BIODEGRADACIÓN DEL POLIURETANO POLIÉSTER POR HONGOS ENDÓFITOS

Jonathan R. Russell , Jeffrey Huang , Pria Anand , Kaury Kucera , Amanda G.

Sandoval , Kathleen W. Dantzler , DaShawn Hickman , Justin Jee , Farrah M.
Kimovec , David Koppstein , Daniel H. Marks , Paul A. Mittermiller , Salvador Joel
Núñez , Marina Santiago , Maria A. Townes , Michael Vishnevetsky , Neely E. Williams ,
Mario Percy Núñez Vargas , Lori-Ann Boulanger , Carol Bascom-Slack y Scott A. Strobel 

Introducción. Los enormes incrementos en la fabricación y el consumo de plásticos en

las últimas décadas han dado lugar a numerosas preocupaciones ecológicas y
económicas. La persistencia de polímeros sintéticos introducidos en el medio ambiente
por la industria humana plantea una gran amenaza para los sistemas ecológicos
naturales. El bajo costo y la facilidad de fabricación han aumentado la demanda mundial
de plástico en más de 150 veces, con una producción de 1,5 millones de toneladas en
1950 y 245 millones de toneladas a partir de 2006. A pesar del reconocimiento de los
persistentes problemas de contaminación planteados por el plástico, la producción
mundial sigue aumentando, y se esperan los mayores aumentos en las naciones en
desarrollo. El gran volumen de plásticos producidos cada año presenta un problema para
los sistemas de eliminación de residuos. La escala de este problema y la resistencia de
algunos polímeros a la degradación requieren la investigación de métodos efectivos para
la biodegradación de los plásticos. Al obtener una comprensión de los mecanismos de
degradación del polímero, se puede lograr una técnica más eficiente para la
biodegradación de los desechos plásticos. Para lograr este objetivo, los investigadores
necesitan un mayor conocimiento de cómo los compuestos son metabolizados por los
organismos existentes, una investigación de nuevos organismos con potencial de
biorremediación, y la caracterización de nuevas capacidades metabólicas. Una
comprensión básica de los procesos biológicos que conducen a la degradación
bioquímica avanzará en el desarrollo de nuevas técnicas de biorremediación.

Materiales y métodos.

 Muestreo de plantas. Plantas leñosas de varias familias fueron recolectadas en el

Bosque Nacional Yasuni en la selva amazónica ecuatoriana. Algunas plantas
fueron atacadas por sus supuestos usos etnobotánicos, mientras que otras fueron
muestreadas al azar.

 Aislamiento endófito. Los tallos de las plantas se esterilizaron superficialmente

mediante inmersión en etanol durante 10 s seguido de un breve flameo. Se
eliminaron capas externas de tejido de los tallos, y se sembraron tres secciones de
los tejidos internos de cada muestra en agar dextrosa de patata (PDA).
 Secuenciación y análisis filogenético. Se hicieron cultivos de endófitas en
placas de PDA durante 1 a 2 semanas a temperatura ambiente. El ADN se extrajo
de aproximadamente 100 mg de material fúngico utilizando el mini kit de la planta
Qiagen DNeasy.
 Pantalla inicial de depuración de PUR. Las endófitas se ensayaron primero para
determinar su capacidad para degradar PUR cultivándolas en presencia de
Impranil DLF, una dispersión de PUR acuosa alifática aniónica con 4% de N -
metilpirrolidona (NMP).
  Ensayo único de fuente de carbono. Los organismos identificados con actividad
de degradación de PUR se probaron para determinar su capacidad de utilizar PUR
como la única fuente de carbono. Para estos estudios, el sustrato fue Impranil
DLN, que contiene PUR suspendido solo en agua (no está presente N-
metilpirrolidona). Esto aisla el Impranil como la única fuente de carbono para el
metabolismo y el crecimiento.
 Degradación anaeróbica de PUR. Los tubos de cultivo que contenían alícuotas
de 9 ml de medio PUR-L min y 1 ml de inóculo fungicida lavado se incubaron en
condiciones anaeróbicas. El entorno anaeróbico se generó utilizando una cámara
anaeróbica BD GasPak. Los cultivos líquidos de cada aislamiento se inocularon
por duplicado. Se colocó un juego dentro de la cámara anaeróbica, y el conjunto
de control se colocó fuera de la cámara en un entorno aeróbico. Ambos conjuntos
se incubaron a 25 ° C durante la duración del estudio. Después de 1 y 2 semanas,
se eliminaron las muestras y se determinó la eliminación por absorción a 600 nm.
 Análisis IR de la degradación de PUR. Los espectros infrarrojos (IR) de
las suspensiones líquidas de PUR-L mín se recogieron cada 48 horas usando un
espectrómetro infrarrojo Nicolet 6700. Se retiró una porción de 50 μl de cada
muestra para cada medición y se centrifugó durante 60 s a 4.200 × g para
sedimentar el material fúngico de las muestras sin una sedimentación significativa
del polímero. Los espectros de muestra líquida se recogieron usando agua
desionizada como espectro de fondo. Las mediciones se realizaron hasta que se
observó la degradación completa de PUR en el cultivo de 10 ml en 2 semanas.
 Caracterización enzimática de supuesta poliuretanasa. Se preparó una
fracción enzimática extracelular cultivando un cultivo líquido de 1 litro del
organismo más activo, Pestalotiopsis microspora E2712A, en medio PUR-L min y
PDB. Después de 10 días de incubación a 30 ° C, el cultivo se filtró a través de un
filtro de 0,22 μm en un recipiente estéril. El extracto extracelular crudo se
almacenó a 4 ° C. Para probar la actividad de una enzima extracelular, se
añadieron 4 ml de extracto a 6 ml de medio PUR-L min. Las muestras se incubaron
durante 2 h en una incubadora giratoria a 30 ° C.

