UNIVERSITA’ DEL PIEMONTE ORIENTALE

SCIENZE BIOLOGICHE

RELAZIONE DI
BATTERIOLOGIA
APPLICATA

DE BIASIO CHIARA
20020448
SPECIE DI CANDIDA
L'obbiettivo dell'esperimento è la preparazione di terreni di coltura per l'identificazione e
l'osservazione al microscopio ottico ed elettronico di colonie di microrganismi, in particolare della
Candida. I tipi di Candida da osservare sono: C. Albicans, C. Tropicalis, C.Krusei, C.Parapsilosis,
C. Glabrata.

INTRODUZIONE

Il terreno di coltura è il mezzo nel quale può avvenire lo sviluppo e la crescita di un microrganismo.
La sopravvivenza dei microrganismi è legata alla presenza o meno di determinate sostanze, sulla
base delle quali assumono denominazioni differenti. La differenza principale sta nel modo in cui
ricavano energia e quindi nutrimento. Se sono microrganismi in grado di ricavare energia dai raggi
solari, vengono definiti FOTOTROFI. Se invece sfruttano l'energia proveniente dall'ossidazione di
composti chimici sono chiamati CHEMIOTROFI.

Ciò però non è sufficiente per garantire loro la continuità della specie. La crescita microbica, infatti,
dipende da certi parametri ambientali quali:
• TEMPERATURA: psicrofili tra 0-20 °C, mesofili tra 10-50 °C, termofili tra 40-75°C,
ipertermofili tra 70-110°C;
• PH: acidofili con pH 6 <, neutrofili con pH tra 6-8, alcalofili con pH >8;
• OSSIGENO: aerobi, anaerobi, microaerofili.

Quindi per osservarli in laboratorio si devono preparare terreni colturali specifici in ambienti
specifici.
I terreni si possono suddividere in:
• SOLIDI, ovvero quei terreni contenenti agar. L'agar è un polisaccaride estratto dalle alghe
che a temperatura ambiente rende solido il terreno, permettendo al batterio, riproducendosi,
di creare colonie, le quali possono essere facilmente osservate e contate. È importante
ricordare che è una sostanza che gelifica l'ambiente lavorativo e non dà nutrimento.
• LIQUIDI, detti BRODI. Non consentono l'identificazione in base all'osservazione
morfologica né l'isolamento del batterio da eventuali specie contaminanti per altre prove. Un
esempio è il BD Triptic Soy Broth, terreno universale usato principalmente per la coltura di
anaerobi facoltativi.

In alcuni casi si utilizzano particolari tipi di terreni di coltura che facilitano il conteggio, il
riconoscimento o l'isolamento di specifici microrganismi:
• SELETTIVI, i quali favoriscono la crescita di alcune specie batteriche, grazie alla presenza
di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie. In genere si sfrutta l'attività
batteriostatica di sostanze come gli acidi biliari, coloranti come il Cristal Violetto.
 • Ad esempio il Mannitol Salt Agar è un terreno che produce colonie di Staphylococcus
aureus gialle, con viraggio netto da rosa a giallo e inibisce i batteri Gram-. Il terreno Agar
MacConkey, invece, è un terreno che può inibire sia i Gram- che i Gram+. Grazie alla
presenza di lattosio, sali biliari e Cristal Violetto, produce una notevole varietà di colonie
(Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter, ...) che si presentano con colorazioni differenti in
base alle reazioni che si sono innescate.
• ARRICCHITI, che consentono di aumentare la crescita solo di alcune specie batteriche
grazie alla presenza di inibitori che sfavoriscono la crescita di altre. Per sempio Agar Sangue
permette la crescita dello Streptococcus e serve per determinare l'attività emolitica dei
batteri.
• CROMOGENI. Permettono di isolare e differenziare diverse specie. Un esempio di terreno
cromogeno è il CHROMagar Orientation, usato per l'esame delle urine, quindi per
individuare l'E.Coli e l'Enterococcus. Anche la specie Candida predilige il terreno
cromogeno: il CHROMagar Candida.
Il CHROMagar Candida, definito nel suo acronimo come CCA (Cromogena Agar Candida), è un
terreno di coltura microbica selettivo e cromogenico per l'isolamento e la differenziazione delle
specie di Candida rilevanti sotto il profilo clinico. Le sue componenti principali sono:
• PEPTONI, ovvero l'insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od
enzimatica) delle proteine (caseina, soia, ecc.) importanti per il nutrimento delle colonie
• CLORAMFENICOLO, un efficace agente batteriostatico, in quanto è in grado di inibire la
sintesi proteica, bloccando il processo di traduzione degli RNA messaggeri.
• MISCELA CROMOGENI
• MISCELA DI SALI INORGANICI, quali fosforo e potassio
• FATTORI DI CRESCITA e AGAR, per solidificare il terreno

Il CCA presenta inoltre un pH intorno ai 6,0 e gli 0,2. Può essere impiegato con incubazione a 35°C
-37°C e osservato dopo 24/48 ore.
Passate le 24/48 ore si possono osservare le colture delle diverse specie di Candida con le seguenti
caratteristiche:
• C.Albicans. Le colonie si presentano umbonate, con colorazioni verde-blu luccicante, con
forma allungata. Questo tipo di microrganismo è un patogeno opportunista: è saprofita
all'interno del corpo umano, ma in alcune condizioni specifiche può diventare patogeno e
provocare la candidosi. La candidiosi è un'infezione vaginale che può raggiungere,
attraverso l'intestino, il sangue, in cui libera le sue tossine e provoca la candidemia. Di
conseguenza il paziente colpito può essere soggetto a dolori addominali, indigestione, stipsi
o diarrea. I soggetti più a rischio sono donne che somministrano per lungo tempo antibiotici
o che prendono la pillola.
• C.Tropicalis: le colonie hanno colorazioni grigio-blu, con sfumature e aloni viola. È un
fungo meno patogeno della C. Albicans, ma molto resistente alle terapie e richiede una
grossa quantità di ossigeno. Si può trovare in colture miste con la C. Albicans.
• C.Glabrata ha colonie con colorazione rosa-lucida e morfologia piatta e tondeggiante. Si
presenta raramente insieme ad altre colture e spesso può causare la micosi vaginale.
• C. Krusei. Le colonie si presentano nella zona centrale viola e sfumano poi con colorazioni
rosa-viola. Morfologicamente sono lanuginose, larghe, sciamanti. Questo fungo viene
isolato dalla saliva, dalle unghie, dai bronchi, dalle feci e dalla vagina. Negli ultimi anni si è
riscontrato un notevole aumento d'infezioni derivanti da C.Krusei.
• C. Parapsicosis: le colonie sono color crema, poco aggregate tra loro, arrotondate. Si trova
raramente nelle mucose ed è patogeno di un'endocardite fungina.
La selettività del terreno è resa possibile grazie alla presenza del cloramfenicolo, antibiotico
responsabile dell'inibizione della sintesi proteica dei batteri. La differenziazione è ottenuta con una
miscela di composti cromogeni volti ad evidenziare le attività enzimatiche specifiche dei diversi tipi
di Candida.

