MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO

Sorologia
O diagnóstico de certeza de um processo infeccioso é a demonstração do patógeno ou
de seus produtos nos tecidos ou fluidos do hospedeiro
Nem sempre isso é possível (inacessibilidade do órgão afetado, falta de sensibilidade
dos métodos, tempo, etc)
Os métodos imunológicos têm sido utilizados para suprir as deficiências dos métodos
parasitológicos ou microbiológicos
Na pesquisa de anticorpos, os testes sorológicos têm sido utilizados com sucesso, como
auxiliares importantes no diagnóstico individual ou em inquéritos epidemiológicos.

Importância da pesquisa de anticorpos no diagnóstico individual

Elucidar processos patológicos com sintomas e sinais clínicos confundíveis:
Toxoplasmose e mononucleose infecciosa, toxoplasmose e rubéola, sífilis secundária e
dermatoviroses ou processos alérgicos, hepatite B e C, etc.
Diferenciar a fase da doença, especialmente em patologias que provocam fetopatias
(toxoplasmose, sífilis, citomegalia, rubéola)
Diagnosticar doença congênita através da identificação das classes de Imunoglobulinas
(IgG ou IgM) específicas.

Selecionar doadores de sangue (doenças infecciosas).

Selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes através da determinação
dos antígenos do MHC (HLA) dos diferentes indivíduos
Avaliar o prognóstico da doença (anti-HBe relacionado a infectividade e contagiosidade
do HBV, altos títulos de anticorpos na Paracoccidiodomicose com ausência de resposta
celular indicam mau prognóstico)
Verificar o agravamento da patologia – a presença de auto-anticorpos durante a evolução
de um processo patológico está relacionada com o agravamento da patologia

Importância da pesquisa de anticorpos em inquéritos epidemiológicos

Estabelecer a prevalência da doença – detecção de IgG (anti-T. cruzi na década de 70)
Verificar a erradicação da doença – ausência de anticorpos em crianças nascidas e
expostas ás condições ambientais
Verificar a reintrodução de novos casos em áreas consolidadas (presença de IgM ou
elevação dos títulos de IgG)
Importância dos testes sorológicos na pesquisa de antígenos
Como critério de cura – técnicas com altos níveis de sensibilidade e especificidade,
rigorosamente padronizadas
Na definição da etiologia da doença
Na seleção de doadores de sangue – quando os níveis de Ig ainda não são detectáveis
(HBsAg).

Com outros microorganismos como os protozoários, a dificuldade está na definição do

antígeno alvo a ser estudado, pela complexidade antigênica e pela falha, em muitos casos, da
resposta imune aos determinantes antigênicos selecionados.

Testes sorológicos - Características

Testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para detecção e quantificação de
antígenos, anticorpos ou outras moléculas que desempenhem papel como antígenos no ensaio
(drogas, hormônio, citocinas, receptores de células, etc).
Para pesquisa de um componente (Ag ou Ac) é necessário a presença do outro e a
observação da formação do complexo Ag-Ac.
 Como ocorre “in vivo”, esses complexos não são visíveis sem marcadores especiais que
amplificam os sinais da presença destes complexos. O uso destes marcadores aumentam a
sensibilidade do método.
Os marcadores comumente utilizados são os radioativos, enzimáticos, fluorescentes e
quimioluminescentes.
A amplificação do sinal também pode ser obtida com o emprego de partículas, como na
aglutinação e nos métodos automáticos de precipitação.
Aglutinação
Direta: utiliza-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou
fragmentada – hemácias, bactérias, fungos e protozoários - podem ser aglutinados
diretamente pelos anticorpos. Quantidade fixa de antígeno é usada frente a diluições em
série do anticorpo. O resultado é geralmente expresso com o título do anti-soro. ABO, Rh,
Teste de Widal, etc.
Inibição da hemaglutinação direta: é baseada na capacidade que certos antígenos
virais têm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemácias. Os anticorpos, quando
presentes na amostra, ligam-se aos antígenos virais, impedindo a aglutinação. Não é possível
distinguir entre IgG e IgM. Anticorpos contra vírus da Rubéola, sarampo e influenza.
Aglutinação passiva ou indireta: As hemácias e as partículas inertes como o látex,
podem ter adsorvidos em suas superfícies, antígenos variados ou anticorpos específicos contra
os vários antígenos a pesquisar. ASLO, β-HCG, etc.

