Relatório de aula prática: Colorimetria e Espectrofotometria

O trabalho realizado na aula prática de Métodos de Diagnóstico no dia 10 de setembro de

2014, consistiu na realização de um experimento que avaliasse características qualitativas e
quantitativas de uma amostra de glicose com um segundo reagente através de métodos de
colorimetria e espectofotometria. A aula prática teve como objetivo sedimentar o
conhecimento adquirido nas aulas e estudos teóricos acerca da rotina laboratorial em métodos
de diagnóstico.
Os materiais utilizados no procedimento foram um espectrofotômetro com cubetas, pipetas
graduadas de 5 mL, pipetas automáticas, estante com tubos de ensaio, estufa, água destilada,
glicose e reagente da glicose.
O método fundamentou-se primeiramente no uso do conteúdo de uma cubeta contendo água
destilada, estabelecida como o marco de referência. Após calibrar o espectofotômetro com o
valor de referência da água destilada, mediu-se a transmitância da cubeta com o conteúdo do
quarto frasco, com concentração conhecida e determinada como padrão de glicose. As cubetas
foram lidas e calibradas nos seguintes comprimentos de onda: 420, 440, 460, 480, 500, 520,
550, 580, 600, 620, 650 e 700 nm. Com esses resultados, construiu-se um gráfico no qual foi
possível identificar o comprimento de onda em que houve o pico de absorção da luz (Gráfico
1). Em seguida, prepararam-se os tubos contendo amostras de 2mL de glicose com volumes
distintos de reagente, posteriormente realizou-se homogeneização mecânica e por fim, os
tubos homogeneizados ficaram em banho-maria a 37ºC por 10 minutos. Decorrido o tempo
determinado, os tubos foram levados para a leitura no espectrofotômetro e através das cubetas
foram incididos os comprimentos de onda (Tabela 1), método pelo qual se determinou a
correspondência ao pico de absorção, estabelecendo, desse modo, os valores da transmitância
para cada um dos comprimentos de onda. Por fim, por meio da Lei de Lambert-Beer, que
determina que: Abs = 2 –LogT, todos os valores indicativos qualitativos de absorbância de
cada uma das amostras de glicose foram encontradas (Tabela 2).
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Gráfico 1. Absorbância em função do comprimento de onde em nm. Na seta, o pico

máximo de absorção da glicose

A figura mostra a curva de absorção da Glicose, em solução com um reagente

(corante), sob diferentes comprimentos de onda, registrados de 420 a 700nm.
Observa-se, pelo gráfico, que o pico de absorção da luz, para esta solução, encontra-se
no comprimento de onda de 500nm, valor para o qual constata-se uma absorbância de 0,380.
A tabela 1 foi construída a partir dos valores obtidos da leitura do espectofotômetro.
Inicialmente lia-se a substância inalterada, com 100% de transmitância e zero de absorbância
e após regular o aparelho, lia-se a cubeta de glicose com o reagente em concentração
conhecida (tubo 4, 100mg/dL), para que fosse determinados os valores de transmitância e
absorbância em diferentes comprimentos de onda.
Tabela 1. Tabela de leitura do corante completando os valores de absorbância
 (nM) Leitura T (%) Absorbância
420 75,9 0,119
440 67,3 0,172
460 50,8 0,295
480 45,6 0,340
500 41,8 0,380
520 42,1 0,374
550 54,0 0,268
580 71,4 0,146
600 81,5 0,088
620 89,9 0,047
650 96,2 0,017
700 99,00 0,005

Tabela 2: Tabela contendo o valor das concentrações do reagente nos diversos tubos de
Glicose
TUBO GLICOSE REAGENTE CONCENTRAÇÃO TRANSMITÂNCIA ABSORBÂNCIA
OBTIDA (mg/dL) (T%)* (Abs ou D.O.)
(No) mL uL

1 2,0 00 0 100 0

2 2,0 10 59,11 61 0,214

3 2,0 15 79,83 51,4 0,289

4 2,0 20 100 43,4 0,362

5 2,0 30 147,23 29,3 0,533

6 2,0 40 204,14 18,2 0,739

7 2,0 15<x<20 81,76 50,5 0,296

Usando como referência o tubo 4, com concentração conhecida de 100mg/dL de glicose,

calculando sua transmitância e dos demais tubos no aparelho é possível determinar também a
concentração dos outros tubos. Pode-se perceber que, excluindo o tubo 7, há uma relação
entre concentração, transmitância e absorbância. Quanto menor a transmitância, maior a
concentração e quanto maior a absorbância, maior a concentração.
O gráfico 2 foi construído a partir dos dados de transmitância e concentração de uma única
amostra utilizando-se a Lei de Lambert-Beer. O postulado utilizado foi que a absorbância é
proporcional à concentração, logo o gráfico apenas corrobora tal resultado. Percebe-se que a
curva do gráfico é uma reta com uma inclinação constante e quanto maior a absorbância
maior a concentração. Isso poderia ser explicado, pois quanto mais moléculas de uma
substância dentro de uma solução, mais a luz será absorvida e consequentemente menos
transmitida. Entretanto, a relação de transmitância com concentração e absorbância é
logarítmica.
Gráfico 2. Variações de Absorbância em função da concentração da Glicose

Variações de Absorbância em função da concentração da Glicose

0.8
0.74

0.7

0.6
0.53
0.5
Absorbância

0.4 0.36
0.29
0.3
0.21
0.2

0.1
0
0
0 50 100 150 200 250

Concentração (mg/dL)

O gráfico 3 foi construído depois da descoberta das concentrações de cada tubo e estes
dados foram graficamente construídos juntamente com a transmitância. Segundo a Lei de
Lambert-Beer, a concentração e a transmitância são grandezas proporcionalmente
logarítmicas como indica o desenho da curva desse gráfico. Quando não há nenhuma
molécula do soluto utilizado na solução toda a luz é transmitida, obtendo-se assim
transmitância de 100%.
Gráfico 3. Variações de Transmitância em função da concentração

Variações de Transmitância em função da concentração

250

200
Concentração Obtida (mg/dL)

150

100

50

0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Transmitância (%)

Gráfico 4. Variações de Absorbância em função da concentração da Glicose

Variações de Absorbância em função da concentração da Glicose

0.8
0.74

0.7

0.6
0.53

0.5
Absorbância

0.4 0.36

0.3
0.29
0.3
0.21
0.2

0.1

0
0
0 50 100 150 200 250
Concentração (mg/dL)

O gráfico de absorbância foi utilizado para saber qual a concentração do Tubo 7

(provável paciente representado pelo losango vazado e indicado pela seta), essa escolha é
justificada pela linearidade entre as duas grandezas. Por isso facilita-se a determinação da
concentração mais pela absorbância do que pela transmitância, pois a última necessitaria de
cálculos mais apurados e consequentemente com maiores chances de erro.