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1.- CROMATOGRAFÍA
Los componentes básicos de la cromatografía son la muestra, la fase móvil y la fase estacionaria.
• Muestra. Es la mezcla que se pretende cromatografiar.
• Fase móvil. Está formada por el eluyente que se desplaza a través de la fase estacionaria
arrastrando los componentes de la muestra. El eluyente suele ser un disolvente, o mezcla de
disolventes, en el cual se ha disuelto la muestra y su función es ayudar a movilizar la muestra y a
separar sus componentes. Puede ser un líquido o un gas y su polaridad es variable, pueden ser
acuosos (agua, etanol, propanol, mezcla de alcoholes) o hidrófobos (acetonitrilo, cloroformo,
ciclohexano, tetracloruro de carbono).
• Fase estacionaria. Forma la parte fija del sistema. Esta fase retrasa, de forma diferencial, el
movimiento de los diferentes componentes de la fase móvil; es decir, algunos componentes
quedarán más retenidos que otros en esta fase estacionaria de forma que se irán separando unos
de otros en su desplazamiento. La fase estacionaria puede ser un sólido (como, por ejemplo, un
soporte de papel), o un líquido soportado en un sólido o en un gel. También puede ser una
columna de vidrio o de plástico de dimensiones variables y repletas de una resina o matriz sobre la
cual se moverá en el tiempo la fase móvil
Figura 1
Figura 2
1.3.- CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Las separaciones cromatográficas pueden clasificarse atendiendo a tres criterios clasificadores:
según el método de contacto entre las fases móvil y estacionaria, según el estado físico de estas
fases y según los mecanismos físicos de separación.
- Según el método de contacto (o forma en que las fases -móvil y estacionaria- se ponen en
contacto), la cromatografía puede ser:
Cromatografía plana. La fase estacionaria se mantiene sobre una placa lisa (de vidrio, metal o
plástico), o impregnando un soporte plano de papel. Durante el proceso cromatográfico la fase
estacionaria se pone en contacto con la fase móvil y ésta se desplaza a través de ella por
capilaridad o por gravedad.
Cromatografía en columna. La fase estacionaria se encuentra en el interior de un tubo -
normalmente de fino calibre- a través del cual se hace pasar la fase móvil mediante presión o
simplemente por acción de la gravedad.
- En función del estado físico de las fases móvil y estacionaria, puede distinguirse
entre: Cromatografía de líquidos. Se puede realizar sobre soporte plano o sobre
columnas. Cromatografía de gases. Siempre se lleva a cabo en columnas.
Adsorción: un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidos en la superficie de un material.
Elución: extracción mediante un líquido apropiado de una sustancia del medio sólido que la ha absorbido.
1.4.- TIPOS DE CROMATOGRAFÍA SEGÚN EL MECANISMO DE SEPARACIÓN
La separación de sustancias está basada en las interacciones que se producen entre las moléculas
del soluto y de la fase móvil con las moléculas de la fase sólida estacionaria. Estas interacciones
pueden ser de tipo electrostático, puentes de hidrógeno o fuerzas de van der Waals.
La fase móvil puede ser un líquido o un gas, mientras que la fase estacionaria es siempre un
sólido. Es un fenómeno de superficie que se manifiesta por el aumento de la concentración del
soluto en la interfase que rodea a la fase estacionaria, sobre la superficie del sólido o adsorbente.
La adsorción está basada en la diferencia de polaridad entre las moléculas de la mezcla y el
adsorbente. Los compuestos con mayor afinidad por el adsorbente serán retenidos con mayor
fuerza y se desplazarán poco respecto al punto inicial de referencia donde es colocada la muestra,
mientras que los compuestos adsorbidos con menor intensidad se desplazarán a mayor distancia,
ocupando cada sustancia una posición bien definida y bien separada de las demás.
Como sustancias adsorbentes podemos citar, entre otras, el teflón (no polar), el gel de sílice
(ácido), el óxido de aluminio o alúmina (básico) y el carbonato cálcico (básico).
Figura 4
Los materiales empleados como fase estacionaria son el almidón y la celulosa con un líquido como
el agua o el amoníaco. Como fase móvil se emplea normalmente un líquido, por supuesto no
miscible con el primero, tal como el butanol, el benceno y otros.
Figura 5.
Cromatografía de
reparto o partición
Figura 7
La cromatografía de cambio de ión o de intercambio iónico es conocida por las siglas IEC (Ion
Exchange Chromatography). El principio básico se apoya en que las moléculas de soluto llevan
iones intercambiables con otros iones, situados en las fases estacionaria y móvil y con afinidad
distinta por cada una de ellas. Por tanto, las sustancias se separan debido a las interacciones que
se producen entre los grupos ionizables de los compuestos que quieren separase y los grupos
cargados unidos a un soporte sólido inerte.
