CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

CONCEPTO DE R.F.

Rf es el registro y se define como:

Rf = distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación / distancia que recorre
el disolvente hasta el frente del eluyente

El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra

(tipo de adsorbente, eluyente, así como las condiciones de la placa,
temperatura, vapor de saturación, etc.). Tiene una reproducibilidad de  20%,
por lo que es mejor correr duplicados de la misma placa.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un
pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por
capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta
produciendo “manchas” de los componentes.

Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plástico (ej: acetato) ó
metálicos
(ej: aluminio). Los tamaños de la placa para CCf convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x
2.

Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar la identificación

de
las muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloridos se
requerirán técnicas de revelado.

Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina.

-éter de petróleo
-tolueno
-dietil-éter, t-butil-éter
-diclorometano
-acetato de etilo
-n-pentano, n-hexano
-ciclohexano
-tetracloruro de carbono
-éter dietílico
-cloroformo
-acetona
-iso-propanol
-etanol
-metanol
-ácido acético
REVELADORES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden
revelarse mediante:
 Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una
fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó F366), el
número que aparece como subíndice nos indica la longitud de onda de
excitación del indicador utilizado.
 La introducción de la placa en vapores de yodo.
 El rocío con una solución de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento
especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases).
 Después calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero hasta
carbonizar los compuestos.

ADSORBENTES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

a) Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas

Para la selección del adsorbentes deber tomar las siguientes consideraciones:

a) Polaridad
b) Tamaño de partícula
a. Diámetro
b. Área
Superficial c)
Homogeneidad
d) Pureza

FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA

DE CAPA FINA.

a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la fase

estacionaria.
b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.
c) Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con grasa o
agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala,
éstas deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y
después dejar secar completamente antes de aplicar la muestra.
d) Pureza de los disolventes.
DESARROLLO EXPERIMENTAL

MATERIAL POR ALUMNO

Placas para cromatografía (portaobjetos) 6

Matraces Erlenmeyer de 10 mL o viales 5
Pipeta graduada de 10 mL 2
Probeta de 25 mL 1
Frasco cámara 5
Agitador de vidrio 1
Capilares 3
Lámpara de luz ultravioleta 1

SUSTANCIAS Y REACTIVOS

p-Hidroxiacetanilida Acetona
m-Nitroclorobenceno Acetato de etilo
Benzoina Yodo
Hexano Sulfato de sodio anhidro
Metanol Acetominofen
Etanol Acido acetilsalicilico
Nipasol Cafeina
Nipagin

PROCEDIMIENTO

EXPERIMENTO 1: POLARIDAD DE LAS SUSTANCIAS.

Es un experimento comparativo en el que se desea saber cuál sustancia es más polar

y cuál menos polar. Para ello se le proporcionará a usted las soluciones 1 y 2.
Prepare 3 cromatoplacas (Nota 1) y aplique estas soluciones en cada una de ellas
(Nota 2), de tal manera que queden como se indica en la siguiente figura:

Solución Solución 2
1
Eluya la primera cromatoplaca con hexano, la segunda con ACOEt y la tercera
con
MeOH.
En cada caso, una vez que se ha eluído cada placa, sacar de la cámara de elución
y dejarevaporar el eluyente para posteriormente revelar con luz ultravioleta y
posteriormente con yodo, observe y anote sus resultados (Nota 3), luego revele
con yodo, observe nuevamente.

EXPERIMENTO 2: PUREZA DE LAS SUSTANCIAS.

Se desea saber cuál sustancia es pura y cuál es impura. Para ello se le proporcionará a
usted las soluciones 3 y 4.
Prepare una cromatoplaca y aplique en ella ambas soluciones por separado, como en
el experimento anterior. Eluya entonces con AcOEt. Revele con luz U.V. y
posteriormente con yodo. Anote sus observaciones. Conteste:

¿Cuál es la sustancia pura (solución 3 ó 4)? , ¿cuál es la impura? , ¿Cuál es el Rf de

cada componente?

EXPERIMENTO 3: INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN.

Se desea saber cuál es el efecto de la concentración de una sustancia en c.c.f. Para ello
se le proporcionará a usted la solución 5.
Prepare una cromatoplaca y en ella haga 3 aplicaciones de esta solución en
orden
creciente de concentración como se indica en la siguiente figura:

1a. aplicación, 1 gota

2a. aplicación, 3 gotas

3a. aplicación, 6 gotas

Eluya entonces con AcOEt. Revele con luz U.V y. posteriormente con yodo. En
cada
caso observe la intensidad de la coloración de las manchas.
¿Cuál es la relación que existe entre la intensidad de la coloración de las manchas y la
concentración de la sustancia, en cada caso?
EXPERIMENTO 4: LA C.C.F. COMO CRITERIO PARCIAL DE IDENTIFICACIÓN
(SELECCIONAR UNA OPCIÓN)

