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TINCION DE GRAM

RESUMEN
La tinción de Gram es un procedimiento rápido que se usa para
buscar la presencia de bacterias en muestras y caracterizarlas como
Gram positivas o Gram negativas en base a las propiedades químicas
y físicas de sus paredes celulares. La tinción de Gram casi siempre
debe realizarse como el primer paso en el diagnóstico de una
infección bacteriana. La tinción de Gram se llama así por el científico
danés Hans Christian Gram (1853 – 1938), quien desarrolló la técnica
en 1882 y la publicó en 1884 como una técnica para distinguir entre
dos tipos de bacterias con síntomas clínicos similares: las bacterias
Estreptococos pneumoniae (también conocida como neumococo) y
Klebsiella pneumoniae. La técnica sufrió ciertas modificaciones por
Hucker en 1921 para estabilizar los reactivos y mejorar la calidad de
la tinción, por lo que la tinción de Gram también se conoce como
Gram-Hucker.
Cuando se sospecha una infección bacteriana, la mayor parte de las
muestras recibidas deberán extenderse en lámina portaobjetos y
teñirse con Gram para examinarse bajo el microscopio. El reporte del
Gram orientará al médico sobre qué tipo de microorganismo puede
ser la causa de la infección, antes de obtener el resultado definitivo
del cultivo. En algunos casos la vida del paciente está muy
comprometida, por tanto los médicos necesitan con urgencia el
reporte del Gram para colocar un tratamiento empírico, mientras
esperan la identificación del microorganismo. Por ejemplo, si el Gram
revela que hay cocos Gram positivos en el líquido cefalorraquídeo, el
médico orientará la terapia inicial con antibióticos que eliminen a este
tipo de bacterias, de acuerdo a los protocolos establecidos para ello.
Una vez que llegue el resultado definitivo con el nombre del
microorganismo aislado y su respectivo antibiograma, el médico
evaluará si debe o no cambiar la terapia. Esta decisión la tomará de
acuerdo al estudio de susceptibilidad del microorganismo ante los
antibióticos que está recibiendo y la evolución del paciente.
PALABRAS CLAVE
Tinción, Contratinción, gram positiva, gram negativa
I. OBJETIVOS

 Realizar y aprender la técnica de una Tinción de Gram


 Aprender a diferenciar entre microorganismos gram+ y gram-.
II. INTRODUCCION
Esta es una técnica que presenta 4 pasos fundamentales: tinción,
fijación, decoloración y contratinción. Por tanto, esta técnica además
de colorear a las bacterias, también permite diferenciarlas. El cristal
violeta es el primer colorante utilizado el mismo tiene afinidad por el
peptidoglicano y teñirá de morado a todas las bacterias presentes,
posteriormente se coloca el lugol, que actúa como mordiente, es
decir, inducirá a la formación de complejos insolubles de cristal
violeta, yodo y proteínas ribo nucleares dentro de la célula. Las
bacterias Gram positivas, al tener una pared gruesa de
peptidoglicano, forman más complejos (cristal violetan - yodo), por
tanto retienen el colorante. Además también influye que la pared de
las bacterias Gram positivas contienen mayor cantidad de ácidos no
saturados, los cuales muestran gran afinidad por los agentes
oxidantes (Lugol), Mientras las bacterias Gram negativas poseen una
capa delgada de peptidoglicano lo que hace que las bacterias formen
menos complejos que las Gram positivas. Posteriormente viene el
paso de la decoloración, donde las bacterias Gram positivas y Gram
negativas se comportan de manera diferente, las bacterias Gram
negativas contienen una membrana externa rica en lipopolisacáridos
que forma parte de su pared celular, las grasas son destruidas por el
contacto con el alcohol acetona, por lo que la membrana externa se
desestabiliza, siendo liberado el cristal violeta, es así como luego es
contrateñida con la safranina tomando el color rojo. En el caso de las
bacterias Gram positivas, resisten la decoloración porque el
decolorante actúa cerrando los poros, lo que impide que el complejo
cristal violeta/yodo pueda salirse, Por tanto se mantiene estable la
coloración con el cristal violeta, y no hay cabida para la safranina o la
fucsina. Por esto estas bacterias se tiñen de azul intenso o morado.
III. MATERIALES, REACTIVOS y EQUIPO

 Lamina porta y cubre objetos


 Encendedor
 Marcador indeleble
 Papel toalla
 Palito de dientes
 Mechero Bunsen
 Cristal violeta
 Lugol
 Alcohol acetona
 Safranina
 Aceite de inmersión
 Microscopio óptico
 Nos preparamos para el trabajo de laboratorio