Al fine di studiare al meglio i microrganismi è necessario ci sia non solo il giusto terreno di coltura,
ma anche la giusta semina. La semina, in microbiologia, è il trasferimento dei microrganismi dal
loro ambiente naturale al luogo in cui verranno analizzati.
Esistono diverse tecniche di coltura in base al tipo di risultato che si vuole ottenere. Quelle utilzzate
per questo esperimento sono essenzialmente due:
• SEMINA A PINO
• SEMINA A QUADRANTI, detta anche per isolamento, poiché ha la funzione di isolare le
colonie batteriche.

ATTREZZATURE UTILIZZATE PER LA PREPARAZIONE DEI TERRENI

STRUMENTI
• Imbuti
• scotch da autoclave: indicatore di sterilità
• scotch da autoclave: indicatore di sterilità
• 6 anse monouso da 10 e 5 da 1 um(microlitro)
• Parafilm
• bilancia tecnica: permette di misurare quantità di sostanza fino a 2000 g circa con sensibilità
0,1-0,01 g
• autoclave: è un apparecchio di sterilizzazione mediante vapore acqueo sotto pressione. Essa
sterilizza terreni di coltura e attrezzature varie. Il ciclo di sterilizzazione richiede un tempo
di 15'a 121°C
• stereomicroscopio: è un tipo di microscopio ottico, usato per studiare le superfici solide di
un campione; solitamente si osserva la luce riflessa dal campione, e non quella trasmessa.
• microscopio ottico tradizionale, che permette, per mezzo di lenti, la visione del campione
illuminato con luce nel campo spettrale del visibile.
• cappa microbiologica, utilizzata in ambito biologico per la protezione dell'operatore e
dell'ambente circostante da agenti patogeni. Inoltre la cappa rende sterile l'ambiente
circostante.
• termostato
• frigorifero

VETRERIA
• 8 flaconi pyrex
• cilindro graduato da 800 ml
• 6 piastre Petri (1 per seminare, 5 per isolare): sono le piastre più diffuse per la crescita dei
microrganismi sui terreni di coltura.
• 5 vetrini porta oggetti e 5 copri oggetti
• soluzione fisiologica in spruzzetta: H2O distillata. La soluzione è composta da acqua e
cloruro di sodio.

MICRORGANISMI UTILIZZATI
• C. albicans
• C. glabrata
 • C. kruzei
• C. parapsilosis
• C. tropicalis
Sospesi in acqua deionizzata.

TERRENO
• CCA

SOLVENTE
• Acqua deionizzata

PROCEDIMENTO

1. In una bottiglia da 500 ml precedentemente tarata sulla bilancia digitale, sono stati sospesi
15,8 g di terreno in polvere CCA (Cromogena Agar Candida).

2. In un cilindro graduato è stata aggiunta 400ml di acqua deionizzata fredda, ovvero

contenente pochi sali, quindi a conduttività maggiore.

3. Una volta che l'acqua è stata misurata nel cilindro graduato ed inserita nella bottiglia, si è
mescolato il tutto e si è passati a sigillare. La bottiglia viene sigillata per mezzo dello scotch
con “bandine” bianche. Esse sono importanti in quanto determinano l'efficacia e il corretto
funzionamento dell'autoclave. Infatti se tutto è andato a buon fine, le bandine da bianche
diventano nere. Questo scotch viene messo sul tappo e sulla bottiglia e su di esso, per mezzo
di un pennarello indelebile, si è scritto l'acronimo CCA. A fine preparazione la bottiglia
viene portata in autoclave e prima di farla partire si è controllato che:
◦ il tappo fosse svitato di un giro
◦ la strumentazione fosse avvolta nella stagnola

4. Poi si è fatta partire l'autoclave utilizzando il programma 3, il quale arriva ad una

temperatura massima di 100°C, e si è scelto di non autoclavare (funzione melting). A questo
punto si è lasciato lì per 15'.

5. Una volta raffreddato è stato colato il composto in circa 20 piastre. Le piastre,

precedentemente sterilizzate, vengono riempite con il terreno CCA e agar liquido. Grazie
all'agar il terreno, raffreddandosi, prende la forma del recipiente in cui si trova. Su di esso
possono essere coltivate colonie cellulari con diverse tecniche. Le piastre sono provviste di
coperchi per far sì che passi l'aria e impedisca il passaggio di altri microrganismi che
potrebbero contaminare il terreno. Una volta che il terreno bollente viene inserito lo si è
lasciato raffreddare in frigorifero con i coperchi rovesciati. Il rovesciamento è fondamentale
in quanto impedisce che la “condensa”, che si forma dal vapore del terreno in
raffreddamento, si aggreghi in goccioline, causando eventuali colonie cresciute su di esso e
quindi contaminando il composto.

6. Una volta raffreddate le 6 piastre vengono siglate e seminate sotto cappa. La semina
utilizzata nella prima piastra è la semina A PINO. Si prende la piastra e con l'occhiello di
un'ansa sterile si prendono 10 um dalla Candida mix, soluzione contente un mix di tutte e
cinque le specie di Candida più soluzione fisiologica da 25ml. Quest'ultima viene adagiata
sulla piastra facendo due movimenti diversi: nel primo movimento si percorre il diametro
della piastra; nel secondo movimento si traccia una linea serpentina ripercorrendo tutto il
 diametro e facendo delle serpentine via via più sciamanti.

PRIMO MOVIMENTO SECONDO MOVIMENTO

7. Finita la semina si mettono le piastre nel termostato a 37 gradi per 24 ore. Il risultato di ciò è
il differenziamento, su ogni punto della semina, di cinque colori diversi, nonché i cinque
gruppi diversi di Candida.

8. A questo punto si isolano, nelle 5 piastre rimanenti, le cinque specie di Candida, utilizzando
la semina A QUADRANTI. Questa è la tecnica più frequentemente utilizzata per ottenere la
crescita di colonie separate. Lo striscio avviene mediante utilizzo di un'ansa sterile (bisogna
evitare contaminazioni crociate con altri microrganismi presenti sulla superficie di tale
oggetto). Prevede una serie di semine in differenti aree della superficie dell’agar, in modo da
disperdere le varie cellule presenti sull'ansa (prelevate da brodocoltura o da altra crescita su
agar). Si preleva per ogni piastra 10 um di Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis,
parapsilosi) e si effettua la semina.
 9. Fatto ciò si incuba nel termostato a 37 gradi per 24 ore tutte e 5 le piastre.

