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il sequenziamento del DNA è una tecnica indispensabile in biologia e medicina perché

permette di conoscere l'esatta sequenza di nucleotidi di una molecola di DNA.

negli anni 70 del Novecento Frederick Sanger mise a punto un metodo che ha permesso di
sequenziare frammenti di DNA o interi genomi.

immaginiamo di dover sequenziare solo una porzione di DNA. prima è necessario


amplificarlo, cioè averne molte copie. per farlo si ricorre alla PCR (o Reazione a catena della
polimerasi). a questo punto le cuffie amplificate devono essere denaturate: i due filamenti
vengono separati grazie a un aumento della temperatura. si aggiungono poi altri ingredienti
alla miscela: uno è la DNA polimerasi, enzima che sintetizza un nuovo filamento di DNA A
partire dal filamento stampo. per avviare la sintesi è necessario anche un primer: un oligo
nucleotide prodotto ad hoc per legarsi al DNA da sequenziare. e servono le unità che
compongono il DNA cioè i desossiribonucleotidi trifosfati che trasportano le quattro basi
azotate adenina timina guanina e citosina si aggiunge infine una piccola quantità di nucleotidi
modificati la modifica riguarda lo zucchero che compone il nucleotide rispetto ai
desossiribonucleotidi manca il gruppo sedrine in posizione 3 primo come Vedremo tra poco la
chiave del metodo di sequenziamento è proprio in questa piccola differenza il nucleotide
modificato ha anche un'altra particolarità è legato marcatore fluorescente indispensabile per
poter vedere il risultato si usano marcatori fluorescenti di quattro colori diversi uno per
ciascun tipo di base azotata completata la miscela si avvia la sintesi di un nuovo filamento di
DNA la DNA polimerasi si lega il primer e aggiunge un nucleotide alla volta sempre
rispettando la regola della complementarietà delle basi il nuovo filamento si allunga finché
sono aggiunti i nucleotidi normali Ma quando ne inserito uno modificato la sintesi si arresta la
mancanza del gruppo sideri Le impedisce infatti la formazione di un legame con il nucleotide
successivo e provoca il distacco della DNA polimerasi il risultato di questa fase è la formazione
di un frammento di DNA A doppio filamento che all'ultimo nucleotide marcato l'interruzione
della sintesi è l'evento cruciale del metodo di Sanger e perciò è chiamato metodo e
terminazione di catena l'inserimento di un nucleotide modificato è dovuto al caso per cui
anche la lunghezza del filamento sintetizzato risulta casuale ma se la sintesi avviene tante
volte grazie alle copie prodotte con la PCR avremmo filamenti di tutte le lunghezze possibili di
poche basi o lunghi quanto l'intera porzione di DNA da sequenziare nella fase successiva si
viene atura nuovamente il DNA i singoli filamenti vengono quindi sottoposti ad elettroforesi
capillare con questa tecnica la miscela inserita in un capillare a cui è applicato un campo
elettrico i frammenti di DNA grazie alle loro cariche negative cominciano a migrare verso il
polo positivo i più corti migrano più velocemente quindi possiamo confrontare la lunghezza
dei frammenti in base alla loro velocità al termine della corsa elettroforetica un laser eccita i
marcatori fluorescenti legate nucleotidi modificati è un rivelatore Registra il tipo di luce
emessa abbiamo così tutti gli elementi per ricostruire la sequenza a ciascuno dei quattro
colori corrisponde una diversa base azotata la sequenza così ottenuta è complementare alla
sequenza che si voleva conoscere. lo stesso procedimento può essere usato per ottenere la
sequenza di un intero genoma per far ciò il genoma e prima frammentato è il sequenziamento
eseguito sui singoli frammenti i risultati sono elaborati da un software che trova i punti di
sovrapposizione e ricostruisce la sequenza completa anche in questo caso la sequenza che si
ottiene è complementare alla sequenza ricercata