La presencia de grupos funcionales cargados eléctricamente es la propiedad fundamental del
intercambiador iónico, también llamados cambiadores o resinas. Pueden ser de intercambio
aniónico (separan aniones) o de intercambio catiónico (separan cationes).
Este tipo de cromatografía se suele realizar en columnas en las que se encuentra empaquetada la
fase sólida estacionaria que es la resina de intercambio iónico. La fase móvil es un líquido. Una de
las aplicaciones de las resinas de intercambio iónico es la preparación de agua desionizada.
Figura 8
- Cromatografía de intercambio aniónico. Fija aniones y, por tanto, la resina debe estar cargada
positivamente, como por ejemplo, la DEAE (dietil amino etil-celulosa). Los componentes con carga
positiva se eluirán y los de carga negativa quedarán fijados. Para recuperarlos, se hace pasar a su
través una solución ácida diluida, como, por ejemplo, el HCl 0,001 N o tampón citrato. Si la
sustancia que se quiere separar tiene carga positiva, la recuperaremos a la salida de la columna en
un recipiente adecuado, regenerando al mismo tiempo la columna para un nuevo uso.
- Cromatografía de intercambio catiónico. Fija cationes (iones de carga positiva), por lo que la
resina debe estar cargada negativamente, como la CM (carboximetil-celulosa). Los componentes
con carga negativa se eluirán y los de carga positiva quedarán fijados. Para recuperarlos se hace
pasar a su través una disolución básica diluida, como NaOH 0,001 N o tampón TRIS. Una
sustancia de carga negativa será recuperada a la salida de la columna en un recipiente adecuado,
regenerando al mismo tiempo la columna que quedará lista para un nuevo uso.
HCl
Figura 9
NaOH
Figura 10
1.4.5.- DE AFINIDAD.
La cromatografía de afinidad se utiliza para separar las sustancias con interacciones biológicas
muy específicas, y se basan en mecanismos que implican la afinidad entre dos elementos, como,
por ejemplo, las uniones enzima-sustrato, hormona-receptor, antígeno-anticuerpo, entre otras.
En este tipo de cromatografía, el compuesto que quiere separarse se une con un adsorbente que
lleva una sustancia llamada aquí ligando, que interacciona bioespecíficamente con un componente
de la superficie del compuesto a separar. Generalmente, el ligando está contenido en una columna
cromatográfica, aunque también puede encontrarse en disolución. Por tanto, la fase estacionaria es
un sólido que contiene unido el ligando y la fase móvil es un líquido que atraviesa la fase
estacionaria transportando la muestra con la sustancia a determinar.
Para realizar la cromatografía se añade la fase móvil y la mezcla que contiene la sustancia que se
desea separar. Cuando transcurre a través de la fase estacionaria la fase móvil con los productos a
separar, aquellos que presenten afinidad por el ligando de la fase estacionaria quedarán unidos a
este y retenidos en la columna. El resto de las sustancias no afines al ligando no serán retenidos
en la columna. Luego, se consigue la elución de los productos retenidos añadiendo pasando un
ligando distinto al anclado en la columna por el que la sustancia tenga mayor afinidad, o bien
cambiando las condiciones físico-químicas (pH, fuerza iónica) de la fase móvil.
No se requiere un equipo demasiado complicado ni caro y el tipo de adsorbente se puede utilizar
repetidas veces. Las aplicaciones más usadas de la cromatografía de afinidad en los laboratorios
de bioquímica clínica son la separación de la hemoglobina glicosilada y de las catecolaminas,
Figura 11
Figura 12
1.5.- TIPOS DE CROMATOGRAFÍA SEGÚN EL MÉTODO DE CONTACTO ENTRE LAS FASES
En la cromatografía en columna, la fase estacionaria está formada por una columna de vidrio
(similar a una bureta) que se encuentra rellena de gel de sílice, óxido de magnesio, óxido de
aluminio, arena u otro material poroso. La muestra es colocada en la parte superior de la columna.
Las sucesivas adiciones de fase móvil (eluyente) hacen descender por la columna las moléculas de
la muestra, permitiendo su separación.
Los componentes de la mezcla saldrán de la columna ordenadamente en función de la retención
que ejerza sobre ellos la fase estacionaria, saliendo primero los que queden menos retenidos y
desciendan más rápidamente, lo que depende de factores como su polaridad, su masa molecular,
etc. Las diferentes fracciones individuales que van saliendo por la apertura inferior de la columna
se recogen individualmente en tubos separados y son detectadas por un detector.
