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Métodos para su
Estudio
Propiedades Espectroscópicas
• Todos los aminoácidos
absorben luz en la región
infraroja
• Sólo Phe, Tyr, & Trp absorben
UV
• Absorbancia a 280 nm es un
buen diagnóstico para
aminoácidos
Medida de absorbancia en un espectofotómetro
Separación de Aminoácidos
• Mikhail Tswett, botánico ruso, separó
pigmentos coloreados de plantas por
‘cromatografía’
• Existen muchos métodos cromatográficos
para separar mezclas de aminoácidos
– Cromatografía de intercambio iónico
– Cromatografía líquida de alta performance
(HPLC)
Cromatografía en columna
Cromatografía de Partición / Tamiz molecular
Mezcla de proteínas es
añadida a columna con
intercambiador (cat)
Columna
conteniendo Elución separa
resina de aa en bandas
intercambio discretas
catiónico
Cromatografía de Afinidad
Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes
(SDS-PAGE)
Luego de la tinción : con nitrato de plata o Azul de Coomassie
Determinación de peso molecular aprox.de una proteína (Mr)
Isoelectroenfoque : Separación de proteínas en base a su
punto isoeléctrico
Primer paso para la electroforesis de proteínas en 2
dimensiones
Frederick Sanger terminó la secuencia de la insulina bovina en
1953: una década de trabajo y muchos investigadores para un
péptido de 51 residuos
Determinando la Secuencia
Una Estrategia de Ocho Pasos
• Analisis N-terminal :
– Método de Sanger: utiliza 1-fluoro-2,4
dinitrobenzeno (FDNB) que marca 1er aa. e
hidroliza el resto del polipéptido
• Secuencia Correcta:
L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K
Ejemplo de péptido de 38 residuos que es secuenciado
FDNB:
FluoroDiNitroBenceno
Naturaleza de las Secuencias de
Proteínas
• Secuencias y composición reflejan la
función de la proteína
• Proteínas de membrana tienen más
residuos hidrofóbicos, mientras que las
proteínas fibrosas pueden tener secuencias
atípicas
• Proteínas homólogas de diferentes
organismos tienen secuencias homólogas
• e.g., citocromo c está altamente conservado
Espectrometría de masas