TÉCNICAS DE VISUALLIZACIÓN MICROSCÓPICA DE

MICROORGANISMOS. EXAMEN EN FRESCO. TINCIONES:

CLASIFICACIÓN Y APLICACIONES.

1.- TECNICAS DE VISUALIZACION MICROSCOPICA DE

MICROORGANISMOS
1.1.- INTRODUCCION. EXAMEN DE LOS
MICROORGANISMOS VIVOS.
1.1.1.- EXÁMEN EN FRECO
1.1.1.1.- PREPARACIONES HÚMEDAS.
1.1.1.2.- PREPARACION DE LA GOTA PENDIENTE.
1.1.1.3.- EXAMEN EN FRESCO CON NIGROSINA
1.1.2.- COLORACIONES VITALES

2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS.

2.1.- FASES DE LAS TINCIONES
2.1.1.- CONFECCIÓN DEL FROTIS
2.1.2.- SECADO.
2.1.3.- FIJACIÓN.
2.1.4.- COLORACION.
2.1.5. LAVADO Y SECADO.

2.2.- CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES

2.2.1.- TINCIONES SIMPLES
2.2.2.- TINCIONES DIFERENCIALES.
2.2.2.1.- GRAM.
2.2.2.2.- ZHIEL-NEELSEN
2.2.3.- TINCIONES ESTUCTURALES.
2.2.3.1.- TINCIONES DE FLAGELOS.
2.2.3.2.- TINCION DE ESPORAS
2.2.3.3- TINCION DE CAPSULAS
2.2.3.4.- TINCION DE CORPUSCULOS
METACROMÁTICOS.

3.- TINCIONES ESPECIALES

3.1.- TINCION DE NARANJA DE ACRIDINA
3.2.- TINCION DE RODAMINA-AURAMINA.
3.3.- TINCION DE CALCOFLUOR

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1.- TECNICAS DE VISUALIZACION MICROSCOPICA DE
MICROORGANISMOS

1.1.- INTRODUCCION. EXAMEN DE LOS MICROORGANISMOS

VIVOS.

EL examen microscópico nos informa de la presencia o no de

las bacterias, de su morfología, de sus características tintoriales etc.
Es el primer paso que nos permitirá orientar el resto del examen para
una perfecta identificación del agente etiológico de la enfermedad.

Para el estudio microscópico de los microorganismos, existen

métodos muy diferentes, cada uno de los cuales nos va a
proporcionar información sobre distintos aspectos y propiedades de
los microorganismos. Dependiendo del objetivo que se pretenda
alcanzar, se seleccionará un método u otro. Se denomina observación
vital, al tipo de examen que se utiliza para la investigación de los
caracteres principales del microorganismo (movilidad bacteriana,
morfología, estructura, observación de huevo, etc.).

Los métodos que se emplean para este tipo de examen son:

Examen en fresco:
Preparaciones húmedas.
Método de la gota pendiente
Examen en fresco con nigrosina
Coloraciones vitales.

1.1.1.- EXÁMEN EN FRECO

La mayor parte de estas observaciones se realizan mediante la
microscopia de campo claro, aunque la utilización de microscopia de
contraste de fases, puede facilitar la visualización de los
microorganismos. Las preparaciones deben de obtenerse de material
clínico fresco o de cultivos recientes (24 horas) y realizados en
medios adecuados.

Muestras como sedimentos urinarios, esputos o exudados

pueden utilizarse directamente, mientras que si el material es
demasiado espeso se puede diluir con solución salina estéril. La
preparación se observa al microscopio con objetivo de inmersión y
con poca intensidad de luz para facilitar la observación microscópica

1.1.1.1.- PREPARACIONES HÚMEDAS.

Se obtienen colocando una gota de liquido que contienen los

microorganismos sobre un portaobjetos (limpio y seco), sobre el que
recoloca un cubreobjetos. Si se parte de un producto sólido, se
deposita primero una gota de agua estéril o solución salina

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estéril sobre el portaobjeos, para posteriomente, con ayuda del asa
de siembra
(Previamente flameada y enfriada) realizar una suspensión del
producto.

1.1.1.2.- PREPARACION DE LAGOTA PENDIENTE.

Se utilizan portaobjetos especiales con una o varias

excavaciones, se coloca una gota de la suspensión en el centro de un
cubreobjetos (limpio y seco) con un asa previamente estéril. A
continuación, recoloca el porta sobre el cubreobjetos, de forma que la
gota queda suspendida con el centro de la excavación. Después se le
da la vuelta rápidamente al portaobjetos manteniendo el cubre en su
posición.

El tamaño de la gota debe de ser el adecuado, para evitar una

rápida evaporación, y lo suficientemente pequeña para evitar un
contando con el portaobjetos.