1. Se desea identificar los componentes de una mezcla, por medio de su

comportamiento c.c.f. y comparándolo con el de sus sustancias testigo bajo
las mismas condiciones experimentales.
Para ésto, se le proporcionará a usted las soluciones 6A y 6B, (Nota 5).
Prepare dos cromatoplacas y en ambas haga las siguientes aplicaciones:

Solución 6A
Solución mezcla (1:1) de 6A +
6B Solución 6B

Luego eluya una de las cromatoplacas con AcOEt revelando con luz U.V. y
después con yodo. Anote sus observaciones..
La otra cromatoplaca elúyala varias veces (4 por lo menos) con un
eluyente
menos polar, por ejemplo una mezcla de hexano-AcOEt (4:1), dejando secar
la
placa entre una elución y otra. Observe la placa a la luz U.V. después de cada
elución. Si después de la cuarta elución la mezcla no se separa, siga eluyendo
hasta la separación.
Finalmente revele con yodo. Anote sus observaciones.
2. Se desea identificar el principio activo de un medicamento comercial, por medio de
su comportamiento en c.c.f., comparándolo con un estándar bajo las mismas
condiciones experimentales. Para esto, se le proporcionará una muestra problema de
de un analgésico comercial, el cual se identificará por comparación con las siguientes
soluciones estándar: A (ácido acetilsalicílico), B (cafeina) y C (acetaminofen)
(Nota
5).
Prepare dos cromatoplacas, aplique los estándares de dos en dos y eluya con
hexano, con ACOEt y con hexano-AcOEt (1:3) y revele con luz U.V. o con yodo.
Calcule el Rf de cada una de ellas, y seleccione el eluyente ideal

Solución estándar A
Solución estándar B
Solución estándar C
Prepare tres cromatoplacas, aplique cada estándar y su muestra problema, como se
muestra:

Estándar Muestra
A problema

Eluya cada placa con el eluyente ideal y revele con luz U.V. y posteriormente con yodo.
Anote sus observaciones.
Finalmente identifique que compuesto contiene el producto comercial que se
le proporciono.

Notas:

1) Para preparar las cromatoplacas se introducen dos portaobjetos juntos, limpios y

secos, en una suspensión de gel de sílice al 35% en AcOEt.
Para mayor facilidad se pueden usar cromatofolios comerciales.
2) Para aplicar las soluciones a las cromatoplacas utilice capilares, que previamente
deber ser estirados en la flama del mechero con el fin de que tengan el diámetro
adecuado. Ver figura.
3) Precaución, nunca mire directamente la luz ultravioleta, ésta puede causar daños
severos al ojo. Una vez revelada la placa, marque ligeramente con un lápiz el
contorno de las manchas para mejor ubicación de las mismas.
4) Para mayor claridad de los resultados, incluya en su informe los dibujos de las
cromatoplacas de todos los experimentos de esta práctica. Hágala del mismo
tamaño de las placas.
5) En este caso son soluciones estándar de productos puros.

Preparación de las micropipetas Aplicación de la muestra en la cromatoplaca

 Placa

Papel filtro

Punto de aplicación

Disolvente

Frente del eluyente

Frasco de elución Revelado con luz UV

MANEJO DE RESIDUOS
Los residuos generados en este experimento son:

RESIDUOS CANTIDAD
D1. Hexano
D2. Acetona
D3. Metanol
D4. Acetato de etilo
D5. AcOEt-Hexano
D6 Capilares
D7. Silica gel de placa

D1 a D5: Guardar los disolventes para recuperarlos por destilación

D6: Empacar cuidadosamente para incineración.
D7: Se puede recuperar para su reuso, previo lavado y secado
Proceso de Adsorción

La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas
electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrógeno, efectos inductivos, etc). Luego,
cuando la capa es expuesta a un flujo por acción capilar, se inicia una competencia de enlaces
entre los sitios activos del adsorbente y la substancia con el solvente

Adsorbentes
Los adsorbentes más utilizados en la Cromatografía de Capa Fina son:
• Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

• Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)

• Tierra Silícea ó Kieselguhr

• Celulosa (Nativa o micro-cristalina)

• Poliamidas

Estos adsorbentes deber tener las siguientes características:

• Tamaño de Partícula

o Volúmen de Poro

o Diámetro de Poro

o Área Superficial

• Homogeneidad
• Pureza
Preparación de la Placa Cromatográfica

Se usan como soporte del adsorbente láminas de: Vidrio, Plástico ó Metálicos (ej: Aluminio)
Los tamaños de la placa para TLC convencional son : 20 cm x 20 cm; 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2
cm
Hay placas que contienen un indicadorr de Fluorescencia : F254 ó F366. El número que apararece
como subíndice nos indica la longitud de onda de excitación del indicador utilizado

Aplicación de la muestra

La muestra se aplica en la placa según el objetivo: Analítico ó Preparativa en:

• Banda
• Punto ó Mancha
Desarrollo de la Placa

Es un proceso mediante el cual son tranportados a través de la fase estacionaria por la fase móvil.

