Luis Enrique Villanueva Solís 03 de abril 2020

- Análisis –

Exosomes containing ErbB2/CRK induce vascular growth in premetastatic niches and

promote metastasis of bladder cancer.

Dentro de los tumores epiteliales malignos, el cáncer de vejiga (BC, por sus siglas en
inglés) es uno de los más comunes y llega a causar mas de 150 mil muertes alrededor del
mundo, según reportes del 2012. Aproximadamente la tercera parte de las personas con
este diagnóstico presentan un subtipo de tumoración, Cáncer de vejiga musculo invasivo
(MIBC, por sus siglas en ingles), que generalmente lleva procesos de invasión local y
metástasis, por lo que su pronóstico es de carácter desfavorable para aquellos que lo
presentan. Con respecto a las otras dos terceras partes de los casos, son diagnosticados
como cáncer de vejiga musculo no invasivo (NMIBC), en donde la tasa de supervivencia
es mayor al 90%, a diferencia del MIBC con 35% para aquellos con invasión local y 5%
para metástasis. Sin embargo, más de la mitad de los pacientes que no presentan
invasión muscular tienen tendencia a recaída , de los cuales del 10-20% progresan a un
MIBC.

Los tratamiento que se emplean en este tipo de tumor, son esquemas con base en la
administración de cisplatinos (regímenes M-VAC y GC) logrando prolongar la tasa de
supervivencia a costa de los marcados efectos secundarios, que terminan por orillar al
abandono del tratamiento por parte de los pacientes. Y con la ausencia de una segunda
línea de tratamiento, se ha buscado la utilización de Terapias Moleculares Dirigidas,
cuyos blancos terapéuticos se ven enfocados en las rutas de PI3K/AKT/mTOR y
RTK/MAPK, las cuales no han sido bien aceptadas en la práctica clínica, esto ha orillado a
la búsqueda de nuevas terapias moleculares para mejorar el desenlace de los pacientes.

Se ha puesto la mirada en los exosomas, mediadores de comunicación intercelular, ya

que tienen un papel importante en la transmisión de información genómica (ADN, RNAs) y
proteómica, de una célula a otra. Varios reportes han demostrado que los exosomas
derivados de células tumorales pueden llevar a la facilitación de la progresión tumoral y
procesos metastásicos, como en el caso de los exosomas derivados de Melanoma que
inducen el reclutamiento de células, proliferación vascular, inflamación, entre otros, todos
mecanismos que pueden llevar a la formación de metástasis distantes.

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Con respecto al cáncer de vejiga, la proteína exosomal EDIL-3, que se encuentra en

células cancerígenas invasivas, promueve la angiogénesis tumoral, migración celular e
invasividad in vitro a parte de servir como un biomarcador para pacientes con BC. Es
necesario esclarecer el papel de los exosomas en la formación de metástasis en el cáncer
de vejiga para poder establecer un tratamiento adecuado.

Se ha reportado que en BC existe una sobre expresión de CRK, el cual induce transición
epitelio-mesenquimal, lo que contribuye a la formación de metástasis. CRK presenta dos
isoformas, la CRK-I y CRK-II, las cuales son proteínas adaptadoras que median la
actividad del receptor a tirosin cinasa. Estas proteínas son los homólogos celulares de v-
CRK, el cual es un producto de fusión oncogénica entre el retrovirus CT10 y fibrosarcoma
de aves. En este artículo se describe como CRK regula a ErbB2 exosomal en procesos de
progresión tumoral y metástasis en cáncer invasivo de vejiga.

Objetivos.

 Determinar el papel de la vía de señalización de las CRK en el desarrollo de

cáncer de vejiga.
 Determinar el papel de las proteínas CRK en la regulación del gen ErbB2 en los
exosomas derivados tumorales.
 Determinar la importancia de los exosomas derivados de células tumorales en la
invasión y aparición de metástasis distantes.

Análisis de la metodología.

1. Líneas celulares y establecimiento de líneas BC con expresión tdTomato-Luc2 y el

noqueo de CRK en células BC.

Líneas celulares de BC (UM-UC-3, J82, TCC-SUP,T24 y 5637) fueron transfectadas con

pCSII‐CMV‐tdTomato‐Luc2, las que tuvieron una expresión excesiva de tdTomato fueron
aisladas y la actividad de Luciferasa fue analizada por el ensayo de luciferasa (Promega).

Para la realización del knockdown de CRK, se emplearon las líneas celulares UM-UC-3 y
J82, estas fueron transfectadas con un plásmido productor de siRNAs para CRK.

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2. Purificación de exosomas y etiquetado fluorescente.

Suero fetal bovino (FBS), empleado como suplemento para el cultivo de los exosomas de
células BC, tuvo que ser depletado de exosomas, esto lo realizaron mediante
ultracentrifugación a 110 000 g por 2 horas.

