Guía Unificada de Laboratorios Código FLA-23 v.

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1. Título

Guía 9. Diversidad Metabólica de los microorganismos I. Utilización de Carbohidratos

2. Objetivo

Determinar la habilidad de los microorganismos de utilizar diversas vías metabólicas para

la utilización de los carbohidratos.

2.1Objetivos Específicos

- Reconocer el medio OF de Hugh y Leifson determinando su composición,

fundamento, uso, interpretación de resultados y correlacionar los conceptos
teóricos del metabolismo microbiano.
- Determinar la habilidad de los microorganismos para catabolizar la glucosa con la
producción y estabilización de altas concentraciones de ácidos.
- Determinar la habilidad de los microorganismos para catabolizar la glucosa
generando productos metabólicos neutros o no ácidos a partir de ácidos orgánicos.
- Determinar la capacidad de un microorganismo de catabolizar un carbohidrato
incorporado en un medio de cultivo con la producción de ácido y gas o sólo ácido.
- Aplicar los diferentes medios de cultivo selectivos y diferenciales, o de
identificación bioquímica para la identificación bacteriana según sea el
metabolismo, reconociendo su composición, interpretación y lectura de resultados.

3. Marco Teórico

La mayoría de las bacterias utilizan hidratos de carbono por una o varias vías metabólicas
a fin de satisfacer sus necesidades energéticas. Algunos no utilizan hidratos de carbono
pero pueden obtener energía de otros tipos de compuestos orgánicos como aminoácidos,
alcoholes o ácidos grasos.

La degradación bacteriana de hidratos de carbono ocurre por vías metabólicas en las

cuales los electrones son transferidos sucesivamente a compuestos de mayor potencial
redox, con liberación final de energía en la forma de ATP. Todos los hidratos de carbono
de 6, 5 y 4 carbonos son degradados a Ácido Pirúvico, un intermediario inicial. Esta
degradación ocurre por varias vías diferentes:

1. Vía de Embden Meyerhof-Parnas (EMP) ó via Glucolítica o Anaerobia. La glucosa

es degradada sin Oxígeno; esta vía la usan las bacterias anaerobias y algunas bacterias
anaerobias facultativas. Históricamente, la vía EMP también se ha llamada vía
fermentativa. En ella, el ácido Pirúvico actúa como aceptor intermediario de electrones,
pero luego es oxidado entregando sus iones al lactato de sodio para formar ácido láctico,
o a otras sales orgánicas y formar diferentes ácidos mixtos. Estos ácidos son los
productos finales de este metabolismo, lo que explica la caida del pH en las pruebas de
fermentación.
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2. Vía de Entner Douderoff (ED). También denominada vía aerobia porque requiere
oxígeno para la glucólisis. Se forma ácido Pirúvico como intermediario y al carecer de las
enzimas deshidrogenasas necesarias para oxidar este ácido a ácido láctico y otros ácidos
mixtos, las bacterias oxidativas transfieren los electrones disponibles al ciclo de Krebs,
donde los iones se unen finalmente al O 2 para formar agua. Los ácidos formados en esta
vía son muy débiles en comparación con los ácidos mixtos que resultan en la
fermentación. No hay producción de gas.

3. Vía de las Pentosas o Pentosas Fosfatos o Hexosas Monofosfatos (HMP) de

Warburg-Dickins. Es un híbrido entre las vías EMP y ED, dos precursores del piruvato
están solo presentes en esta vía: Ribulosa 5-fosfato y Gliceraldehido 3- fosfato, llegando
al intermediario común: Piruvato. Este piruvato puede entrar al ciclo de Krebs o producir
ácidos orgánicos (ácidos mixtos). Para algunos microorganismos esta es la principal
fuente de energía, para otros la vía se emplea para producir NADPH y Ribulosa (C5)
quien por vías biosintéticas formará la Ribosa y Desoxirribosa del ARN y ADN
respectivamente.

PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUÍMICA

En esta guía se describen las pruebas de identificación bioquímica en las cuales se
pueden evidenciar la utilización de carbohidratos como fuente de energía por parte de las
bacterias

PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION (O-F):

Fundamento: El medio de OF según Hugo Leifson difiere de los medios de fermentación

de hidratos de carbono en lo siguiente:

1. La concentración de proteínas (peptonas) ha sido disminuida de 1% al 0.2%

2. La concentración de hidratos de carbono está aumentada de 0.5% a 1%.
3. La concentración de agar está disminuida de 1.5% a 0.25% con lo cual su consistencia
es semisólida.
La menor relación proteína a hidratos de carbono reduce la formación de aminas alcalinas
que puede neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del
metabolismo oxidativo. La concentración relativamente mayor de hidratos de carbono
sirve para aumentar potencialmente la producción de ácido. La consistencia semisólida
del agar permite que los ácidos formados en la superficie difundan por todo el medio,
facilitando la visualización del viraje del indicador de pH.

Medio de Cultivo: Medio O-F según Hugh y Leifson.