10. Passate le 24 ore si osserva la morfologia delle colonie allo stereomicroscopio e quella delle
singole cellule al microscopio ottico.
◦ Per l'osservazione allo stereomicroscopio è sufficiente togliere il coperchio della
piastra e posizionarlo alla base.
◦ Per l'osservazione delle singole specie di Candida c'è bisogno di preparare cinque
vetrini:
▪ si posiziona sul vetrino porta oggetti una goccia d'acqua deionizzata mediante
l'uso della spruzzetta;
▪ si preleva con l'ansa monouso 1 um di C.albicans dalla colonia singola e si
posiziona sul vetrino;
▪ si copre tutto con il vetrino copri oggetto cercando di farlo aderire al meglio con
la superficie ed evitare così la formazione di bolle d'aria;
▪ si ripetono questi passaggi per le altre specie e poi le si osserva al microscopio.

10. Al termine di tutto si parafilmano le piastre.

RISULTATI OTTENUTI DALL'OSSERVAZIONE

STEREOMICROSCOPIO OSSERVAZIONI M. OTTICO

C. albicans Le colonie si presentano
lucide, verdi e umbonate.

C. tropicalis Colonie color grigio-blu,

più scure all'interno che via
via si schiariscono. Poco
umbonata.
C. kruzei Le colonie sono larghe,
sciamanti, polverulente, di
colore rosa-violaceo. Piu
scura all'intero e via via
sempre più chiara
all'esterno. Si presente
opaca e piatta.

C. glabrata Colonie color rosa lucido.

È molto luminosa e
tonteggiante. Tra di loro
sono poco aggregate

C. parapsilosis Le colonie sono color

crema. Tra di lorosono meo
aggregate, più arrotondate
e opache.

CONCLUSIONI

Come si è potuto constatare ogni specie ha una sua caratteristica e funzione vitale. In base al loro
colore, forma, e nel loro modo di aggregarsi, si ha la possibilità di differenziarle in modo specifico.
I risultati ottenuti mostrano compatibilità con quello che ci si aspettava dall'esperimento.
 CONTROLLO
QUALITA'
YOGURT

SCOPO

L'esperienza ha come scopo la conta microbica all'interno dello yogurt, più precisamente del
Lactobacillus bulgaricus e dello Streptococcus thermophilus, e la loro osservazione al microscopio
ottico.

PRINCIPIO TEORICO

Lo yogurt è un prodotto ottenuto dalla fermentazione del latte (da lattosio diventa acido lattico)
operata da alcuni batteri, chiamati per questo fermenti lattici che rimangono vivi nello yogurt. Il
compito principale svolto dai fermenti lattici dello yogurt, ossia dallo Streptococcus thermophilus e
dal Lactobacillus bulgaricus è quello di stimolare il corretto funzionamento e la regolarità della
flora intestinale: questi due fermenti non superano la barriera gastrica dell'intestino e vengono
ospitati all'interno dell'organismo come microrganismi vivi che assunti regolarmente apportano
benefici alla salute dell'uomo.
Per legge lo yogurt deve contenere tra gli uni e i cinque milioni di microrganismi per grammo di
prodotto fino alla scadenza. Al fine di garantirne la sua integrità, si effettua in laboratorio il
controllo qualità dello yogurt, non altro che la conta batterica. Se il risultato della conta è positivo,
ovvero rientra nei parametri sopra indicati, il prodotto è di qualità. Se così non fosse e quindi ci
fossero dei valori sballati, il prodotto non può essere messo in commercio.
La conta dei microrganismi avviene per ogni specie su un terreno specifico. In questo caso lo yogurt
utilizzato nell'esperienza contiene due specie di microrganismi e quindi due terreni diversi:

• Lactobacillus bulgaricus. È un bacillo (batterio a forma di bastoncello, lungo e sottile)

immobile e anaerobio. La sua temperatura di crescita ideale è intorno ai 37°C ed è acidofilo,
cioè preferisce ambienti con pH tra i 4,6 - 5,4(acidi). Il terreno che predilige è l'MRS agar.
L'MRS agar è un terreno selettivo che contiene:

◦ una miscela di peptoni, responsabili della crescita dei Lactobacilli

◦ estratto di lievito
◦ glucosio
◦ fosfato di dipotassio, acetato di sodio anidro, ...
◦ agar

Il pH finale di questo terreno è di 6,2 ± 0,2. Il terreno inoltre può essere impiegato con incubazione
30°C e osservato dopo 2/5 giorni.

• Streptococcus thermophilus. È uno streptococco (batterio di forma sferica che forma corte
 catenelle) immobile, in prevalenza anaerobio e aerotollerante, cioè che può vivere sia in
presenza che in assenza di ossigeno. La sua temperatura di crescita ideale è tra i 37°C e i
45°C. Il terreno sul quale crescono le colonie è l'M17 agar. È composto da:

◦ peptoni di soia, caseina e carne che contengono le fonti di carbonio e di azoto necessarie
per la crescita degli Streptococchi.
◦ estratto di lievito, che è una fonte di vitamine B.
◦ acido ascorbico, il quale stimola la crescita.
◦ Lattosio fermentato ad acido lattico, che è tamponato dal glicerofosfato.

Il pH del terreno, pronto per l’uso a 25°C, è di 7,1 ± 0,2. L'M17 prevede un'incubazione di 37° e
un'osservazione dopo 48 ore.

I metodi utilizzati per la conta microbica sono due: metodi diretti e metodi indiretti.

M. DIRETTI (vivi + morti) M. INDIRETTI (vivi)

• Conteggio al microscopio o sul vetrino
• Uso di counter per cellule
• Calcolo della torbidità
• Valutazione chimica o del peso secco o
del volume della massa
• Conteggio su piastra si basa su:
◦ cellule vitali e coltivabili
◦ sul presupposto che ogni
microrganismo vitale dia origine ad
una colonia su un terreno di coltura
◦ il conteggio non è privo di errori
perché i microrganismi possono
aggregarsi
◦ CFU/ml è l'espressione corretta
• MPN
• Uso membrane filtranti

L'osservazione al microscopio ottico di questi due microrganismi viene effettuata mediante la

colorazione di Gram, al fine di individuare i batteri in gruppi distinti in base alla reazione che
manifestano in seguito alla colorazione. La colorazione di Gram è un esame di laboratorio che
utilizza diverse sostanze consecutivamente:

• Colorante primario: il Cristal violetto, che ha una colorazione blu-viola. È basico e ha carica
positiva. Colora sia i Gram positivi che i Gram negativi.

• Mordente: il liquido di Lugol, è iodio in ioduro di potassio che consente al colorante di

legare efficacemente il preparato.

• Decolorante: l'acetone o l'alcol 1:1 o 1:4. I Gram positivi resistono alla decolorazione, i
Gram negativi perdono il Cristal Violetto

• Colorante di contrasto: Safranina. È un colorante tendente al rosso basico con carica positiva
e colora i Gram negativi.

L'esame permette di distinguere due grandi categorie di batteri: Gram positivi (Gram +) e Gram
negativi(Gram-). Fu fondata da Hans Joachim Christian Gram e mette in evidenza alcune proprietà
fondamentali della parete cellulare dei microrganismi:
 • I Gram positivi sono muniti di parete cellulare molto spessa e ricca di un polimero, il
peptidoglicano. Il peptidoglicano in questi batteri compone all'incirca per il 90% la parete
cellulare; l'applicazione del colorante fa acquisire loro il colore viola, che però rimane
fissato alla parete al punto da impedire l'azione del decolorante. Per questo motivo questi
batteri, al microscopio ottico, risultano viola.