Resultados.

 Pantalla inicial de depuración de PUR. Impranil DLN, un poliéster poliuretano

(PUR), es una suspensión lechosa opaca que se vuelve transparente tras la
degradación. Los organismos capaces de degradar este polímero muestran una
zona de separación alrededor del cultivo en crecimiento ( 5 ). Una colección de 59
hongos endofíticos organismos aislados de muestras de plantas en la Amazonía
ecuatoriana se proyectaron por su capacidad para crecer y degradar poliéster
poliuretano utilizando el ensayo PUR halo como la pantalla inicial.
 Ensayo único de fuente de carbono. Los cinco organismos más activos se
probaron por su capacidad de degradar PUR en cultivo líquido usando PUR como
única fuente de carbono (PUR-L min). Para estos estudios, utilizamos Impranil DLN,
que es equivalente a Impranil DLF (una dispersión aniónica alifática de PUR en
agua) utilizada para los estudios previos pero que no contiene N-
metilpirrolidona. Si un organismo crece en Impranil DLN, puede usar PUR como la
única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento. Todos los inóculos
fúngicos se lavaron con medio mínimo para eliminar el carbono residual y las
enzimas del cultivo madre. Los cinco primeros organismos de los dos ensayos de
 selección se probaron para esta actividad, y los cinco fueron capaces de actividad
de degradación de PUR en esta condición media mínima. Cada hongo mostró un
crecimiento micelial significativo según se controló por inspección visual.
 Degradación anaeróbica de PUR. Algunos de los organismos probados durante
los ensayos de cultivo líquido, incluyendo Pestalotiopsis microspora E2712A
y Pestalotiopsis microspora E3317B, se observaron creciendo desde el fondo del
tubo de cultivo en lugar de desde la parte superior. Esto sugirió que estos hongos
son capaces de degradación anaeróbica del poliuretano.
 Análisis IR de la degradación de PUR. El mecanismo de degradación de PUR se
investigó inicialmente mediante espectroscopía infrarroja ( 16 , 24 ). Las muestras
de PUR de Impranil DLN muestran un gran pico de absorción a 1.735 cm -1
que
corresponde al enlace éster C (O) -O en el polímero de poliuretano ( Fig.
6 A). Se añadió material fúngico al sustrato de PUR y se recogieron los espectros
a lo largo del curso del experimento de degradación.
 Caracterización enzimática de supuesta poliuretanasa. Las zonas de
eliminación en los medios sólido y líquido se produjeron a una distancia
significativa del sitio de crecimiento fúngico, lo que sugiere una actividad
enzimática que se excretó extracelularmente. Para probar explícitamente esta
posibilidad, se probó el aclaramiento del sustrato Impranil DLN usando un filtrado
libre de células de Pestalotiopsis microspora E2712A. El filtrado se preparó a partir
de un cultivo fúngico cultivado en medio PUR-L min durante 10 días. El filtrado bruto
del cultivo de PUR pudo eliminar completamente el Impranil DLN en 1 h o menos
(datos no mostrados).
Discusión de resultados. Los endófitos aislados de muestras de plantas de la Amazonía
ecuatoriana se cribaron por su capacidad para degradar poliuretano poliéster (PUR). Casi
la mitad de los organismos mostraron alguna actividad en el ensayo inicial de eliminación
de placas. Dieciocho endófitos activos y dos inactivos se caracterizaron
adicionalmente. Ocho de los organismos más activos pertenecían
al género Pestalotiopsis. La literatura actual informa algunos hongos con la capacidad de
degradar PUR ( 4 - 6 , 8), aunque estos estudios se han centrado principalmente en
organismos aislados de muestras de suelo. Este es el primer estudio que demuestra la
degradación de PUR por hongos endofíticos. La amplia distribución de la actividad sugiere
que los endófitos podrían ser una fuente prometedora de biodiversidad para probar
actividades importantes para la biorremediación.