Composición: Peptona 2gr, Glucosa 10gr, Azul de bromotimol 0.03gr, Agar 2.5gr, Cloruro
de sodio 5gr, Fosfato dipotásico 0.30gr, Agua destilada 1.000ml. pH 7.1.
Color del medio: verde.
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Interpretación: La producción de ácido se detecta en el medio por la aparición de color

amarillo. En el caso de organismos oxidativos, la producción de color se puede notar
primero cerca de la superficie del medio.
Las reacciones pueden ser:

Tubo sin aceite Tubo con Tipo de

(Tubo abierto) aceite (Tubo metabolismo
Cerrado)
Ácido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo
Ácido (amarillo) Ácido (amarillo) Fermentativo
Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacarolítico

PRUEBA DE ROJO DE FENOL- (RF):

Fundamento:
Determinar la capacidad de un microorganismo para degradar un carbohidrato específico
incorporado en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible.

Medio de Cultivo: Caldo Rojo de fenol con Carbohidratos

Técnica: Inocular el caldo de Rojo de Fenol con una colonia de un cultivo axénico del
microorganismo en estudio. Incubar 24-48 horas a 37ºC.

Interpretación: El desarrollo de un color rojo rosado indica una prueba negativa como
resultado de la alcalinización (pH 8.4) por el uso de las peptonas del medio de cultivo. Un
color amarillo (pH 6.8) puede interpretarse acompañado de la producción o no de gas. Un
productor de Gas (aerógeno, CO2 y H2) se identifica por la aparición de burbujas de gas
presentes en el tubo de Durham.

PRUEBA DE ROJO DE METILO - (RM):

Fundamento:
Determinar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables los
productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad
amortiguadora del sistema. La prueba de Rojo de Metilo es cuantitativa para la producción
de ácido y requiere que los microorganismos produzcan ácidos fuertes a partir de glucosa,
de forma que el pH del medio descienda a menos de 4.4. Esta distinción puede hacerse a
través del indicador Rojo de metilo, que presenta color amarillo por encima de un pH de
5.1 y sólo presenta color rojo cuando el pH desciende a 4.4.

Medio de Cultivo: Caldo RM-VP

Técnica: Inocular el caldo RM con una colonia de un cultivo axénico del microorganismo
en estudio. Incubar 24-48 horas a 37ºC.

Revelador: Rojo de Metilo. Finalizado este período de incubación adicionar 5 gotas de

revelador por cada 2.5 mL de medio de cultivo.
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Interpretación: El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que
la producción de ácido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba positiva.
Cuando ocurre la formación de un color amarillo la prueba es negativa.

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER - (VP):

Fundamento:
Determinar la capacidad de algunas bacterias de generar un producto final neutro
(acetoina y 2,3 butanodiol) a partir de la fermentación de la glucosa. Los productos
neutros formados en presencia de oxígeno atmosférico, álcalis (hidróxido de potasio al
40%) y peptonas, se oxidan en diacetilo, reactante para el color producido en la reacción.
El  naftol actúa como catalizador para revelar un complejo color rojo.

Medio de Cultivo: Caldo RM-VP

Reveladores: Solución A:  naftol al 5% en etanol absoluto.

Solución B: Hidróxido de Potasio al 40% en agua destilada.

Técnica: Inocular el caldo de VP con una colonia de un cultivo axénico del

microorganismo en estudio. Incubar a 37ºC por 24 horas. Al finalizar este período
adicionar 12 gotas (0.6mL) de la solución A (  naftol) y 4 gotas (0.2mL) de la solución B
(Hidróxido de potasio al 40%). Agitar el tubo suavemente por 30 segundos y dejar en
reposo durante 10-15 minutos.

Interpretación: Una prueba positiva está indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15
minutos de añadir los reactivos reveladores por la presencia de acetoína. Una prueba
negativa da un color cobrizo.
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AGAR TSI (TRES AZUCARES - HIERRO):

Fundamento: Es una prueba usada para observar la fermentación de la glucosa, lactosa y
sacarosa y la producción de H2S por parte de la bacteria. El cambio de color rojo
anaranjado inicial del medio a amarillo indica fermentación. Si se fermenta únicamente la
glucosa el cambio de color del medio ocurre solamente en el fondo debido a que se
encuentra 10 veces menos concentrada que la sacarosa y la lactosa y los radicales libres
no son suficientes para hacer virar todo el medio.
Si se fermenta los tres azúcares hay cambio de color tanto en la superficie como en el
fondo. La presencia de burbujas que rompen el medio y a veces tienden a expulsarlo
indica presencia de gas como producto final de la fermentación.
La producción de H2S se manifiesta por la aparición de un precipitado color negro debido
a la reducción de la sal de hierro presente en el medio.

Medio de Cultivo: Agar TSI

Técnica: Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio.

Incubar a 37ºC por 24 horas.