• I Gram negativi presentano una parete cellulare molto più sottile e contenente solo il 15/20%
di peptidoglicano: in questo modo il decolorante può svolgere la sua funzione, ovvero quella
di rimuovere il colore violetto e permettendo a quello rosso di agire sul batterio. Infatti
questi microrganismi assumeranno la colorazione rossa.

MATERIALI UTILIZZATI

STRUMENTI
• 1 g di yogurt
• 9 g di H2O triptonata, in tutte le provette
• 7 provette per le diluizioni seriali
• spatola per pesare il terreno
• 6 piastre Petri
• Timer
• 6 puntali monouso
• autoclave
• pinza per tenere vetrino con la soluzione
• kit sacchetti anaerocult
• 6 anse monouso da 1 e da 10 microlitri
• porta provette con 7 provettoni (16x 1 cm)
• soluzione fisiologica in spruzzetta: H2O distillata
• micropipetta
• scotch da autoclave: indicatore di sterilità
• becco di Bunsen: è un bruciatore di un flusso continuo di gas senza rischio che la fiamma
abbia un ritorno nel tubo e giunga fino alla bombola. In genere utilizza gar naturale o gas di
petrolio liquefatto.
• Microscopio ottico
• Fiamma ossidrica
• Frigorifero
• Cappa microbiologica

VETRERIA
• 3 bottiglie graduate
• 6 vetrini copri oggetto e 6 porta oggetto
• cilindro graduato
• becher
• parafilm

REAGENTI
• Cristal Violetto
• liquido Lugol
• decolorante alcol/acetone
 • safranina

TERRENI
• M17
• MRS

MICRORGANISMI UTILIZZATI
• Streptococcus thermophilus
• Lactobacillus bulgaricus

PROCEDIMENTO

Prima parte: preparazione dei terreni.

Per la preparazione del terreno M17 Agar:

1. Pesare su una bilancia tecnica 22,17 g di M 17 Agar; sospendere nelle bottiglie graduate e
inserire 400 ml di acqua distillata.

2. Una volta che l'acqua è stata misurata nel cilindro graduato ed inserita nella bottiglia,
mescolare il tutto e sigillare. Sigillare la bottiglia per mezzo dello scotch con “bandine”
bianche. Esse sono importanti in quanto determinano l'efficacia e il corretto funzionamento
dell'autoclave. Infatti se tutto è andato a buon fine, le bandine da bianche diventano nere.
Questo scotch viene messo sul tappo e sulla bottiglia e su di esso, per mezzo di un
pennarello indelebile, si è scritto M17. A fine preparazione la bottiglia viene portata in
autoclave.

3. Autoclavare a 121°C per 15 minuti.

4. Colare il composto su 3 piastre Petri

Per la preparazione di MRS agar:

1. Pesare 26,9g di MRS agar e inserire in una bottiglia graduata; successivamente inserire
400ml di acqua distillata.

2. Siglare la bottiglia con un pennarello indelebile e dello scotch con bandine bianche,
scrivendoci sopra MRS.

3. Mettere in autoclave a 121°C per 15 minuti.

4. Colare il composto su tre piastre Petri.

Seconda parte: semina dello yogurt sui terreni preparati in precedenza.

1. Prendere 1g di yogurt e si sospende in 10g d'H2O triptonata, cioè contenente triptone,

digerito proteico all'1% che serve a nutrire i microrganismi.

2. A questo punto iniziare le diluizioni seriali 1:10. Le diluizioni seriali sono diluizioni fatte in
serie, partendo dalla soluzione iniziale, detta SOLUZIONE MADRE. Da questa prendere,
con una micropipetta da 1ml, una parte, in questo caso 1 ml e diluirla ulteriormente con 9 ml
di acqua triptonata. Poi da quest'ultima prendere 1ml di soluzione e diluirlo ulteriormente
con 9 ml di acqua triptonata e così via, fino ad arrivare a 6 provette (-1,-2,-3,-4,-5,-6). Per
 ogni diluizione che si effettua, cambiare il puntale monouso.

3. Fatto ciò effettuare la piastratura sotto cappa delle ultime tre diluizioni (-4,-5,-6). Siglare le 6
piastre con un pennarello indelebile. Con una micropipetta da 1000 prelevare 1ml di
prodotto dalla diluizione -4 e depositare sulla prima piastra MRS e con un'ansa monouso
spatolare sul terreno finché la soluzione non sarà del tutto assorbita. Eseguire gli stessi
passaggi per le diluizioni -5 e -6. Ripetere il tutto per le tre piastre M17.

4. Una volta seminate sotto cappa creare l'ambiente opportuno per questi microrganismi.
L'ambiente anaerobio è reso possibile grazie a un kit composto da:
◦ bustina contenente 3ml di sostanza che con il calore evaporano, rilasciando sostanze
tossiche e rendendo così l'ambiente anaerobio.
◦ Sacchetto di plastica che ha la funzione di contenere la bustina e la piastra petri.
◦ Pinza per chiudere il tutto

5. Infine incubare a 37°C per una settimana.

Terza parte: conta delle colonie cresciute sui terreni seminati.

1. Aprire le piastre.

2. Osservare le colonie.

3. Con un'ansa sterile monouso dividere la piastra in più parti: se si notano poche colonie si
può dividere in quattro parti, altrimenti in otto parti.

4. A questo punto contare per ogni quadrante le colonie che si osservano.

5. Una volta stabilito il numero di colonie per un quadrante, moltiplicare il risultato per 4 o per
8 in base a quanto la si è divisa.

6. Ora applicare una formula per trovare i CFU, ovvero le unità formanti colonia:

conta m. o.
CFU = * fattore di diluizione
volume inoculo
Quarta parte: visione dei microrganismi al microscopio ottico mediante la colorazione di Gram.

1. FISSAZIONE: processo in cui vengono bloccate su un vetrino tutte le strutture interne ed

esterne della cellula. Ci sono diversi passaggi:

◦ Si sigla il vetrino e capovolgerlo

◦ Si depone 1-2 gocce d’acqua sul vetrino
◦ Si preleva una colonia o parte di essa con ansa sterile
◦ Si stempera la colonia sulla goccia
◦ Si preleva il vetrino con le pinzette e farlo asciugare alla fiamma
◦ Si fa passare il vetrino sulla fiamma 3 volte rapidamente

2. COLORAZIONE DI GRAM:

◦ COLORAZIONE PRIMARIA: si prepara uno striscio del batterio e lo si tratta con

Cristal violetto per 1' 30''. Scolare e sciacquare.
◦ MORDENTE: una volta scolato coprire il preparato con una soluzione di ioduro di
potassio e iodio, che insieme al Cristal violetto si complessa con il materiale
cellulare. Si sciacqua il liquido di Lugol per 1 minuto.
◦ DECOLORAZIONE: aggiungere allo striscio gocce di etanolo. Sciacquare e lasciar
scolare per 30 secondi.
◦ COLORANTE DI CONTRASTO: trattare i vetrini con la safranina. Sciacquare,
scolare per 2 minuti, risciacquare, scolare per l'ultima volta e asciugare il tutto.

