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Le attività di sorveglianza dell’influenza si svolgono nell’ambito della rete mondiale


dell’Organizzazione mondiale della Sanità (OMS) costituita da 146 Centri Nazionali Influenza (NIC)
e da laboratori di riferimento internazionali. Strategicamente, questa rete sta assumendo sempre
più un ruolo di rete di riferimento anche per la sorveglianza di altri virus respiratori emergenti.
Pertanto i Centri Nazionali Influenza sono laboratori di riferimento per l’influenza stagionale e per
influenza causata da virus animali con potenziale pandemico come i virus H5, H7 e H9; e sono
anche laboratorio di riferimento per il MERS-Coronavirus e il nuovo coronavirus SARS-CoV-2

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Le infezioni virali dell’apparato respiratorio sono altamente contagiose e possono essere causate
da diversi agenti patogeni quali: virus influenzale,
il parainfluenza virus, il virus Respiratorio Sinciziale, i Coronavirus, Rhinovirus, Coxsackivirus,
Adenovirus, Bocavirus, Metapneumovirus.
Tra i virus emergenti che possono causare infezioni respiratorie ritroviamo: il SARS-CoV la prima
volta identificato nel 2002; l’Influenza aviaria causata da virus H5N1, H7N9; il MERS-CoV
identificato nel 2012 infine il nuovo Coronavirus denominato SARS-CoV-2

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Come evidenziato al microscopio elettronico, le particelle virali hanno una forma sferoidale con un
diametro di circa 100-160 nanometri. Presentano un envelope lipidico in cui sono ancorate le
glicoproteine di superficie del virus che conferiscono alla particella virale una caratteristica forma a
corona, da cui il nome coronavirus.
Il genoma è costituito da RNA a singola catena a polarità positiva di circa 30 kb.
Il virus contiene 4 proteine strutturali e 16 proteine non strutturali.
L’attacco del virus alla cellula è mediato dall’interazione della proteina Spike con il recettore
cellulare costituito dall’enzima angiotensina convertasi (ACE 2) a cui segue la sua internalizzazione
e fusione con la membrana dell’endosoma tramite attività proteasiche e successivo rilascio nel
citoplasma dell’RNA genomico.
Questo viene immediatamente tradotto nelle poliproteine pp1a e pp1ab poi processate per dare la
replicasi e altre proteine non strutturali responsabili della replicazione del genoma ed espressione
delle proteine strutturali e accessorie preceduta da una trascrizione discontinua di RNA
subgenomici a polarità negativa su cui vengono sintetizzati i relativi RNA messaggeri (mRNAs).
Successivamente le proteine virali si assemblano con l’RNA genomico a cui segue il rilascio di
nuove particelle virali

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I coronavirus appartengono alla famiglia Coronaviridae.
Si distinguono 4 generi: alfacov, betacov, gammacov e deltacov.
6 tipi di Coronavirus causano infezione nell’uomo: 229E, NL63, OC43, HKU1 sono spesso
associati a lievi infezioni del tratto respiratorio superiore mentre SARS-CoV e MERS-CoV sono di
origine animale e responsabili di infezioni con elevata mortalità.
A dicembre 2019 si è aggiunto il nuovo coronavirus identificato il 7/1/2020 e la sequenza
nucleotidica resa disponibile in pochi giorni ha mostrato un’identità genetica di circa 80% con
SARS-CoV-1 precedentemente identificato nel 2002, come evidenziato dall’analisi filogenetica
riportata in diapositiva.

Fonte: EcoHealth Alliance's phylogenetic analysis shows that a novel coronavirus newly spilled
over into humans in China is closely related to SARS CoV (Photo: EcoHealth Alliance) -
https://www.ecohealthalliance.org/2020/01/phylogenetic-analysis-shows-novel-wuhan-coronavirus-
clusters-with-sars

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I protocolli di diagnosi per SARS-CoV-2 sono indicati sul sito dell’OMS e si basano sulla metodica
di real time RT-PCR.

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In questa diapositiva è indicato il protocollo sviluppato da Charitè di Berlino e pubblicato sulla
rivista Eurosurveillance.
E’ basato su un primo test di screening sul gene target E e su un test confirmatorio su gene RdRp o
N.
Nel saggio di real-time RT-PCR vengono inclusi sia controlli negativi che controlli positivi disponibili
sul sito dell’European Virus Archive/EVAg.

