Journal of Biomedical Science, 14: 107–119, 2007.
HUANG, Q.; ZHANG, L.; CHEUNG, P.C.K.; TAN, X. Evaluation of sulfated α-glucans
from Poria cocos mycelia as potential antitumor agent. Carbohydrate Polymers,
64(2): 337-344, 2006.
HUANG, T.; LIN, J.; CAO, J.; ZHANG PY.; BAI YG.; CHEN GC.; CHEN KS. An
exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii and its apoptotic activity on
human leukemia K562 cells. Carbohydrate Polymers, 89(2): 701-708, 2012.
HUANG, X.; LV, B.; JIN, H.F.; ZHANG, S. A meta-analysis of the therapeutic effects
of tumor necrosis factor-alpha blockers on ulcerative colitis. Eur J Clin Pharmacol,
67:759–66, 2011.
HUGOT, J.P.; CHAMAILLARD, M.; ZOUALI, H.; LESAGE, S.; CÉZARD, J.P.;
BELAICHE, J.; ALMER, S.; TYSK, C.; O'MORAIN,GASSULL, M.; VIBEKE, B.;
FINKEL, Y.; CORTOR, A. Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with
susceptibility to Crohn's disease. Nature, 411:599-603, 2001.
HYNES, R.O. Integrins: a family of cell surface receptors. Cell, 48: 549-554, 1987.
HYNES, R.O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell,
69: 11-25, 1992.
HYNES, R.O. The impact of Molecular Biology on Models for cell Adhesion.
BioEssays, 16(9):663-669, 1994.
INOUE, S.; MATSUMOTO, T.; IIDA, M.; MIZUNO, M.; KUROKI, F.; HOSHIKA, K.; et
al. Characterization of cytokine expression in the rectal mucosa of ulcerative colitis:
correlation with disease activity. Am J Gastroenterol, 94:2441–6, 1999.
ISHIGURO, K.; ANDO, T.; MAEDA, O.; WATANABE, O.; GOTO, H. Novel mouse
model of colitis characterized by hapten-protein visualization. Biotechniques,
49:641–648, 2010.
ITZKOWITZ, S.H.; YIO, X. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: the role
of inflammation. Am J Physiol, 287: 7-17, 2004.
JEONG, S.C.; JEONG, S.C.; YANG, B.K.; RA, K.S.; WILSON, M.A.; CHO, Y.; GU,
Y.A.; SONG, C.H. Chracteristics of anti-complementary biopolymer extracted from
Coriolus versicolos. Carbohydrates Polymers 35: 255-263, 2004.
JEWELL, D.P. Ulcerative colitis. In: Feldman M, Scharschmidt BF, Sleisenger MH.
6th edition. Philadelphia, WB SaundersCo. 1998.
JUAN, M. E.; WENZEL, U.; DANIEL, H.; PLANAS, J.M. Resveratrol induces
apoptosis through ROS-dependent mitochondria pathway in HT-29 human colorectal
carcinoma cells. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 56: 4813–481, 2008.
JUNG, Y.; KIM, H.H.; KIM, H.; KONG, H.; CHOI, B.; YANG, Y.; KIM, Y. Evaluation of
5-aminosalicyltaurine as a colon-specific prodrug of 5-aminosalicylic acid for
treatment of experimental colitis. Eur. J. Pharm. Sci., 28: 26–33, 2006.
KAMADA, N.; HISAMATSU, T.; OKAMOTO, S.; SATO, T.; MATSUOKA, K.; ARAI, K.
et al. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in
Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in
response to bacteria. J Immunol., 175:6900–8, 2005.
KAMPEN, C.V.; GAULDIE, J.; COLLINS, S.M. Proinflammatory proprieties of IL-4 in
the intestinal microenvironment. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 288:
111–7, 2005.
KARLEN, P.; KORNFELD, D.; BROSTROM, O.; LOFBERG, R.; PERSSON, P.G.;
EKBOM, A. Is colonoscopic surveillance reducing colorectal cancer mortality in
ulcerative colitis? A population based case control study. Gut, 42:711–714, 1998.
KASER, A.; ZEISSIG, S.; BLUMBERG, R.S. Inflammatory bowel disease. Annu Rev
Immunol, 28:573-621, 2010.