Fatto ciò, i vetrini sono pronti per essere osservati.

CALCOLI

In questo caso le operazioni da effettuare sono due: una per la piastra contenente il terreno MRS e
l'altra per l'M17. La formula che si utilizza è la seguente:

conta m.o.
CFU = * fattore di diluizione * 10
volume inoculo

CFU/UFC = Unità Formanti Colonia

conta m.o. = microrganismi contati sulla piastra. In questo caso le colonie contate sul terreno M17
coincidono con quelle contate sull'MRS
volume inoculo = 1 µm (microlitro), cioè il volume preso dalla soluzione , che è la stessa
soluzione con cui abbiamo fatto la semina e successivamente contato i m.o.
fattore di diluizione = in questo caso 1: , ovvero
10 = 1g di yogurt diluito in 10 ml di soluzione iniziale

800
MRS/M17 = * * 10 = 800 =8*
1 µm
OSSERVAZIONI

Conta microbica.

Lo yogurt affinché sia di qualità deve rientrare almeno in . Lo yogurt analizzato nell'esperienza
ha come valore 8 * , e quindi rientrando abbondantemente nella qualità l'esperienza è verificata.

Osservazione dei vetrini al microscopio ottico.

Streptococcus thermophilus

Gli streptococchi si presentano in lunghe

catenelle

o in coppia.

La forma assunta è sferoidale o ovoidale.

Sono immobili per l'assenza di flagello.

La colorazione viola scuro che assumono

è la dimostrazione che sono Gram positivi.

Lactobacillus bulgaricus

Questi batteri si presentano con forme diverse (bacilli,

cocchi). A volte possono essere riuniti in catenelle.

Grazie al colorante Cristal Violetto, questi batteri si

presentano di color violaceo. Il fatto che assumano
questo colore è la prova che siano Gram positivi, e che
quindi a causa del peptidoglicano il decolorante non
agisce.
TAMPONE
FARINGEO

SCOPO

Lo scopo dell'esperienza è di rilevare, attraverso l'analisi delle piastre, microrganismi che

potrebbero causare infezioni nella faringe.

PRINCIPIO TEORICO

Il tampone faringeo è un esame del cavo faringeo diagnostico che viene condotto per cercare la
presenza di batteri responsabili al mal di gola e alle affezioni respiratorie, i quali si annidano nella
gola e causano irritazione.
Il principale responsabile di queste infezioni è lo Streptococcus beta emolitico di tipo A (o
Streptococcus pyogenes).
In generale lo Streptococcus è un genere di batteri sferici Gram positivi, che normalmente popola le
mucose dell'organismo (soprattutto orale, faringea, intestinale e vaginale). È un anaerobio
facoltativo, non sporigeno ed immobile (nella maggior parte delle specie). La sua classificazione
dipende da due criteri:

• STRUTTURA ANTIGENICA, che si basa sull'antigene polisaccaridico C di parete cellulare,

le cui caratteristiche sono eterogenee nei diversi tipi di streptococco.
• CAPACITA' EMOLITICA, ovvero il comportamento che possiede sul terreno agar sangue; a
sua volta lo Streptococco si divide in tre grandi gruppi:
◦ batteri alfa emolitici. Sul terreno essi si presentano con colonie verdi, dovuto
all'ossidazione del ferro e ad un'incompleta attività emolitica. In questo gruppo, gli
streptococchi presentano pili di adesione (costituiti da proteina M e ricoperti da acido
lipoteicoico) utili per l'ancoraggio alle cellule epiteliali dell'ospite. Tipico esponente di
questa categoria è lo pneumococco (P. pneumoniae)
◦ batteri beta emolitici. Questi batteri dispongono di colonie rosse con contorno rosa,
segno della completa rottura dei globuli rossi. Il tipico esponente è lo S. pyogenes
◦ batteri gamma emolitici. Sono definiti anche anaemolitici, in quanto non producono
emolisi. Esempio tipico è l'enterococco.

Per quanto riguarda lo Streptococcus pyogenes dei beta emolitici, la sua attività patogena è assai
ampia. Infatti è coinvolto nella maggior parte dei casi delle infezioni streptococciche dell'uomo.
Esso può causare febbre reumatica acuta, nefrite, impetigine, scarlattina, fascite necrotizzante acuta
e faringite.
Quest'ultima, insieme ad altre infezioni alla faringe, può essere causata non solo dallo S. pyogenes,
ma anche da altri batteri quali: Gram negativi, stafilococchi, pneumococchi.
• GRAM NEGATIVI, sono tutti quei batteri che dopo la colorazione di Gram rimangono con
una colorazione rosso/rosa. Questo loro comportamento deriva dalla presenza di una parete
sottile di peptidoglicano, polimero che rispetto ai Gram positivi si trova tra due membrane
cellulari: una esterna e una interna. Essendo presente solo al 15 %, il decolorante utilizzato
nella colorazione di Gram può agire a fondo rimuovendo il colore violetto e permettendo a
quello rosso di agire sul batterio. Le infezioni dai Gram negativi sono meno frequenti dei
Gram positivi. I Gram negativi sono di gran lunga più pericolosi rispetto ai Gram positivi, in
quanto sono i principali responsabili di disturbi e malattie di diverso tipo.
• STAFILOCOCCHI. Sono Gram negativi e batteri di Gram positivi. Sono aerobi o anaerobi
facoltativi, privi di capsula evidente, cocchi disposti in gruppi irregolari. Aerobicamente
producono acido acetico e anidride carbonica, mentre in anaerobiosi producono acido lattico
e poco acido acetico. Sono mesofili. Alcuni sono commensali ed altri saprofiti, altre ancora
opportuniste patogene dell’uomo e di animali.
• PRENUMOCOCCO, noto come Staphilococcus pneumoniae,è un batterio Gram positivo di
tipo alfa emolitico in stato di aerobiosi e beta emolitico in anaerobiosi. Presenta un genoma
circolare e una capsula polisaccaridica, che li fa risultare particolarmente virulenti. Questo
perché la capsula protegge il batterio dalla fagocitosi e nel contempo ne aumenta la
patogenicità. Buona parte della parete possiede la proteina M e l’antigene C. È un batterio
fermentante, in grado di formare acido lattico a partire dal glucosio. Ciò incide sulla scelta
del terreno di coltura. Infatti viene coltivato su un terreno agar sangue arricchito di glucosio.
È presente come commensale nelle mucose del tratto respiratorio e, in condizioni ad esso
ottimali, può replicarsi trasformandosi in patogeno opportunista. Può causare delle infezioni
pericolose e sempre più gravi a seconda dell’igiene del Paese. Per questo è un batterio che
crea seri problemi alla sanità pubblica.