Figura 13
- Procedimiento de separación cromatográfica en columna.
Consideremos que pretendemos lograr la separación de dos elementos (1 y 2) de una disolución.
El tubo contiene la fase estacionaria así como también una pequeña porción de espacio adicional
en su extremo superior que permanece vacío y que se destina a contener la fase móvil. El
instrumento tiene una llave de paso en su extremo inferior que permite la regulación del flujo de
fase móvil que se desliza a lo largo y por el interior del tubo. La fase estacionaria pueden ser
sustancias adsorbentes como el silica-gel o la alumina. La fase móvil suele ser algún tipo de
eluyente que disuelve a la muestra sin reaccionar con ella. Los pasos del procedimiento son:
1º. Antes de adicionar la muestra, se abre la llave de paso, por poco tiempo, para que un pequeño
volumen de fase móvil, que se coloca previamente en el extremo superior, drene por la columna.
2º. Se disuelve la muestra en un volumen mínimo de fase móvil y se deposita en el extremo
superior de la columna.
3º. Se abre de nuevo, brevemente, la llave de paso, consiguiendo que la pequeña porción de fase
móvil que contiene la muestra se deslice a lo largo de la columna. En este momento, el soluto
(elementos 1 y 2 de la muestra) se distribuye ya entre la fase estacionaria (adsorbente) y la
solución compuesta por la fase móvil y la muestra, en unas proporciones determinadas.
Supongamos que el componente 2 se adsorbe con mayor fuerza que el componente 1.
4º.- Se añade un cierto volumen de fase móvil a la columna que actúa como eluyente. Se abre de
nuevo la llave de paso manteniendo un flujo constante a lo largo de la columna (en mL/minuto).
5º.- Las diferentes fracciones individuales que van saliendo de la columna van siendo detectadas
(mediante un sistema de detección adecuado), o recogidas independientemente.
Manteniendo constante el flujo, se puede analizar cada gota que emerja por el extremo inferior
de la columna y comprobar si contiene soluto, utilizando unos detectores electrónicos especiales
que emiten una señal de salida, de intensidad proporcional a la cantidad de soluto detectado.
Figura 14
Mediante los detectores se obtiene una gráfica llamada cromatograma, donde aparecen una serie
de picos que se corresponden con los tiempos de retención, que son los tiempos que ha tardado en
eluir cada componente de la muestra. El tiempo de retención es característico de cada sustancia,
por lo que se usa para su identificación (análisis cualitativo) y para su cuantificación (análisis
cuantitativo).
RECUERDA: El tiempo de retención ( tR) es el tiempo que transcurre desde que se inyecta la
muestra en la columna hasta que un determinado soluto sale eluido y alcanza el detector
produciendo el pico cromatográfico. Cada elemento tiene su propio y característico tiempo de
retención (tr1, tr2, tr3, tr4…) en condiciones fijas de trabajo.
Figura 15
Un proceso de separación cromatográfica será más efectivo cuanto más separadas aparezcan
unas bandas de otras. La utilización de columnas de desarrollo suficientemente largas incrementa
el grado de resolución cromatográfica. Además, las muestras deben ser y de pequeño volumen y
suministradas rápidamente, lo que evita que las bandas se ensanchen y disminuya la resolución.
B. Detector integral. Su respuesta es proporcional a la masa total de la sustancia que queda
incorporada a la fase móvil, mientras que cuando la fase móvil es pura, aparece una línea
horizontal. De esta forma, el desnivel m2 – m1 es proporcional al total de la masa de la sustancia
componente que ha sido eliminada en el intervalo t2 – t1 , por lo que nos proporcionará un valor de
la masa de esta sustancia respecto a la masa total de la muestra. Cada escalón de la gráfica
corresponderá a una sustancia separada y sus respectivas alturas serán equivalentes a la
proporción de masa de cada una de ellas respecto a la masa total de la muestra.
Figura 17
2.- Bombas impulsoras. Es la parte más sensible del cromatógrafo. Estas bombas pueden actuar
de modo isocrático (la composición de la fase móvil permanece constante durante todo el proceso)
o de modo gradiente (va cambiando durante la cromatografía) . Las válvulas del instrumento deben
ser resistentes a la alta presión empleada. Además, tanto la bomba como los demás elementos
(recipientes, tuberías, etc.), deben estar construidos de acero inoxidable para que sean inertes con
la fase móvil.