KIHO, T.; YOSHIDA, I.; NAGAI, K.; UKAI, S.; HARA, C. (1–3)-alpha-D-glucan from
an alkaline extract of Agrocybe cylindracea, and antitumor activity of its O-
(carboxymethyl)ated derivatives. Carbohydr. Res., 189: 273–279, 1989.
KIM, G.Y.; OH, Y.H.; PARK, Y.M. Acidic polysaccharide isolated from Phellinus
linteus induces nitric oxide-mediated tumoricidal activity of macrophages through
protein tyrosine kinase and protein kinase C. Biochem Biophys Res Commun.,
309(2):399–407, 2003.
KIM, G.Y.; ROH, S.I.; PARK, S.K.; AHN, S.C.; OH, Y.H.; LEE, J.D.; PARK, Y.M.
Alleviation of experimental septic shock in mice by acidic polysaccharide isolated
from the medicinal mushroom Phellinus linteus. Biological and Pharmaceutical
Bulletin, 26(10): 1418-1423, 2003.
KIM, S.H.; TURNBULL, J.; GUIMOND, S. Extracellular matrix and cell signalling: the
dynamic cooperation of integrin, proteoglycan and growth factor receptor. J
Endocrinol, 209:139–51, 2011.
KIRSNER, J.B. Inflammatory Bowel Disease. 5ª Edição, W.B.Saunders Company;
2000.
KLEINMAN, H.K.; MCGARVEY, M.L.; HASSELL, J.R.; STAR, V.L.; CANNON, F.B.;
LAURIE, G.W.; MARTIN, G.R. Basement membrane complexes with biological
activity. Biochemistry, 25: 312–318, 1986.
KODAMA, N.; KOMUTA, K.; NANBA, H. Can maitake MD-fraction aid cancer
patients? Altern. Med. Rev. 7, 236–239, 2002.
KORNFELD, D.; EKBOM, A.; IHRE, T. Is there an excess risk for colorectal cancer
in patients with ulcerative colitis and concomitant primary sclerosing cholangitis? A
population based study. Gut, 41: 522-25, 1997.
KRAMER, R.H.; MCDONALD, K.A.; CROWLEY, E.; RAMOS, D.M.; DAMSKY, C.H.
Melanoma cell adhesion to basement membrane mediated by integrin-related
complexes. Cancer Res., 49: 393–402, 1989.
KRAWISZ, J.E.; SHARON, P.; STENSON, W.F. Quantitative assay for acute
intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Gastroenterology, 87:
1344–50, 1984.
KRCMAR, P.; NOVOTNY, C.; MARAIS, M.F.; JOSELEAU, J.P. Structure of
extracellular polysaccharide produced by lignin-degrading fungus Phlebia radiata in
liquid culture. Int J Biol Macromol, 24: 61–64, 1999.
KUHN, R.; LOHLER, J.; RENNICK, D.; RAJEWSKY, K.; MULLER, W. Interleukin-10-
deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell, 75: 263-274., 1993.
LASHNER, B.A.; HEIDENREICH, P.A.; SU, G.L.; KANE, S.V.; HANAUER, S.B.
Effect of folate supplementation on the incidence of dysplasia and cancer in chronic
ulcerative colitis. A case-control study. Gastroenterology, 97:255–259,1989.
LASHNER, B.A. Risk factors for small bowel cancer in Crohn's disease. Digest Dis
Sci, 37: 1179-1184, 1992.
LEWIS, J.D.; DEREN, J.J.; LICHTENSTEIN, G.R. Cancer risk in patients with
inflammatory bowel disease. Gastroenterol Clin North Am , 28:459-77, 1999.
LEY, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9:263–
268, 2003.
LI, G.; KIM, D.H.; KIM, T.D.; PARK, B.J.; PARK, H.D.; PARK, J.I.; NA, M.K.; KIM,
H.C.; HONG, N.D.; LIM, K.; HWANG, B.D.; YOON, W.H. Protein-bound
polysaccharide from Phellinus linteus induces G2/M phase arrest and apoptosis in
SW480 human colon cancer cells. Cancer Lett., 216: 175–181, 2004.
LIN, Y.L.; LIANG, Y.C.; LEE, S.S.; CHIANG, B.L. Polysaccharide purified from
Ganoderma lucidum induced activation and maturation of human monocyte-derived
dendritic cells by the NF-kappaB and p38 mitogen-activated protein kinase pathways.
J Leukoc Biol, 78(2):533-543, 2005.