Radioimunoensaio
O radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para a análise quantitativa das
reações antígeno-anticorpo; permite medidas rápidas e precisas (ng ou pg).
Ampla aplicação na toxicologia, farmacologia, endocrinologia, imunologia, etc.
Pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos,
anticorpos e antígenos.
Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado com
radioisótopo (Ag ou Ac), quantifica o Ág ou Ac não marcado na amostra.
Limitações: custo, vida média dos reagentes e risco operacional.

Imunofluorescência
Baseia-se na capacidade dos anticorpos de se ligarem a fluorocromos sem perder sua
reatividade específica com o antígeno. Fluorocromos são substâncias que, quando excitadas
com luz de alta energia, absorvem luz de um comprimento de onda menor e, instantaneamente,
emitem luz de comprimento de onda maior (menor energia)
Direta: é empregada na pesquisa e localização de antígeno em células ou tecidos por
intermédio de um anticorpo específico marcado com fluorocromo. Os anticorpos não ligados são
removidos pela lavagem e o preparado é observado em microscópio de imunofluorescência.
Indireta: a sensibilidade dos testes de imunofluorescência é limitada ao nível da
capacidade de detecção do olho humano. O teste indireto tem sido usado para amplificar o sinal
e aumentar a sensibilidade. Pode ser empregada na pesquisa de antígenos ou de anticorpos.
 - Pesquisa de antígenos: célula - anticorpo específico produzido em animal diferente
do doador do antígeno – anticorpo anti-imunoglobulina marcado, produzido em outro animal e
dirigido contra o primeiro
- Pesquisa de anticorpo: Antígenos padronizados são fixados em lâminas e sobre
estes, adiciona-se o soro diluído que se quer pesquisar. Após lavagem, a preparação é
incubada com o conjugado (anti-imunoglobulina humana conjugada à substância fluorescente)

A imunofuorescência indireta é o teste de referência na sorologia de muitas doenças.

Apresenta várias vantagens – sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade,
padronização e execução simples.
A necessidade de microscópio de fluorescência, a subjetividade da leitura e a não
automação representam limitações ao teste.

Enzima-imunoensaio (ELISA)
Baseia-se na imobilização de um dos reagentes (Ag ou Ac) numa fase sólida
(agarose, poliacrilamida, poliestireno), enquanto o outro reagente pode ser ligado a uma
enzima com preservação tanto da atividade enzimática quanto da imunológica.
A reação Ag-Ac é monitorada pela medida da atividade enzimática sobre seu substrato
Apresenta alta sensibilidade, utiliza reagentes estáveis, ao contrário dos radioativos, e
pode ser empregado com uma variedade de sistema de detecção (visual, colorimétrico,
fluorescente...)

Mede diretamente a interação Ag-Ac

Tem substituído com boa relação custo/benefício o radioimunoensaio e a aglutinação

Teste de Fixação do complemento

Atualmente tem pouca aplicação, porém ainda é utilizado na sorologia da Doença de Chagas,
da Sífilis e de vários vírus, fungos e rikettsias.
Muito trabalhoso e complexo, apesar de sensível.

Novos rumos
Na tentativa de superar alguns dos problemas da microscopia, métodos baseados em
análises sorológicas foram desenvolvidos e são considerados o padrão ouro para diversas
doenças infecciosas.
Apesar de largamente utilizados na rotina laboratorial, esses métodos não permitem, em
alguns casos, uma clara diferenciação entre as infecções prévias e as recém-adquiridas,
dificultando o estabelecimento de critérios de cura.
Outro ponto crítico é a perda da especificidade quando se usa, como antígeno, extrato
total do microorganismo – reações cruzadas (T. cruzi e Leishmania).
Da mesma forma que a sorologia veio tentar superar as dificuldades encontradas na
microscopia, as técnicas de Biologia Molecular e DNA recombinante estão contribuindo para o
aperfeiçoamento dos métodos de pesquisa de marcadores biológicos específicos para o
diagnóstico das doenças infecciosas.