Interpretación:

Interpretación Lectura para utilización de

Carbohidratos

Color amarillo: reacción ácida. Leer como A.
Color rojo naranja: reacción alcalina. Leer
como K.
Burbujas: producción de gas. Leer por cruces
(+) de una a tres según la intensidad de
burbujas observadas.
Precipitado negro: Formación de H2S. Leer por
cruces (+) de una a tres según la mayor o
menor aparición de color negro sobre el medio.
A/A: Fermentación de los tres azúcares
K/A: Fermentación de glucosa
K/K: No hay fermentación de los tres
azúcares.
Nota: La lectura de cada tubo debe
incluir tres aspectos: un fraccionario
que indique la utilización de los
carbohidratos, la producción de gas y la
formación de H2S. Ej.: TSI: A/A, Gas +,
H2S negativo.

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES :

En los medios de Agar MacConkey, Eosina Azul de Metileno, Hecktoen entérico, Agar
Xilosa Lisina Desoxicolato y Agar salado Manitol entre otros, se puede evidenciar la
fermentación de los diversos carbohidratos que contienen estos medios.(leer la guía 8
para esta práctica)
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4. Materiales, equipos e Insumos

Equipos:
 Incubadora

Materiales:
 Implementos de bioseguridad: guantes, careta o gafas de protección, bata manga
larga.
 Asas bacteriológicas
 Cinta de enmascarar
 Mechero de bunsen
 Fósforos
 Láminas portaobjeto
 Lápiz marcador
 Pipetas pasteur estériles
 Pipetas de 2ml estériles
 Macropipeteadores

5. Reactivos y Medios de cultivo

 Aceite mineral estéril.

 Reveladores: Rojo de Metilo, alfa naftol al 5% en etanol absoluto, Hidróxido de potasio
al 40% en agua destilada.
 Medios de Cultivo en caja de petri: Agar Mc Conkey, Agar Hecktoen, Agar XLD, Agar
EMB.
 Tubos con Caldo RM, caldo VP, Agar TSI.
 Tubos con caldo rojo de fenol con azúcares al 1% y campana de Durham: glucosa,
lactosa y xilosa.
 Tubos con medio de cultivo O-F con azúcares: glucosa, lactosa.
 Cepas bacterianas en Agar MacConkey de: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sp., Proteus mirabilis,
Citrobacter sp.

6. Procedimiento

Primer día:
1. Test O-F: Para cada bacteria, realice siembra por picadura hasta el fondo, en 2 tubos
de medio OF tomando una parte de una colonia con el asa recta, luego adicione 1 ml de
aceite mineral estéril a uno de los dos tubos de cada azúcar. Incube a 37ºC por 24-48
horas.
2. Caldo rojo de fenol 1%: Siembre por emulsión la cepa bacteriana respectiva en un
tubo diferente. Tenga en cuenta que la campana de Durham debe estar llena de medio de
cultivo antes de realizar la siembra. Incube a 37ºC por 24 horas.
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3. Tubos con Caldo RM, caldo VP: Siembre por emulsión la cepa bacteriana respectiva.
Incube a 37ºC por 24 - 48 horas.
4. Tubo con Agar TSI: Siembre en forma mixta empleando la cepa respectiva. Incube a
37ºC por 24 horas.
5. Medios de Cultivo en caja de petri con Agar Mc Conkey, Agar Hecktoen, Agar
XLD, Agar EMB: Siembre por agotamiento la cepa bacteriana respectiva en cada uno de
los medios de cultivo. Incube a 37ºC por 24 horas.

Segundo día
Observe, lea e interprete las reacciones ocurridas en cada uno de los medios de prueba, y
realice su informe. Compare entre sí los resultados obtenidos por sus compañeros de
Laboratorio.

Informe: Reporte y analice los resultados obtenidos.

Causas de error
 Incorrecta realización de la técnica de siembra.
 Fallas en la lectura e interpretación de las reacciones bioquímicas

7. Nivel de Riesgo

Nivel 2 (Riesgo Medio)

8. Bibliografía

Koneman, E. et al. 2003. “Diagnóstico microbiológico”. Argentina. 5a edición. Editorial

Médica Panamericana
CULTIMED. Manual básico de Microbiología en:
http://www.ictsl.net/downloads/microbiologia.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U3c_PruebasBioquimicas_17461.PDF

9. Anexos

CONSULTA

1. Investigue que otras fuentes de carbono son utilizadas para la realización de

identificación bioquímica y que tipo de prueba se realiza.
2. Con respecto a las pruebas de identificación Bioquímica utilizadas en la práctica
complete el siguiente cuadro: composición del medio de cultivo (carbohidratos,
indicadores de pH), reveladores utilizados en la prueba, lectura e interpretación
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COLOR
INICIALDEL
PRUEBAS CARBOHIDRATOS INDICADOR REVELADOR MEDIO/ TIPO LECTURA INTERPRETACION
DE pH DE SIEMBRA

TEST O-F

ROJO DE
FENOL

TSI
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COLOR
INICIALDEL
PRUEBAS CARBOHIDRATOS INDICADOR REVELADOR MEDIO/ LECTURA INTERPRETACION
DE pH TIPO DE
SIEMBRA

ROJO DE
METILO
RM

VOGES
PROSKAUER
VP