LIU, D.Y.; GUAN, Y.M.; ZHAO, H.M.; YAN, D.M.; TONG, W.T.; WAN, P.T.; ZHU,
W.F.; LIU, H.N.; LIANG, X.L. The protective and healing effects of Si Shen Wan in
trinitrobenzene sulphonic acid-induced colitis. J Ethnopharmacol., 143(2): 435-40,
2012.
LOWE, S.W.; LIN, A.W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis, 21: 485–495, 2000.
MA, L.; CHEN, H.; ZHU, W.; WANG, Z. Effect of different drying methods on
physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides extracted
from mushroom Inonotus obliquus. Food Research International, 50(2): 633-640,
2013.
MACKAI, I.R.; ROSEN, F.S. T-cell function and migration. The New England
Journal of Medicine, 343: 1020-1034, 2000.
MASUDA, H.; IWAI, S.; TANAKA, T.; HAYAKAWA, S. Expression of IL-8, TNF-alpha
and IFN-gamma m-RNA in ulcerative colitis, particularly in patients with inactive
phase. J Clin Lab Immunol, 46:111–23, 1995.
MISHRA, S.K., KANG, J.; KIM, D.; OH, S.H.; KIM, M.K. Orally administered aqueous
extract of Inonotus obliquus ameliorates acute inflammation in dextran sulfate sodium
(DSS)-induced colitis in mice. Journal of Ethnopharmacology, 143(2): 524-532,
2012.
MODA, E.M.; SPOTO, M.H.F.; HORII, J.; ZOCHI, S.S. Uso de peróxido de
hidrogênio e ácido cítrico na conservação de cogumelos Pleurotus sajor-caju in
natura. Ciênc Tecnol Aliment , 25(2): 291- 296, 2005.
MOHSEN, M.; ALIREZA, G.; PARVIN, M.; ELHAM, J.S. Comparative study of
Berberis vulgaris fruit extract and Berberine chloride effects on acetic acid induced
colitis in rats. Iranian J Pharm Res, 10(1): 97-104, 2011.
MORRIS, G.P.; BECK, P.L.; HERRIDGE, M.S.; DEPEW, W.T.; SZEWCZUK, M.R.;
WALLACE, J.L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the
rat colon. Gastroenterology, 96(3):795–803, 1989.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, 65:
55–63, 1983.
NELSON, D. L.; COX, M. M.; Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed., New
York: Worth Publishers, 2000, cap. 9.
NUAKO, K.W.; AHLQUIST, D.A.; MAHONEY, D.W.; SCHAID, D.J.; SIEMS, D.M.;
LINDOR, N.M. Familial predisposition for colorectal cancer in chronic ulcerative
colitis: a case-control study. Gastroenterology, 115:1079 –1083, 1998.
OLIVEIRA, R.J.; RIBEIRO, L.R.; DA SILVA, A.F.; MATUO, R.; MANTOVANI, M.S.
Evaluation of antimutagenic activity and mechanisms of action of beta-glucan from
barley, in CHO-k1 and HTC cell lines using the micronucleus test. Toxicol In Vitro.,
20(7):1225-33, 2006.
PADILHA, M.M.; AVILA, A.A.; SOUSA, P.J.; CARDOSO, L.G.; PERAZZO, F.F;
CARVALHO, J.C. Anti-inflammatory activity of aqueous and alkaline extracts from
mushrooms (Agaricus blazei Murill). J Med Food., 12(2):359-64, 2009.
PANJA, A.; GOLDBERG, S.; ECKMANN, L. et al. The regulation and functional
consequence of proinflammatory cytokine binding on human intestinal epithelial cells.
J Immunol, 161: 3675-84, 1998.
PATEL, H.R.; TAIT, I.S.; EVANS, G.S. et al. Influence of cell interactions in a novel
model of postnatal mucosal regeneration. Gut, 38: 679-86, 1996.
PAVLICK, K.P.; LAROUX, F.S.; FUSELER, J.; WOLF, R.E.; GRAY, L.; HOFFMAN,
J.; GRISHAM, M.B. Role of reactive metabolites of oxygen and nitrogen in
inflammatory bowel disease. Free Radical Biology and Medicine, 33: 311–32,
2002.
PECCHI, E.; DALLAPORTA, M.; JEAN, A.; THIRION, S.; TROADEC, J.D.