 Nos lavamos las manos


 Nos Colócanos guantes
 amárrate el cabello si lo tienes largo para evitar contaminar la
muestra de bacteria que vayas a analizar, nos colocamos toca.
 Desinfecta un espacio de trabajo debajo

 Recomendaciones

 Antes de comenzar, revisa que el mechero Bunsen y el


microscopio estén operativos.
IV. METODO TECNICA TINCION DE GRAN

 Parte uno

1. Se esteriliza las portas y cubre objetos de vidrio para


microscopio. Desinfectándolos con alcohol al 70 %.
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2. Agregar una gota de agua en el porta objeto, con ayuda de un
palito molda diente tomar una muestra dental de nuestro
compañero y rosamos ligeramente por encima del
portaobjetos, fijamos la muestra por calor, el calor fijará las
bacterias al portaobjetos de forma que no se enjuaguen tan
fácilmente durante la tinción. Pasamos rápidamente el
portaobjetos dos o tres veces por la llama del mechero Bunsen.

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 Parte dos Tinción de Gram

1. Empapamos la muestra con cristal violeta con la ayuda de una


pinceta para empapar la muestra con varias gotas de tinte
cristal violeta, esperamos 60 segundos y procedemos a
enjuagar suavemente el cristal violeta, inclinando el
portaobjetos sobre una placa Petri rociando un pequeño chorro
de agua destilada sobre la parte superior del portaobjetos, el
agua debe escurrirse sobre la superficie de la mancha pero no
estar apuntada directamente a ella.
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2. Empapamos la mancha con lugol, dejamos actuar por un lapso


de 30 segundos y procedimos a enjuagar.

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3. Agregamos un decolorante alcohol acetona para eliminar el
exceso de colorante, dejamos actuar por un lapso de 15
segundos y luego enjuaga rápidamente.
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4. Empapamos la mancha con un colorante de contraste la


safranina para agregar un contraste adicional entre las
bacterias Gram positivas y Gram negativas, tiñendo las
bacterias decoloradas (Gram negativas) de rosado, dejamos
actuar el colorante en la muestra por un lapso de 2 minutos
luego enjuágalo.

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Finalmente secamos nuestra muestra sobre papel toalla o mechero
para proceder a colocar el cubre objetos.
 Parte tres examinar el resultado
1. Preparamos el microscopio óptico limpiamos con xilol para
posteriormente, colocar el portaobjetos bajo el microscopio
óptico. Las bacterias varían en gran medida en tamaño, así que
la magnificación total requerida es 1000x. Agregamos una gota
de aceite de inmersión a nuestra muestra en la porta objeto
para una mayor claridad, movemos suavemente el revólver del
microscopio de forma que la lente objetivo seposicione en su
lugar con un clic.

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V. RESULTADOS

 Luego del montaje al microscopio óptico Podemos observar con


ayuda del profesor la presencia de bacilos gran positivo
 No podemos reconocer más tipos de bacterias porque no son
claras las imágenes de nuestra muestra

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Bacilos Gram positivos (estreptobacilos)
VI. DISCUSIÓN
Pudimos observar con la tinción de gram bacilos gram positivos esto
se debe a que este tipo de bacteria posee una gruesa capa de
peptidoglucano, el cristal violeta penetro, en esta célula, el lugol hizo
que el cristal violeta se fijara intensamente en la pared bacteria de la
célula y se formara un complejo entre los dos. 4

VII. CONCLUSIONES

 Concluimos que la Tinción de Gram permiten es muy


importante porque nos permite el diagnóstico oportuno y
sugerente de los agentes infeccioso y nos ayuda a tomar la
decisión del tratamiento inicial de las enfermedades
infecciosas.

 También concluimos que sería conveniente estandarizar los


tiempos de tinción para cada laboratorio, ya que la calidad y
concentraciones de reactivos pueden variar bastante.
VIII. BIBLIOGRAFÍA

1. Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial


médicopanamericana,2.Jawetz Ernest, Microbiología médica,
17ª edición en español, Manualmoderno, México, México 2002.
2. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Microbiología Médica, 6°edición
McGraw-Hill, New York, U.S.A
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W.
(2004). Diagnóstico Microbiológico. (5ta ed.). Argentina,
Editorial Panamericana S.A.
4. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-
Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Las tinciones
básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en
Discapacidad. 2014; 3 (1):10-18.