1.1.1.3.- EXAMEN EN FRESCO CON NIGROSINA

Mediante este método, se obtienen imágenes en las que se destacan

las bacterias.

1.1.2.- COLORACIONES VITALES

Se definen como montajes de materia viva teñidos, suelen
utilizarse para ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo
neutro, verde de Jano) a muy bajas concentraciones (1/1000,
1/10000). Su objetivo es el de facilitar la observación, mediante el
colorante, la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar
alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

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2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS.

Este tipo de de preparaciones con las mas frecuentes, tanto las

obtenidas directamente a través de muestras clínicas como las
obtenidas a partir de cultivos bacterianos.

2.1.- FASES DE LAS TINCIONES

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada

y coloreada son: confección del frotis, secado, fijación y coloración.

2.1.1.- CONFECCIÓN DEL FROTIS

Puede preparase a partir de productos líquidos o sólidos:
Productos sólidos, se pasa sobre la superficie del
portaobjetos el hisopo con el que se ha tomado la
muestra. También se puede preparar una suspensión del
material en una gota de agua o solución salina
previamente colocada en el portaobjetos.
Productos líquidos, para la preparación del frotis, se
coloca sobre el portaobjetos una gota del material y se
extiende con el asa de siembra.

2.1.2.- SECADO.
Se dejara secar el frotis a temperatura ambiente. Para ello, se
puede agitar varias veces el porta al aire hasta comprobar su secado.

2.1.3.- FIJACIÓN.
Tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del
material a estudiar en un estado lo más próximo al estado vivo. Las
formas más habituales de fijación son:
Por el calor, se pasa varias veces, la parte inferior de la
preparación por la llama azul de un mechero BUNSEN,
hasta que se note caliente al colocarlo en el dorso de la
mano, sin que queme.
Alcohol en frió, se cubre la preparación con etanol o
metanol. Se deja actuar durante varios minutos, se
escurre y se deja secar.

2.1.4.- COLORACION.
Es el proceso de coloración de los microorganismos, para
teñirlos existe un gran número de productos químicos con
propiedades colorantes. Su elección está condicionada al tipo de
tinción a realizar.

2.1.5. LAVADO Y SECADO.

El lavado es la eliminación del exceso de colorante. Para el
lavado se utilizará el frasco lavador, teniendo precaución de no dirigir

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el chorro directamente al frotis. El secado se sitúa la preparación en
posición inclinada y al aire.

2.2.- CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES

Se sigue la siguiente clasificación, atendiendo a su

especificidad:
Tinciones simples
Tinciones diferenciales
Tinciones estructurales

2.2.1.- TINCIONES SIMPLES

Las tinciones simples son aquellas en las que se utilizan un solo
colorante y tienen como objetivo permitir la observación de la
morfología bacteriana. Existen dos clases, azul de metileno y verde
malaquita.

2.2.2.- TINCIONES DIFERENCIALES.

Son aquellas que permiten diferenciar a las bacterias
atendiendo a su afinidad por el colorante (se emplean dos tipos de
colorante), tenemos dos tipos GRAM y ZHIEL-NEELSEN.

2.2.2.1.- GRAM.
Esta coloración fue desarrolladas, en 1983, por Christian Gram
y es la coloración diferencial mas utilizada en microbiología Por medio
de ella, se dividen a los microorganismos en dos grandes grupos,
grampositivos y gramnegativos, según retengan o no el primer
colorante (cristal violeta) utilizado en la tinción.

El fundamento de esta técnica es tratar a las bacterias una vez

realizado el frotis correspondiente con cristal violeta y una solución de
yodo, todas ellas se van a teñir de un color violáceo, al unirse el
colorante al yodo de la pared celular. Si a continuación se les trata
con una solución de decolorante (alcohol-cetona), las bacterias
grampositivas retendrán el colorante, debido a la composición de su
pared, mientras que las gramnegativas no lo retienen, siendo
eliminado el colorante. Si a continuación, se les trata con un
colorante de contraste (fucsina diluida, también se puede emplear
safranina), las bacterias gramnegativas serán teñidas por él. La
tinción Gram, puede utilizarse no solo para bacterias procedentes de
las colonias aisladas, sino para el examen directo de muestras
clínicas, de tal modo que se puede evaluar la flora que predomina en
esa muestra.

En la tinción de Gram, se forma un complejo de cristal de iodo

insoluble en el interior de la célula, que en el caso de las Bacteria
Gram negativas puede extraerse con alcohol pero no en las Bacteria

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Gram positivas. El alcohol deshidrata las bacterias Gram positivas que
poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de
peptidoglicano. El resultado es el cierre de los poros de las paredes
impidiendo el escape del complejo de cristal de iodo insoluble.