Tutti questi microrganismi prediligono il terreno Columbia Blood Agar Base, terreno altamente
nutritivo che permette la sopravvivenza dei patogeni. Il terreno è composto da:
• miscela di peptoni
• amido
• D-glucosio
• Agar A
• Cloruro di sodio
Il Columbia Blood Agar Base può essere reso selettivo grazie all’aggiunta di sangue defibrillato di
montone, importante perché serve per l’attività emolitica.
Il pH finale è di 7,3 ± 0,2. L'incubazione in ambiente aerobio per 18/24 ore e in anaerobiosi per 72
ore a 37°C.

Per effettuare questo esame si possono usare due diverse forme di controllo:
• la prima è attraverso il test rapido per lo Stafilococco beta emolitico di tipo A (SBEA); si va
a cercare, attraverso un test dotato di anticorpi monoclonali, la presenza di antigeni specifici
dello SBEA. Questo fa in modo che la specificità del test sia altissima.
• quello utilizzato per questa esperienza, è l’esame colturale (solitamente si fa anche
l’antibiogramma). Dopo 24 ore di incubazione a temperatura e atmosfera controllata, si
controlla lo sviluppo della beta emolisi, ovvero un alone dovuto alla rottura dei globuli rossi
(da qui emolisi, emo=sangue, lisi= rottura) a causa di enzimi prodotti dallo SBEA. Qualora
non si osservi emolisi, il tampone risulterà negativo. Se invece fosse positivo, si procede con
l’antibiogramma, che consiste nell’isolare colonie batteriche con diversi antibiotici a diverse
concentrazioni.
Altri esami che si possono effettuare sullo Stafilococco sono:
 • TEST DELLA COAGULASI, usato per lo Stafilococco per rilevare la presenza della
coagulasi libera e legata. La coagulasi è un enzima liberato da alcuni batteri, come lo
Stafilococco, in grado di coagulare il plasma citrato di coniglio. L’enzima in presenza di un
fattore plasmatico produce in un minuto la coagulazione del fibrinogeno. È possibile
produrre due forme diverse di coagulasi: libera e legata. La coagulasi libera viene rilasciata
dal microrganismo coltivato in brodo, mentre quella legata rimane attaccata alla parete
cellulare dell’organismo.
• TEST DELLA CATALASI, usato per riconoscere, in questo caso, lo Stafilococco dallo
Streptococco. Si tratta di porre una colonia batterica a contatto con l’acqua ossigenata.
Un’effervescenza segnala la presenza di una catalasi.

MATERIALI UTILIZZATI

STRUMENTI

• Spatola per pesare il terreno

• 1 piastra petri
• Timer
• Autoclave
• Micro pipetta
• Pinza per tenere vetrino con la soluzione
• 1 ansa monouso da 1 microlitro
• Soluzione fisiologica in spruzzetta: H2O distillata
• Scotch da autoclave: indicatore di sterilità
• Becco di Bunsen o fiamma ossidrica: è un bruciatore di un flusso continuo di gas senza
rischio che la fiamma abbia un ritorno nel tubo e giunga fino alla bombola. In genere
utilizza agar naturale o gas di petrolio liquefatto.
• Microscopio ottico
• Termostato
• Tampone orofaringeo
• Cappa microbiologica
• Frigorifero

VETRERIA
• 1 bottiglie graduate
• 1/2 vetrini copri oggetto e porta oggetto
• cilindro graduato
• becher
• parafilm

REAGENTI
• Cristal violetto
• Liquido Lugol
• Decolorante: alcol/acetone
• Safranina, che è un colorante di contrasto
• Acqua deionizzata
TERRENI
• Columbia Blood Agar Base

MICRORGANISMI UTILIZZATI
• GRAM –
• S. pyogenes
• S.pneumoniae

PROCEDIMENTO

Prima parte: preparazione terreno.

Per la preparazione del Columbia Blood Agar Base:

1. Misurare 400ml di acqua deionizzata utilizzando il cilindro graduato.
2. Pesare 41g di Columbia Blood Agar Base nella bottiglia graduata ed etichettata con lo
scotch da autoclave.
3. Versare insieme al terreno l’acqua pesata in precedenza. Agitare e autoclavare a 121°C per
15’.
4. Dopo aver autoclavato, si aggiunge al composto il 5% del sangue di montone. Questo
passaggio è fondamentale che venga eseguito dopo per evitare che le cellule del sangue si
denaturino.
5. Colare il composto sulle piastre Petri siglate con un pennarello indelebile in precedenza.
6. Lasciare solidificare in frigorifero.

Seconda parte: tampone e semina delle piastre.

(Fase preliminare non eseguita in questa esperienza è di, una volta aperta la bocca, far tenere
abbassata la lingua del paziente con un abbassalingua).
1. Inserire uno specifico tampone in bocca e strofinarlo conto la parete della gola e sulle
tonsille
2. Seminare fuori cappa il campione su tutta la piastra, fino a totale assorbimento sul terreno.
3. Incubare a 37°C per 24 ore nel termostato.

Terza parte: esame colturale.

1. Osservare la crescita batterica sulle piastre
2. Se non vi è la presenza di un alone verde intorno alle colonie, allora l’attività emolitica non
ha avuto effetto e quindi il tampone è negativo.
Nel caso in cui il tampone fosse positivo si deve preparare un vetrino e fissare il composto su di
esso per la colorazione di Gram:
1. Siglare il vetrino e capovolgerlo
2. Deporre 1-2 gocce d’acqua sul vetrino
3. Prelevare una colonia o parte di essa con ansa sterile
4. Stemperare la colonia sulla goccia
5. Prelevare il vetrino con la pinza e farlo asciugare alla fiamma
6. Passare il vetrino sulla fiamma 3 volte rapidamente
Quarta parte: colorazione di Gram e osservazione al microscopio ottico.