Protocolli di Real Time PCR per SARS-CoV-2 indicati dall’OMS al link:


https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-
guidance e con particolare riferimento al protocollo U.S. CDC e al protocollo sviluppato da Charitè,
Berlino, Germania (https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-
7917.ES.2020.25.3.2000045)

• Corman Victor M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR.
Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-
7917.ES.2020.25.3.2000045
• Reusken CBEM, et al. Laboratory readiness and response for novel coronavirus (2019-nCoV) in
expert laboratories in 30 EU/EEA countries, January 2020. Euro Surveill. 2020;25(6):2000082.
doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.6.2000082

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Altro protocollo indicato da OMS è quello sviluppato da CDC USA basato su amplificazione del
gene N che è maggiormente espresso durante la replicazione virale nella cellula. La positività al
test risulta dall’amplificazione di 3 distinti sequenze nucleotidiche del gene N, qui indicate come N1,
N2, N3.

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L’allegato 4 della circolare del Ministero della salute del 22/2/2020 riguarda la diagnostica di
laboratorio. La diagnosi molecolare di infezione da SARS-CoV-2 può essere effettuata dai
laboratori di riferimento regionali e dai principali ospedali individuati dalle regioni utilizzando il
protocollo CDC USA o il protocollo sviluppato da Charitè Berlino sopra indicati

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Sempre nell’allegato 4 sono riportate le informazioni sulla Raccolta e invio di campioni biologici per
la diagnosi di laboratorio.
Per la raccolta dei campioni clinici in accordo alle più recenti indicazioni dell’OMS, si raccomanda
di effettuare la diagnosi di laboratorio del virus SARS-CoV-2 dove possibile su campioni biologici
prelevati dalle basse vie respiratorie, come espettorato, aspirato endotracheale o lavaggi
broncoalveolari.
Se i pazienti non presentano segni di malattia delle basse vie respiratorie, o se la raccolta dei
materiali del tratto respiratorio inferiore non è possibile seppur clinicamente indicata, si raccomanda
la raccolta di campioni prelevati dalle alte vie respiratorie come aspirato rinofaringeo o tamponi
nasofaringei e orofaringei combinati.

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Nella diapositiva riportiamo integralmente la Raccomandazioni per la raccolta dei campioni clinici.
E’ importante sottolineare che in caso di risultato negativo di un test condotto su un campione
clinico da paziente che rientra nella definizione di caso sospetto di infezione SARS-CoV-2, si
raccomanda di ripetere il prelievo di campioni in tempi successivi e da diversi siti del tratto
respiratorio.
Campioni biologici aggiuntivi quali sangue, urine e feci possono essere raccolti per monitorare la
presenza di virus nei diversi compartimenti corporei.
Le indagini sierologiche devono essere condotte su coppie di campioni di siero prelevati in fase
precoce e tardiva a distanza di almeno 2 settimane.
L’evidenza di sieroconversione o un incremento di almeno 4 volte del titolo di anticorpi
neutralizzanti l’infettività è indice di positività al SARS-CoV-2.
Tutti i campioni clinici devono essere immediatamente inviati al laboratorio per la diagnosi
molecolare e la raccolta dei campioni deve avvenire adottando precauzioni e dispositivi di
protezione individuale utili a minimizzare la possibilità di esposizione a patogeni.

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In circolare sono anche riportate le modalità di spedizione del pacco contenente i campioni clinici
utilizzando contenitori adeguati a norma di legge per l’invio di materiale biologico di categoria B
codice UN3373.
È fatto obbligo di utilizzare un triplo imballaggio, formato da un imballo esterno, uno intermedio ed
uno interno a tenuta stagna, conformi alle disposizioni vigenti, in modo da impedire la fuoriuscita
del contenuto anche in caso di incidente durante il trasporto. Il pacco deve essere provvisto di
un’etichetta che riporti i dati (nominativo, indirizzo, telefono, e-mail) del mittente e del destinatario.

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I laboratori che effettuano la diagnosi di laboratorio per SARS-CoV-2 sono:
-l’Istituto Lazzaro Spallanzani che in qualità di istituto nazionale delle malattie infettive è stato di
supporto nelle prime fasi dell’emergenza per diverse regioni
-i laboratori di riferimento regionali della rete Influnet che svolgono normalmente attività di
sorveglianza virologica dell’infuenza
-e i laboratori individuati dalle Regioni.

L’Istituto Superiore di Sanità ha il compito di effettuare la conferma della diagnosi e di segnalare i


casi confermati al Ministero della salute, inoltre, ha il compito di inviare di un numero
rappresentativo di campioni ai laboratori internazionali di riferimento.
Il Ministero della salute invia la notifica dei casi confermati a organismi internazionali sanitari OMS
e ECDC.

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La rapida e precoce identificazione dei soggetti infetti è fondamentale per attuare immediate misure
di controllo al fine di prevenire e controllare la diffusione del virus nella popolazione

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Questa FAD è realizzata durante l’epidemia. Poiché si tratta di una situazione in evoluzione le
informazioni potrebbero non risultare sempre allineate con i dati e le informazioni più recenti
disponibili.
Per tenersi quotidianamente aggiornati si rimanda alle fonti ufficiali segnalate.

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