3.- Sistemas inyectores de muestra. La presión de trabajo de la cromatografía líquida es tan alta
que hay que utilizar inyectores de bucle. En la posición de carga, el bucle de la muestra está
aislado de la fase móvil y está abierto a la atmósfera. Con una jeringa cuya capacidad es varias
veces mayor que la del bucle, se coloca la muestra en este. Cualquier cantidad que sobre saldrá
por la línea de desecho. Tras cargar la muestra, se gira el inyector a la posición de inyección, en la
que la fase móvil se dirige a lo largo del bucle y la muestra es arrastrada a la columna.
4.- Formadores de gradientes. Los HPLC pueden utilizar fases móviles cuya composición varía
continuamente (gradiente). Este mecanismo permite cambiar automáticamente las proporciones del
eluyente.
5.- Precolumnas y Columnas.
-Tipos de columnas. En la HLPC suele haber dos columnas: una columna analítica en la que se
produce la separación y una precolumna que se coloca delante para proteger de la contaminación.
Las principales columnas que se usan en la HPLC son de acero inoxidable y tienen un diámetro
interno de entre 0,3 y 5 mm, y una longitud entre 5 y 25 cm. Estas columnas están rellenas con
partículas de sílice porosas de 3 a 10 μm, También se emplean microcolumnas construidas con
capilares de sílice fundidos, con diámetros internos de 0,1 a 0,5 mm y con una longitud de varios
metros. La precolumna tiene el mismo material de relleno y la misma fase estacionaria que la
columna analítica, es bastante más corta y barata que esta y se cambia con frecuencia.
- Material de relleno de las columnas y fase estacionaria. Puede ser de tres tipos:
Pueden ser soportes de película (bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas en cuya
superficie se deposita una capa delgada de sílice o de una resina de intercambio iónico), soportes
rellenos de partículas microporosas (de sílice, alúmina o resinas de intercambio) y fases unidas
(el material de soporte es sílice que se hace reaccionar con un organoclorosilano)
La combinación de una fase estacionaria polar y una móvil apolar se llama cromatografía líquida
en fase normal, y es la más utilizada. En este caso, suelen usarse como fases estacionarias
líquidas el agua y el etilenglicol, y como fases móviles, el hexano, el metanol y las mezclas
hexano/isopropanol. Cuando la fase estacionaria es apolar, como un hidrocarburo, y se utilizan
como fase móvil sistemas acuosos, se denomina cromatografía líquida en fase reversa.
Estudio de la pureza de los reactivos empleados para los análisis químicos y clínicos.
Análisis de muestras volatilizables: mezclas de alcoholes, perfumes, aromas, esencias, etc.
Detección de fármacos en muestras biológicas, como por ejemplo, los antiepilépticos.
Método de confirmación de drogas de abuso. Por ejemplo, alcohol, derivados del cannabis
(marihuana y hachís), derivados del opio (morfina, heroína), cocaína y derivados (como el crack),
anfetaminas y derivados (como la metanfetamina o cristal), los ansiolíticos (como barbitúricos,
benzodiacepinas), alucinógenos (como el LSD).
Determinación de monóxido de carbono (CO) en sangre.
Métodos antidopaje
Separación de sustancias esteroideas.
Figura 22
1.- Sistema de suministro del gas portador (fase móvil). La fase móvil está formada por un
gas, el gas portador, que debe ser químicamente inerte para que no reaccione ni con la muestra ni
con la fase estacionaria y debe estar libre de agua e impurezas. Su elección depende también del
tipo de detector utilizado en cada caso. Como gases portadores se usan gases nobles (helio, neón
y argón) nitrógeno, hidrógeno y dióxido de carbono. El gas se encuentra en una bombona que lo
suministra a presión, controlada con unos manómetros de flujo. El flujo de dicho gas es la fuerza
que arrastra y transporta los componentes de la muestra (cuando están en fase de vapor) que se
separarán a lo largo de la fase estacionaria de la columna. Mediante el fenómeno de partición o
reparto, las sustancias de la muestra serán retenidas con distinta fuerza y podrán ser separadas.