Per la colorazione di Gram:

1. COLORAZIONE PRIMARIA: si prepara uno striscio del batterio e lo si tratta con Cristal
violetto per 1' 30''. Scolare
2. MORDENTE: una volta scolato si copre il preparato con una soluzione di ioduro di potassio
e iodio, che insieme al Cristal Violetto si complessa con il materiale cellulare. Si sciacqua il
liquido di Lugol per 1 minuto.
3. DECOLORAZIONE: si aggiungono allo striscio gocce di etanolo. Si sciacqua e si lascia
scolare per 30 secondi.
4. COLORANTE DI CONTRASTO: si trattano i vetrini con la safranina. Si sciacqua, si scola
per 2 minuti, si risciacqua, si scola per l'ultima volta e si asciuga il tutto.
5. Fatto ciò si osservano i vetrini al microscopio

CONCLUSIONI

BATTERI PIASTRA 1

Gram negativi +

Stafilococchi alfa emolitici +

Stafilococco beta emolitico -

Stafilococco gamma emolitico -

Pneumococchi +

PIASTRA VETRINO MICROSCOPIO

ESAME URINE

Lo scopo dell’esperienza è quello di rilevare i possibili patogeni presenti nelle vie urinarie.
PRINCIPIO TEORICO
L’urina è il liquido color ambrato prodotto dai reni che filtrano il sangue per depurarlo dalle scorie
prodotte dal metabolismo; il rene è un organo perennemente impegnato a mantenere costante il
volume, il Ph del sangue e l’osmolarità. Tramite l’urina quindi si eliminano dall’organismo i
prodotti di scarto e l’eccesso di acqua o di sostanze che vi sono disciolte.
Per questo motivo la composizione qualitativa e quantitativa dell’urina fornisce informazioni su
molti processi fisiologici e patologici che si verificano nell’organismo. In condizioni normali,
l’acqua rappresenta il 95% in peso dell’urina; La vescica ha una capacità di circa 500 ml ed al
bisogno viene svuotata in un atto, definito minzione, in cui l'urina viene emessa all'esterno
attraverso l’uretra.
L’esame delle urine è un insieme di esami di laboratorio che consente di analizzare le
caratteristiche chimiche e fisiche delle urine. Permette di individuare possibili patologie nelle vie
urinarie o dei reni. È inoltre possibile individuare sostanze tossiche o farmaci assunti di recente.
In condizioni fisiologiche l’urina dev’essere sterile. Se è stata presa correttamente ci si può trovare
di fronte a due esiti:
• NEGATIVO, se non vi è presenza di batteri o se la crescita batterica non supera le 100
colonie; per le donne in gravidanza si fanno ulteriori accertamenti e si valuta se darle
l’antibiotico.
• POSITIVO, se la crescita supera 100 colonie. In questo caso il referto viene dato un giorno
prima e analizzato più approfonditamente.

Possono esserci stati intermedi: se ci sono colonie miste vuol dire che il campione è contaminato. In
quel caso bisogna ripetere il test.
I terreni utilizzati per questo esame sono il CHROMagar Orientation e il Mac Conkey Agar.
• CHROMAGAR ORIENTATION è un terreno di coltura non selettivo per l'isolamento,
l'identificazione diretta, la differenziazione e la conta di agenti patogeni del tratto urinario.
CHROMagar Orientation consente di differenziare e identificare l'Escherichia coli e
l'enterococco senza test di conferma. Le colonie batteriche che crescono su questo terreno
sono tutte patogene del tratto delle vie urinarie. Il principale responsabile delle infezioni è le
E. coli in coltura pura o unitamente ad enterococchi. Si possono trovare in frequenza
maggiore nelle donne, gli Staphylococcus saprophyticus e lo Streptococcus agalactiae.
Alcuni di questi organismi sono in grado di produrre enzimi per il metabolismo del lattosio
o glucosidi, oppure entrambi. Grazie a questa capacità è possibile identificare le diverse
colonie. Le colonie che possono crescere su questo terreno sono:
 o Escherichia coli. Crescita da buona a eccellente, colonie medio-grandi, dal rosa scuro
al rosa acceso, trasparenti
o Proteus vulgaris Crescita da buona a eccellente; colonie medie, dal bianco al beige,
circondante da un alone ambra-marrone; nelle zone caratterizzate da densa crescita,
il terreno di coltura può presentarsi completamente da ambra a marrone. La
sciamatura è da parzialmente a completamente inibita.
o Enterococcus faecalis. Crescita da buona a eccellente, piccole colonie dal
verdazzurro al blu
o Staphylococcus aureus. Crescita da buona a eccellente, colonie medio-piccole, del
loro colore naturale (bianco o panna)
o Klebsiella pneumoniae
o Candida albicans. Le colonie si presentano umbonate, con colorazioni verde-blu
luccicante, con forma allungata.
I reagenti presenti in questo terreno sono:
o Cromopeptone 16,1 g
o Miscela cromogena 1,3
o Agar 15,0
pH finale è di 6,9 ± 0,2. Può essere impiegato con incubazione a 35°C - 37°C in ambiente
aerobico e osservato dopo 20-24 ore

• MAC CONKEY AGAR è un terreno selettivo e differenziale per l'isolamento e la

differenziazione di Enterobacteriaceae e di numerosi altri bacilli Gram-negativi da campioni
clinici. La preparazione di questo terreno si basa su due concetti: il primo riguarda i Sali
biliari che vengono precipitati dagli acidi, il secondo è che alcuni batteri fermentano il
lattosio altri no. L'agar MacConkey è scarsamente selettivo in quanto la concentrazione di
sali biliari, che inibiscono i microrganismi Gram-positivi, è bassa rispetto ad altre tecniche
di piastratura per enterobatteri. Contiene rosso neutro che è un indicatore di pH che
evidenzia la produzione di acidi. I reagenti contenuti in questo terreno sono:

o Digerito pancreatico di gelatina 17,0 g

o Digerito pancreatico di caseina 1,5
o Digerito peptico di tessuto animale 1,5
o Lattosio 10,0. È l’unico carboidrato presente nel terreno.
o Sali biliari 1,5
o Cloruro di sodio 5,0
o Rosso neutro 0,03
o Cristal Violetto 0,001
o Agar 13,5
pH della soluzione è di 7,1 ± 0,2. Può essere impiegato con incubazione a 37°C in
ambiente aerobico e osservato dopo 18-24 ore.
Le colonie batteriche che crescono su questo terreno sono:
o Escherichia coli. Crescita, colonie rosa
o Proteus mirabilis. Crescita, colonie da incolori a beige, sciamatura inibita
o Salmonella Typhimurium. Crescita, colonie da incolori a beige
 o Salmonella Abony. Crescita, colonie da incolori
Concetti molto importanti sviluppati durante l’esperienza sono l’ARRICCHIMENTO e il
CONGELAMENTO.
• L’arricchimento è la creazione di condizioni favorevoli ad un solo organismo o gruppo di
organismi. Questo è molto utile quando si ha l’esigenza di isolare una specie o più specie di
microrganismi che necessita una grande disponibilità di nutrienti. Infatti lo scopo degli
arricchimenti è quello di arricchire un terreno e quindi migliorare le condizioni vitali del
microrganismo. In questa esperienza il terreno che si usa per arricchire è il Mueller Hinton
Broth, un terreno che presenta pH intorno ai 7,3 ± 0,2 e contiene: agar, amido, estratto di
carne e acido di caseina.
• Il congelamento è una delle tecniche di conservazione utilizzate per mantenere in vita in
modo indefinito le cellule. Esse vengono prima congelate alla temperatura dell’azoto
liquido(-196°C) e successivamente conservate ad una temperatura di -80°C. È necessario
aggiungere un crioprotettivo come la glicerina, che favorisce una solidificazione amorfa.
Più veloce è il congelamento più piccoli saranno i cristalli di ghiaccio, minore il danno per
la cellula.