Con respecto a las líneas celulares BC, la purificación de los exosomas de dichas células
se llevó a cabo mediante la siguiente centrifugación secuencial:

 Ultracentrifugación (UC) 100 000 g por 70 minutos.

 Sobrenadante de las fracciones colectadas de los cultivos fueron sedimentados por
centrifugación a 500g por 10 minutos.
 Sobrenadante centrifugado a 20 000g por 20 min.
 Exosomas recolectados por centrifugación a 100 000g por 70 min.
 Sedimento resuspendido en 20 mL de PBS y filtrado en filtros de nilón 1.2µm.
 Colectado por centrifugación a 100 000g por 70 min.

Los exosomas purificados fueron etiquetados usando tinción verde de membrana PKH67,
el cual usa partición selectiva para incorporar moléculas reporteras alifáticas dentro de la
bicapa lipídica de la membrana plasmática.

De acuerdo con Van Deun et al., para lograr una buena pureza en la separación de
exosomas y extracción de RNA el mejor método a utilizar es ODG, OptiPrep Density
Gradiadient, esta metodología tiene una mayor eficiencia al momento de la separación de
los exosomas ya que no presenta coaislamiento de partículas no exosomales, como es el
caso de la Ultracentrifugación (Metodología usada en este artículo). Otra de las ventajas
de este método, es la poca cantidad de albumina en las preparaciones de exosomas,
prácticamente 2 veces menos en el ODG que en la UC.

Otro de los problemas que presenta la UC, es la contaminación con RNA no exosomal
unido a complejos proteicos, como es el caso de Ago2, una proteína extracelular de unión
al RNA, dicha contaminación no la presenta la metodología ODG. Es por esto por lo que
se recomienda el uso de la última, sin embargo, se sabe que es una metodología que
requiere de mayor tiempo y costos y la facilidad de uso es poca. Debido a estos
inconvenientes es factible la validación de sus métodos para disminuir errores y mejorar
dichas purificaciones.

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3. Recaptura e internalización de exosomas in vitro. Análisis por espectrometría de

masas.

Para los ensayos in vitro de recaptura de exosomas se incubaron células 5637 o HUVEC
con exosomas ya etiquetados (PKH67) de células UM-UC-3 por 24, 48 y 72 horas. Bajo
microscopia de fluorescencia fue observada la recaptura e internalización de los
exosomas. Aproximadamente 1 µg de exosomas derivados de UM-UC-3 fueron
analizados por un espectrómetro de masas acoplado a cromatógrafo de nanolíquidos en
fase reversa.

Se analizó la proliferación de células tratadas con exosomas (5637 y HUVEC) usando un

conteo a las 48, 96 y 144 horas.

4. Extracción de RNA y análisis de expresión de genes.

Se realizó la extracción total de RNAs de las células de BC y de los exosomas, así como
la extracción de micro RNAs.

5. Ensayos de quimiotaxis e invasión en matrigel.

Células 5637 fueron pretratadas con exosomas derivados de UM-UC-3 por 48 horas y
posteriormente se llevo a cabo el ensayo de invasión en matrigel. Para el caso de las
células HUVEC, se siguió el mismo procedimiento con el paso previo de sembrado celular
en la parte superior de una cámara de cultivo Transwell.

6. Modelo de xenoinjerto ortotópico en ratón e imagenología bioluminiscente.

Ratones hembra desnudos de 8 semanas de edad de la cepa Balb/cAJcl nu/un fueron

utilizados para el modelo de xenoinjerto ortotópico. Los ratones se anestesiaron, se les
realizo una incisión de aproximadamente 6 mm en el abdomen bajo, seguido de una
inyección de las células tumorales en la pared de la vejiga. Las pruebas de
bioluminiscencia fueron llevadas a cabos utilizando el sistema de imagenología Spectrum
IVIS.

7. Educación de ratones con exosomas y seguimiento in vivo. Detección de

metástasis pulmonar en ratones exosoma educados.

Ratones hembra de 6 semanas de edad de las cepas Balb/cAJcl nu/un y NOD/ShiJic‐scid

Jcl fueron usados para los estudios de educación de exosomas. Cada tercer día durante
dos semanas se administraron via i.v. exosomas marcados con PKH67. Células UM-UC-3

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marcadas con tdTomato-Luc2 fueron inyectadas en la vena de la cola de los ratones. 24

horas después se realizó la detección de las células tumorales y los órganos marcados
fueron extraídos, analizados bajo microscopia de fluorescencia y para el análisis
histológico se empleó la tinción de Hematoxilina y Eosina.

8. Ensayo de permeabilidad vascular in vitro.

Este ensayo de permeabilidad vascular se llevo a cabo precultivando células HUVEC por
24 horas con exosomas derivados de BC, normales y con el knockdown de CRK. 24
horas después, FITC-Dextran fue añadido y la fluorescencia fue medida usando el equipo
Spectra MAX Paradigm.

Resultados.