En las Bacteria Gram negativas, el alcohol penetra rápidamente en

la capa externa que es rica en lípidos sin que la fina capa de
peptidoglicano evite el paso del solvente, permitiendo de este modo
la eliminación del complejo de cristal de iodo insoluble. No obstante,
la reacción de Gram no se relaciona directamente con la química de la
pared celular puesto que las levaduras que poseen una gruesa pared
celular pero una composición química completamente distinta,
también se tiñen como Gram positivas. Por lo tanto, el motivo de una
reacción Gram positiva no son los constituyentes químicos sino la
estructura física de la pared.

Reactivos:
 Cristal violeta
 Lugol
 Alcohol-cetona
 Safranina

Técnica
 Preparar los frotis bacterianos.
 Teñir con cristal violeta 2 min.
 Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
 Cubrir con Lugol 1 min.
 Lavar con agua el exceso de Lugol.
 Decolorar con alcohol hasta que la preparación deje de
perder color (30 segundos)
 Lavar con abundante agua para eliminar el resto de
disolvente.
 Teñir con fucsina básica 5 min.
 Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
 Secar la preparación.
 Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color
de cada preparación.
Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos.
Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar la
tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados
en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos.
En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los
colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de los dos
tipos (grampositivas y gramnegativas) para ajustar así los tiempos y
tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se
hagan mientras duren esos colorantes son fiables.

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 Se observa al microscopio con objetivo de 40x, los bacterias
grampositivas, se teñirán con el primer colorante (cristal violeta),
mientras que las gramnegativas lo harán de color rojo (Safranina).

2.2.2.2.- ZHIEL-NEELSEN
La tinción del Zhiel-Neelsen o de Bacilos Ácido Alcohol
Resistentes (BAAR) se utiliza para diferenciar las bacterias ácido
alcohol-resistentes de las que no lo son, esta diferenciación viene
dada por la existencia de un componente en la pared de la bacteria
(ácido teicoico, es un ácido graso de cadena larga) que permite
soportar la decoloración ácida de la tinción. Esta tinción requiere un
previo calentamiento del frotis, para que el colorante pueda atravesar
la pared de la bacteria y se quede fijado a los componentes de ella.

Reactivos:
 Fucsina fenicada de Zhiel-Neelsen
 Solución de decolorante alcohol clorhídrico
 Azul de metileno fenicado.

Técnica
 Una vez preparado y fijado el frotis por calor, se cubre
con la fucsina fenicada y se caliente mediante una llama,
hasta la emisión de vapores.
 Se lava con agua destilada.
 Se cubre el portaobjetos con la solución decolorantes
durante un minuto y se escurre el porta.
 Se lava con agua y se elimina el exceso.
 Se cubre con el colorante de contraste y se deja actuar
un minuto
 Se lava con agua deshilada y se elimina el resto
 Se seca al aire.

Se observa al microscopio con objetivo de inmersión. Los

bacilos ácido-alcohol resistentes aparecen coloreados en rojo sobre el
fondo azul de la preparación.

2.2.3.- TINCIONES ESTUCTURALES.

Son aquellas que utilizan más de un colorante y sirven para
poner de manifiesto distintas estructuras bacterianas. Existen
distintos tipos: flagelos, esporas y cápsulas y corpúsculos
metacromáticos.

2.2.3.1.- TINCIONES DE FLAGELOS.

Para su observación, se debe de partir de cultivos jóvenes (6 y

12 horas). En la preparación del frotis, deben de emplearse
portaobjetos nuevos, limpios y tratados con una mezcla sulfocrómica

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y perfectamente aclarados con agua destilada. Existen tres tipos de
tinciones: Rhodes, Tribondeau y Leifson.
Rhodes:
Los reactivos son el mordiente de Rhodes y el nitrato de plata
amoniacal. Los flagelos se pueden observar gracias al
precipitado negro que se ha depositado en torno a la
estructura.
Tribondeau.
Como reactivos se emplean el mordiente de Tribondeau y
solución violeta de cristal, la visualización de los flagelos es de
de color castaño.

Leifson.
Como colorante se unas el Leifson., los flagelos se observan
de color rojo a azulnegruzco.

2.2.3.2.- TINCION DE ESPORAS

Las esporas son la forma de resistencia de las bacterias, tienen

forma esférica u oval. Al microscopio sin teñir, presentan una
estructura de granulo brillante. Según la localización de la espora
puede ser: central subterminal y terminales (en el centro, próxima al
extremo y al final del extremo de la bacteria), lógicamente la esporas
solo lo formaran estructuras bacilares. Existen dos tipos de tinciones:
Moeller y Wirtz-Conklin.
Moeller
Como reactivos se emplean, solución acuosa 5% de ácido
crómico, fucsina fenicada de Zhiel-Neelsen, solución acuosa
de clorhidrato de anilina 5%, solución de azul de metileno y
alcohol absoluto.Las esporas se observan con objetivo de
inmersión y se visualizando color rojo o rosado y las bacterias
de color azul.
Wirtz-Conklin
Los reactivos empelados son, solución acuosa de verde
malaquita 5% y solución acuosa de safranina al 0,5%. Se
observaron objetivo de inmersión y las esporas e habrán
teñido de verde y las bacterias de color rojo intenso.