Elección del Solvente

Cámaras para Desarrollo

Existen varios tipos de cámaras:
• Normal

• Doble Compartimiento

• Sandwich

• Horizontal

• Vario KSU

Detección ó Visualización

Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de métodos que nos permitan

visualizar el(los) componente(s) presentes. También se conoce este procedimiento como
Revelado.

Estos métodos son:

 • Químicos (por inmersión o rociado). Se obtienen derivados coloreados o
fluorescentes

• Físicos (ópticos). Generalmente se utiliza radiación UV

Evaluación de un Cromatograma de Capa Fina

Análisis Cualitativo

• Medida de Rf

• Comparación Visual de Color/Intensidad

• Propiedades UV/IR/MS/NMR

Análisis Cuantitativo

• Semi-cuantitativo

o Comparación visual del diámetro y la intensidad del color de la mancha

contra una serie de manchas patrones de concentración conocida

• Cuantitativo

o Indirecta

o Directa

 Densitometría

 Medida de Transmisión. Medida de luz transmitida a través

de la substancia.

 Medida de Emisión. Medida de luz reflejada desde la

substancia

 Espectrofotometría

 Fluorescencia

 Fluorescencia con "quenching"

PROCEDIMIENTO:

1. 1. Teniendo mucho cuidado de no tocar la superficie de la placa de silicato

con sus dedos, tome la suya y colóquela sobre la mesa. NO TOQUE LA PARTE
DE LA PLACA CON EL POLVO DE SILICATO. SUS DEDOS TIENEN SUSTANCIAS
QUE SE ADHIEREN A LA SUPERFICIE DEL SILICATO Y AFECTARA LA
VISIBILIDAD DE LAS MUESTRAS.
2. 2. Haga una marca con lápiz a un centímetro del borde inferior de la placa
de silicato, en los bordes laterales. Haga otra marca a 10 cm arriba de la
marca inferior. Estas servirán de guía para colocar sus muestras y hasta
 dónde dejará correr la cromatografía. No use tinta porque esta se
correrá con el solvente. No raye la placa de lado a lado: esto
interferirá con el movimiento del solvente, al interrumpir la
continuidad de la fase estacionaria.
3. 3. Utilizando la guía plástica para colocar muestras, coloque 2 μl de cada
una de las muestras individuales (los estándares y la mezcla desconocida)
sobre la placa de silicato. Si no tiene la guía, coloque las muestras a 1cm del
borde inferior de la placa, usando de guía la marca que hizo a lapiz.
Mantenga una separación de 1.5 cm entre las muestras. Quedarán unas
manchitas de humedad sobre el silicato. Identifique cada uno de los
puntos: numere el orden de cada mancha. Anote en su libreta los
estándares usados según el orden en que colocó en el silicato, y la
posición de su desconocido.
4. 4. Coloque la placa de silicato, SIN la guía plástica, en el horno por 5
minutos, para secarla.
5. 5. Saque la placa, deje que se enfríe y repita el procedimiento de muestreo
como en el paso 2. Esto le permitirá concentrar sus muestras para que los
puntos se vean más claros. Asegúrese de que la segunda muestra que
coloca en cada punto es la misma que en el primer muestreo. NO LAS
MEZCLE.
6. 6. Luego se secar al horno y dejar enfriar, coloque las placas en el tanque
desarrollador con solvente. El solvente debe tener menos de 1 cm de
profundidad para que no entre en contacto directo con las muestras. Tape el
tanque porque el solvente es bastante volátil y se evapora con facilidad.
7. 7. Deje que el solvente suba por capilaridad hasta unos 10 cm del punto
donde usted colocó las muestras. (Hasta la marca superior.)
8. 8. Si por falta de tiempo no se puede esperar hasta que el solvente llegue
a 10 cm, marque con lápiz hasta dónde subió el solvente.
9. 9. Seque en el horno por 5 minutos.
10. 10. Saque, deje enfriar y rocíe con ninhidrina. Esta es una sustancia que se
adhiere a los aminoácidos y los tiñe. Tenga cuidado al rocear la ninhidrina o
se mancharán las manos por varios días.
11. 11. Coloque de nuevo en el horno por varios minutos hasta que note
manchas de colores.
12. 12. Mida la distancia recorrida por cada mancha desde el lugar donde colocó
la muestra hasta el centro de la mancha de color.
13. 13. Como marcó el punto de origen y el punto hasta donde corrió el
solvente, mida esta distancia también.
14. 14. Anote el color de cada una de las manchas.

RESULTADOS:

1. 2. Calcule en Rf de cada muestra estándar y determine cuál(es) es (son) el

(los) desconocido(s) de su muestra.
Rf = Distancia corrida por la muestra
Distancia solvente