2.- Sistema de inyección de la muestra. Todos los constituyentes que se inyectan en el
cromatógrafo deben ser volátiles. Es aconsejable que la cantidad de muestra inyectada sea lo más
pequeña posible ya que la inyección lenta de muestras demasiado grandes da lugar a bandas
anchas y, por tanto, a una deficiente resolución en el proceso de separación. La muestra (líquida o
gaseosa) se introduce disuelta en un pequeño volumen de fase móvil a través de un tabique de
goma, utilizando una microjeringa aplicada en la parte inicial de la columna, que introduce
rápidamente una cantidad pequeña de muestra (de 1 a 2 μl). Cuando el volumen de muestra
requerido es muy pequeño (columna capilar) se utiliza un "divisor" que sólo deja pasar a la columna
una parte de la muestra y desecha el resto. La inserción y la inyección de la aguja en el bloque han
de hacerse lo más rápido que se pueda. Hay inyectores automáticos de la muestra que se colocan
en un carrusel, introducidos en recipientes adecuados. Según el programa que se establezca, las
muestras se inyectan cada cierto tiempo de modo secuencial. El bloque inyector se debe calentar a
una temperatura de al menos 50 ºC por encima del punto de ebullición de las sustancias a separar
en la muestra (en concreto, hay que superar el punto de ebullición del componente que lo tenga
mayor), lo cual hace que estas sustancias se separen muy rápidamente. Una vez evaporado, el
gas noble portador lo capta y transporta a la columna.
3.- Columnas de desarrollo y material de relleno (con la fase estacionaria). Pueden ser de dos
tipos: las columnas de relleno (empaquetadas) y las columnas capilares (tubulares abiertas),
que son las más usadas actualmente debido a su rapidez y eficacia. Las columnas suelen ser de
acero inoxidable, vidrio, cobre o aluminio. Las capilares pueden tener hasta 100 m de longitud y un
diámetro interno de 0,1 a 0,5 mm. Las columnas está rellenas de un soporte particulado inerte,
finamente dividido, como tierra de diatomeas, microesferas de vidrio y polímeros porosos.
Las fases estacionarias deben ser químicamente inertes, térmicamente estables, tener poca
volatilidad y una polaridad adecuada para los solutos que vayan a separarse. Los solutos apolares
se separan mejor con una fase estacionaria apolar, y los solutos polares, con una fase estacionaria
polar. Las fases estacionarias más usadas en CG son el apiezón L, el polidimetil siloxano (SE-30),
el metil fenil polisiloxano (OV-171), el trifluoropropil de metil polisiloxano y el polietilenglicol.
4.- Horno. En la CG es esencial controlar la temperatura de la columna para conseguir una buena
separación, para lo cual las columnas se alojan en un horno termostatizado. La cromatografía
puede realizarse a temperatura constante o programarse para que varíe con el tiempo (ajustando la
temperatura inicial por debajo del punto de ebullición del componente de la mezcla que lo tenga
menor). Al avanzar la separación, se aumenta la temperatura de forma lenta y uniforme o a pasos.
5.- Detector. Una vez conseguida la separación, las sustancias todavía estarán unidas a la fase
móvil, por lo que se les hace pasar por un detector que mide los cambios en las propiedades físicas
que ha sufrido la fase móvil por el hecho de estar unida a las sustancias de la muestra. Si el
detector sólo reconoce a la fase móvil, aparece una línea horizontal de base en el registro del
monitor. Cuando se detecta que la fase móvil está unida a una sustancia arrastrada de la muestra,
aparece en la pantalla un pico. La superficie o área bajo la curva (ABC) de cada pico es
proporcional a la cantidad de sustancia presente. Los detectores más utilizados son: de ionización
de llama, de captura electrónica, el espectrómetro de masas, espectrómetro de infrarrojos,
espectroscopia de emisión atómica, etc.
La CG tiene una gran sensibilidad ( permite apreciar cantidades inferiores a 0,1 μg) pero no puede
detectar las sustancias que al pasar a estado gaseoso pierden sus características físico-químicas.
Fig 23:Suministro de
gas
Figura 26
Figura 27 Figura 28
-
2.- ESPECTROMETRÍA DE MASAS
2.1.- INTRODUCCIÓN.
El espectrómetro de masas, diseñado por primera vez por Francis William Aston en 1919, fue
desarrollado para medir las masas de los isótopos. Es una técnica que se emplea desde principios
del siglo XX en el mundo de la investigación y en la industria farmacéutica y actualmente, gracias al
desarrollo tecnológico, ha adquirido mayor importancia dentro del laboratorio clínico.
La espectrometría de masas atómicas es una herramienta muy versátil y útil para identificar los
elementos presentes en una muestra y determinar las concentraciones de cada una de las
materias que la componen. En principio, el espectro de masas de cada compuesto es único y
puede ser usado como una “huella química” para caracterizar un determinado analito. Nos permite
determinar prácticamente todos los elementos del sistema periódico.
En sentido estricto no es una técnica espectrométrica, puesto que no se sirve del espectro
electromagnético, sino que el resultado que se obtiene del análisis es un espectro, entendido como
una gráfica con un conjunto de picos. Además, es una técnica destructiva ya que durante el
proceso del análisis es necesario destruir la molécula original que se estudia.