Prostaglandins and sickness behavior: old story, new insights. Physiology &
Behavior, 97:279–292, 2009.
PERWEZ HUSSAIN, S.; HARRIS, C.C. Inflammation and cancer: an ancient link with
novel potentials. Int J Cancer, 121: 2373-80, 2007.
PINCZOWSKI, D.; EKBOM, A.; BARON, J.; YUEN, J.; ADAMI, H.O. Risk factors for
colorectal cancer in patients with ulcerative colitis: a casecontrol study.
Gastroenterology, 107:117–120, 1994.
PLAYFORD, M.P.; SCHALLER, M.D. The interplay between Src and integrins in
normal and tumor biology. Oncogene, 23: 7928– 46, 2004.
POPOV, S.V.; POPOVA, G.Y.; OVODOVA, R.G.; BUSHNEVA, O.A.; OVODOV, Y.S.
Effects of polysaccharide from Silene vulgaria on phagocytes. Int. J.
Immunopharmacol., 21: 617-624, 1999.
POTTEN, C.S. Regeneration in epithelial proliferative units as exemplificated by
small intestinal crypts. Ciba Found Symp, 160: 54-71, 1991.
RANG, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M.; MOORE, P. K. Farmacologia. 5. ed. Rio
de Janeiro: Elsevier, 2004. 904 p.
RIBEIRO, M.B. GREENSTEIN AJ, HEIMANN TM, et al. Adenocarcinoma of the small
intestine in Crohn's disease. Surg Gynecol Obst, 173: 343-349, 1991.
ROSS, G. D.; VÌ; TVIÈKA, V.; YAN, J.; XIA, Y.; VÌ TVIÈKOVÁ, J. Therapeutic
intervention with complement and ß-glucan in cancer (Review).
Immunopharmacology, 42: 61-74, 1999.
ROY, P.K.; RASHID, F.; BRAGG, J.; IBDAH, J.A. Role of the JNK signal transduction
pathway in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology,
14:200–202, 2008.
RUTGEERTS, P.; SANDBORN, W.J.; FEAGAN, B.G.; REINISCH, W.; OLSON, A.;
JOHANNS, J.; et al. Infliximab for induction and maintenance therapy for ulcerative
colitis. N Engl J Med, 353:2462–76, 2005.
RUTTER, M.; SAUNDERS, B.; WILKINSON, K.; RUMBLES, S.; SCHOfiELD, G.;
KAMM, M.; WILLIAMS, C.; PRICE, A.; TALBOT, I.; FORBES, A. Severity of
inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis.
Gastroenterology, 126:451– 459, 2004.
SANTELL, R.M.; GAMMOM, T.E.R.R.M.; SENIE, R.; SHEN, J.; KENNEDY, D.;
AGRAWAL, M.; FARAGLIA, B.; ZHANG, F. DNA adducts, DNA repair
genotype/phenotype and cancer risk. Mutat Res., 592: 29–35, 2005.
SHETTY, K.; RYBICKI, L.; BRZEZINSKI, A.; CAREY, W.D.; LASHNER, B.A. The
risk for cancer or dysplasia in ulcerative colitis patients with primary sclerosing
cholangitis. Am J Gastroenterol, 94:1643–1649, 1999.
SILVA, M. L. C; MARTINEZ, P.F.; IZELI, N.L.; SILVA, I.R.; VASCONCELOS, A.F.D.;
et al. Chemical characterization and biotechnology applications of fungal glucans.
Química Nova, 29: 85-92, 2006.
SILVA, D.; LOGANATHAN, J.; JIANG, J.; JEDINAK, A.; LAMB, J.G.; TERRY, C.;
BALDRIDGE, L.A.; ADAMEC, J.; SANDUSKY, G.E.; DUDHGAONKAR, S.
Mushroom Ganoderma lucidum Prevents Colitis-Associated Carcinogenesis in Mice.
pLOS oNE, 7(10): 1-13, 2012.
SINGH, V.P.; PATIL, C.S.; JAIN, N.K.; SINGH, A.; KULKARNI, S.K. Effect of
nimesulide on acetic-acid and leukotriene-induced inflammatory bowel disease in
rats. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 71: 163-75, 2003.
SMITH, P.K.; KROHN, R.I.; HERMANSON, G.T.; MALLIA, A.K.; GARTNER, F.H.;
PROVENZANO, M.D.; FUJIMOTO, E.K.; GOEKE, N.M.; OLSON, B.J.; KLENK, D.C.
Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem., 150: 76–85, 1985.
SOCCA, E.A.R.; LUIZ-FERREIRA, A.; FARIA, F.M.; ALMEIDA, A.C.; DUNDER, R.J.;
MANZO, L.P.; BRITO, A.R.M.S. Inhibition of tumor necrosis factor-alpha and
cyclooxigenase-2 by Isatin: A molecular mechanism of protection against TNBS-
induced colitis in rats. Chemico-Biological Interactions, 209: 48–55, 2014.
STALLMACH, A.; HAGEL, S.; BRUNS, T. Adverse effects of biologics used for
treating IBD. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 24: 167-182, 2010.
STEIDLER, L.; HANS, W.; SCHOTTE, L.; NEIRYNCK, S.; OBERMEIER, F.; FIERS,
W.; REMAUT, E. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting
interleukin-10. Science, 289(5483):1352-1355, 2000.
TOZAKI, H.; ODORIBA, T.; OKADA, N.; FUJITA, T.; TERABE, A.; SUZUKI, T.;
OKABE, S.; MURANSHI, S.; YAMAMOTO, A. Chitosan capsules for colon-specific
drug delivery: enhanced localization of 5-aminosalicylic Acid in the large intestine
accelerates healing of TNBS-induced Colitis in rats. J.Control. Release, 82:51–6,
2002.
TROSKO, J.E. The role of stem cells and gap junctional Intercellular communication
in carcinogenesis. J Biochem Mol Biol., 36: 43–48, 2003.
TSIKITIS, V.L.; MORIN, N.A.; HARRINGTON, E.O.; ALBINA, J.E.; REICHNER, J.S.
The lectin-like domain of complement receptor 3 protects endothelial barrier function
from activated neutrophils. J Immunol, 173: 1284–1291, 2004.
TUBIANA, M. Géneralités sur la cancérigenèse. C. R. Biol. 331, p.114-125,2008.
VADIVELOO, P.K.; VAIRO, G.; HERTZOG, P.; KOLA, I.; HAMILTON, J.A. Role of
type I interferons during macrophage activation by lipopolysaccharide. Cytokine,
12(11): 1639-1646, 2000.
VON ANDRIAN, U.H.; MACKAY, C.R. T-cell function and migration. Two sides of the
same coin. N Engl J Med, 343: 1020-1034, 2000.
WHITTAKER, R.H. New concepts of kingdoms of organisms. Science, 63: 150 -160,
1969.
WING, E.D.; REMINGTON, J.S. In: Basic and Clinical Immunology. Los Altos,
Lange, p. 129-143, 1980.
YUAN, C.; HUANG, X.; CHENG, L.; BU, Y.; LIU, G.; YI, F.; YANG, Z.; SONG, F.
Evaluation of antioxidant and immune activity of Phellinus ribis glucan in mice. Food
Chemistry,115(2): 581-584, 2009.
ZHONG, S.; JI, D.F.; LI, Y.G.; LIN, T.B.; LV, Z.Q.; CHEN, H.P. Activation of P27kip1-
cyclin D1/E-CDK2 pathway by polysaccharide from Phellinus linteus leads to S-
phase arrest in HT-29 cells. Chemico-Biological Interactions, 206: 222–229, 2013.
ZHOU, Y.H.; YU, J.P.; LIU, Y.F.; TENG, X.J.; MING, M.; LV, P.; AN, P.; LIU, S.Q.;
YU, H.G. Effects of GinKgo biloba extract on inflammatory mediators (SOD, MDA,
TNF-a ,NF-kBp65, IL-6 in TNBS-induced colitis in rats. Mediators Inflammatory, 5:
926-42 2006.
ZHU, M.; NIE, P.; LIANG, Y.; WANG, B. Optimizing conditions of polysaccharide
extraction from Shiitake mushroom using response surface methodology and its
regulating lipid metabolism. Carbohydrate Polymers, 95 (2): 644-648, 2013.
ZIMMERMAN, J.W.; LINDERMUTH, J.; FISH, P.A.; PALACE, G.P.; STEVENSON,
T.T.; DEMONG, D.E. A novel carbohydrate-glycosphingolipid interaction between a
beta-(1-3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human
leukocytes, J Biol Chem., 273(34):22014-20, 1998.