2.2.3.3- TINCION DE CAPSULAS

La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa que

envuelve la pared celular o de algunas bacterias. Esta compuesta de
polisacáridos, mucopolisacáridos o

polipéptidos. A consecuencia de su elevado contenido en agua, se

tiñen débilmente por los colorantes. Hay dos técnicas Hiss y tinta
china

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 Hiss.
Como reactivos se emplean solución acuosa de cristal violeta
1% y solucion acuosa de sulfato de cobre 2%.Las cápsulas se
observancion objetivo de inmersión y las cápsulas se
visualizaran de azul pálido y las bacterias de color púrpura y
el fondo claro.
Tinta china.
Cono reactivos tenemos, solución de fucsina diluida y
nigrosina o tinta china. Se observa al microscopio con objetivo
de inmersión y se visualizan las bacterias teñidas de rojo por
la fucsina y la cápsula será un halo blanco que las envuelve.

2.2.3.4.- TINCION DE CORPUSCULOS METACROMÁTICOS.

Los corpúsculos metacromáticos son unas estructuras en cuyo

interior llevan fosfato, presentando la particularidad que son muy
afines por colorantes de tipo básico .Las tinciones empleadas son dos,
Albert y Loefller.

Albert.
Como reactivos tenemos, solución de lugol y colorante de
Albert, se observa la extensión con objetivo de inmersión y los
corpúsculos metacromáticos se verán de color oscuro sobre el
cuerpo bacteriano más claro.
Loeffler.
Los reactivos empleados son, solución de azul de metileno de
Loeffler, los gránulos se verán de azul intenso, sobre el fondo
de la célula azul mas claro.

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3.- TINCIONES ESPECIALES

Este tipo de tinciones se emplean para visualizar ciertas

estructuras bacterianas afines con colorantes fluorescentes, es decir
con aquellos colorantes estructuras (fluorocromos) que al excitarse
con luz ultravioleta excitan ciertas moléculas que al volver a su
estado normal liberan ese estado de energia como luz visible.

Como tinciones fluorescentes más empleadas tenemos: Naranja

de Acridina y coloración de rodamina-auramina.

3.1.- TINCION DE NARANJA DE ACRIDINA

Esta tinción se utiliza principalmente para el estudio de

microorganimos en hemocultivos y liquido cefalorraquideo (LCR), el
colorante presenta una gran afinidad por el ácido nucleico bacteriano.

3.1.1.- TECNICA
Como reactivos se emplean Naranja de Acridina al 0,01% en
tampón de acetato de pH 4, el procedimiento es el siguiente:
se extiende y se seca la preparación.
se fijan los frotis con metanol o por calor.
se cubre la preparación con el colorante y se deja durante
dos minutos
se lava con agua
se seca al aire.
se examina la preparación con objetivo de inmersión en
microscopio de fluorescencia.
Las bacterias presentan un color naranja brillante sobre un
fondo verdoso u oscuro.

3.2.- TINCION DE RODAMINA-AURAMINA.

Los fluorocromos auramina y rodamina tienen la propiedad de

fijarse a las paredes celulares de las micobacterias, que aparecerán
de color amarillo o naranja brillante sobre un fondo verdoso. Se
utiliza, además un colorante de contraste (permanganato potásico)
que tiene como función evitar la fluorescencia inespecífica.

3.1.2.- TECNICA.
Como reactivos reemplean: solución colorante rodamina-
auramina, solución de colorante, colorante de contraste. El
procedimiento es el siguiente:
se cubre la preparación con el colorante auramina-rodamina,
durante quince minutos
se lava con agua destilada
se cubre la preparación con solución decolorante (alcohol
clorhídrico) dejándose actuar durante dos o tres minutos.

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 se lava con agua destilada
se cubre la preparación con el colorante de contraste y se deja
actuar durante tres o cuatro minutos.
se lava y se deja secar al aire.
Se observa a microscopia de fluorescencia, las bacterias ácido
alcohol resistentes aparecen de color amarillo-naranja sobre un fondo
verdusco.

3.3.- TINCION DE CALCOFLUOR

Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de

calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos
y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este
colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial
de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la
visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de
los hongos. En algunos laboratoríos ha suplantado al azul de
lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz
blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se
utilice.

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