Para poder seleccionar de entre todas las líneas celulares de BC, se analizó la expresión
de CRK-I y CRK-II, los niveles de invasión tisular y la capacidad de generar metástasis
distante. La única línea celular que presento características favorables fue la UM-UC-3,
fue la de mayor expresión de CRK, incluyendo a las unidad fosforilada, presento un alto
nivel de invasión celular, a pesar de no tener diferencia significativa con respecto a las
otras líneas celulares, sin embargo, fue la única en donde se pudo observar un proceso
de metástasis que llego hasta los pulmones. (Ver Figura 1).

Ya una vez establecida la línea celular con la que se va a trabajar, se procedió a analizar
el papel de las proteínas CRK en la supresión de la progresión y metástasis del tumor
gracias a un decremento en el mRNA de ErbB2 y ErbB3. Para esto, se utilizaron las
células knockdown de CRK y se pudo observar que en dichas células comparadas con un
control (sin el knockdown), la progresión y metástasis en los ratones con el xenoinjerto
eran prácticamente nulas, lo que los llevo a pensar que su mecanismo tiene algo que ver
con la expresión de Receptores de Tirosina Cinasa (RTKs) por lo que analizaron la
expresión de los mRNA de 11 distintos RTKs. Únicamente en 4 de ellos (EGFR, cMET,
ErbB2 y ErbB3) los niveles de expresión se redujeron de manera significativa en los
grupos depletados de CRK. Cabe destacar que la disminución en expresión de ErbB2 y
ErbB3 en la línea celular UM-UC-3 es un indicativo de que CRK no solo influye en la
expresión de estas dos, sino que también en la estabilización de las mismas y que estas
(ErbB2 y ErbB3) a su vez son esenciales para el desarrollo y la metástasis del tumor. (Ver
Figura 2)

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Una vez identificado el papel de las CRK en la regulación de ErbB2 y ErbB3 en células de
BC, se procedió a ver su papel en los exosomas (Figura 3), en donde, a pesar de que se
menciona que si hay una regulación en la expresión de ErbB2 y ErbB3 por parte de CRK,
tanto los blot y los niveles de expresión de los mRNA muestran resultados opuesto, pero
esto no descarta la posibilidad de que ambas RTKs tengan un papel importante en la
formación de metástasis.

Para ver el papel de los exosomas derivados de BC en la promoción de la proliferación e

invasión de células BC de bajo grado a través de la expresión de ErbB2, se realizo la
recaptura de los exosomas derivados de BC en la línea celular 5637, aproximadamente el
90% de dichas células hicieron captura de los exosomas. Se analizó el nivel de
proliferación e invasión comparando a los grupos celulares con los exosomas derivados
de BC contra los grupos celulares con los exosomas derivados de BC pero con el
knockdown de CRK. Se pudo observar un aumento en la proliferación e invasión en el
caso del primero grupo (5637-exo+) y un incremento en la expresión de ErbB2, esto nos
da un indicativo de que la proliferación de células tumorales esta regulada por la vía de
señalización de ErbB2 que a su vez depende de CRK. (Ver Figura 4)

Los exosomas derivados de BC, en células del Endotelio Vascular Umbilical Humano
(HUVEC) demostraron tener un incremento significativo en la habilidad de proliferación y
quimiotaxis en comparación con aquellos exosomas con el knockdown CRK. Al igual que
con la línea celular 5637, se presentó un incremento en la expresión de ErbB2/3, esto nos
da un indicativo de que la angiogénesis en células tumorales está regulada por la
expresión de ErbB2. (Ver Figura 5)

Por último de ve el papel de los exosomas derivados de BC en la facilitación de

metástasis distante de BC, mediante la inyección de exosomas derivados de BC normales
y con el knockdown en las venas de la cola de los ratones se pudo observar un proceso
de metástasis en los pulmones de los ratones, únicamente en aquellos que no tenían el
knockdown de CRK, por lo que, esta vía de señalización esta involucrada en los procesos
de generación de metástasis distantes en cáncer de vejiga. (Ver Figura 6)

Conclusión.

El cáncer de vejiga de carácter invasivo tiene una baja tasa de supervivencia , por lo que
la búsqueda de nuevos tratamientos es fundamental para mejorar el pronostico de los
pacientes. Se ha podido esclarecer el papel que desempeñan las proteínas CRK en la

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regulación de la expresión de los genes ErbB2/3, los cuales son parte importante para
procesos fisiológicos de migración celular, diferenciación, proliferación y supervivencia,
sin embargo, una mala regulación de dichos genes se relaciona con la progresión en
procesos metastásicos en el cáncer de vejiga.

La elucidación del papel de los exosomas, como actores principales en los procesos de
angiogénesis, metastásicos y de invasión de tumores malignos nos permite tomarlos en
cuenta como parte de un potencial tratamiento dirigido y mejorar la calidad de vida de los
pacientes con este tipo de padecimientos.

Referencias.

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pre‐metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 2015;17(6):816‐826.
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