MATERIALI UTILIZZATI

STRUMENTI

• 300 microlitri di glicerolo

• 200ml di brodo Mueller Hinton Broth
• Spatola per pesare il terreno
• 3 piastre Petri
• Timer
• Autoclave
• Micro pipetta
• Pinza per tenere vetrino con la soluzione
• 9 anse monouso da 10 microlitro
• Soluzione fisiologica in spruzzetta: H2O distillata
• Scotch da autoclave: indicatore di sterilità
• Becco di Bunsen: è un bruciatore di un flusso continuo di gas senza rischio che la fiamma
abbia un ritorno nel tubo e giunga fino alla bombola. In genere utilizza agar naturale o gas di
petrolio liquefatto.
• Fiamma ossidrica
• Microscopio ottico
• 8 tubicini numerati sopra, perché le scatole vanno poi numerate e va fatta una tabella di
corrispondenza fra il numero e il ceppo, in modo che quando poi li si scongela, si sappia
dove andarli a prendere.
• ultracongelatore
• 4 provette
• Termostato
• Flacon da 50
• Box da freezer
• Puntali monouso
VETRERIA
• 1 bottiglie graduate
• 1/2 vetrini copri oggetto e porta oggetto
• cilindro graduato
• becher
• parafilm

TERRENI
• CHROMagar Orientation
• Mac Conkey
• Mueller hinton broth

SOSTANZE
• Glicerolo
• Acqua deionizzata

PROCEDIMENTO
Dopo essersi lavati bene le mani e gli organi genitali con sapone e acqua scartare il primo getto di
urina nel W.C. e raccogliere nell'apposito contenitore sterile (fornito dal Laboratorio o acquistato in
farmacia) il secondo getto di urina.
Preparazione terreno CHROMagar Orientation.
1. Misurare 400ml di acqua deionizzata utilizzando il cilindro graduato.
2. Pesare 12,92 g di CHROMagar Orientation nella bottiglia graduata da 0,5ed etichettata con
lo scotch da autoclave.
3. Versare insieme al terreno l’acqua pesata in precedenza. Agitare e autoclavare a 121°C per
15’.
4. Abbassare la temperatura a 60°C
5. Una volta solidificato nel frigo colare il composto su due piastre petri siglate con un
pennarello indelebile in precedenza.
6. Lasciare solidificare sotto cappa.

Preparazione terreno Mac Conkey.

1. Misurare 400ml di acqua deionizzata utilizzando il cilindro graduato.
2. Pesare g di Mac Conkey nella bottiglia graduata ed etichettata con lo scotch da autoclave.
3. Versare insieme al terreno l’acqua pesata in precedenza. Agitare e autoclavare a 121°C per
15’.
4. Colare il composto sulla piastra petri già siglata in precedenza.
5. Lasciare solidificare in frigo.

Semina delle piastre.

Sulle piastre CMO si effettuano due tipi di semine:
a. Semina a pino, per capire la carica microbica: prelevare con l’ansa monouso sterile da 1
microlitro l’urina e strisciarla sul terreno eseguendo due movimenti: il primo è tracciando il
 diametro della piastra; il secondo è effettuando una linea serpentina lungo il diametro. Incubare
nel termostato a 37°C per 24 ore.
b. Semina a quadranti, per isolare l’Escherichia coli. Si prende con l’ansa monouso sterile da 1
microlitro l’inoculo di E. coli unito ad una soluzione fisiologica. Incubare a 37°C per 24 ore.

6. Sulla piastra contenente il terreno Mac Conkey isolo con la semina a quadranti l’E. coli. Incubare
a 37°C per 18/24 ore.

Arricchimenti.
1. Prendere quattro flacon da 50 microlitri.
2. Prendere quattro piastre di terreno CHROMagar Orientation in cui sono stati isolati quattro
patogeni diversi: Enterococco, E. coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus
3. Per ogni flacon, inserire un ceppo batterico diverso preso con un’ansa e stemperato al suo
interno.
4. A ogni flacon aggiungere 20 ml di brodo Mueller. Quindi si otterrà:

FLACON 1 E. coli + 20ml brodo

FLACON 2 Enterococco + 20ml brodo
FLACON 3 Klebsiella pneumoniae + 20ml brodo
FLACON 4 Proteus + 20ml brodo

5. Incubare nel termostato a 37° per 24 ore

Congelamenti.
1. Per ogni flacon incubato in precedenza prendere due tubicini e siglarli. Ne serviranno due per
ogni ceppo.
2. Da ogni flacon prelevare 700 microlitri di brodo + specie e aggiungere 300 microlitri di glicerolo.
3. A questo punto mettere i tubicini nel congelatore a -80°C

RISULTATI
Esiti esame urine
PATOGENI URINARI CRESCITA PIASTRA 1
Escherichia coli -
Klebsiella pneuminiae -
Stafilococcus aureus -
Pseudomonas aeruginosa -
Proteus vulgaris -
Enterococcus fecalis -
Candida albicans -
CONCLUSIONI
Dall’osservazione della piastra CHROMagar Orientation, usata per osservare la carica microbica si
è potuto osservare che la piastra non presentava colonie e che quindi l’esito è NEGATIVO.
 STAPHILOCOCCUS
AUREUS

SCOPO
Lo scopo dell’esperienza è di isolare lo Staphilococcus aureus, effettuare l’antibiogramma e trovare
la deviazione standard delle resistenze degli antibiotici presi in esame.
PRINCIPIO TEORICO
Lo S. aureus è un batterio Gram positivo di forma sferica. È conosciuto per le sue colonie giallo,
che creano un viraggio giallo-oro; esse si dispongono a forma di catenella.
Il terreno che predilige è il Mueller Hinton Blood Agar, con l’aggiunta del 5% di sangue di
montone. È un terreno specificamente utilizzato per test clinici come l’antibiogramma. Contiene:
• Estratto di carne bovina 2,0 g
• Idrolizzato acido di caseina 17,5
• Amido 1,5
• Agar 17,0
• Sangue defibrinato di montone 5%
pH è di 7,3 ± 0,2
Incubazione a 37°C per 24 ore.
Il terreno in cui viene isolato è il Mannitol Salt Agar, terreno utilizzato per l'isolamento selettivo di
stafilococchi e il rilevamento dello Staphylococcus aureus da campioni clinici. Contiene:
• Estratto di carne bovina 1,0 g. Digerito pancreatico di caseina 5,0. Digerito peptico di
tessuto animale 5,0. Sono importanti perché forniscono i nutrienti essenziali.
• Cloruro di sodio 75,0. La sua concentrazione inibisce parzialmente o quasi del tutto la
crescita di batteri diversi dagli stafilococchi.
• D-mannitolo 10,0.
• Rosso fenolo 0,025 Agar 15,0
pH 7,4 ± 0,2
incubazione a 37°C per 24 ore.
Lo S. aureus è un patogeno umano piuttosto comune che si localizza nella zona delle mucose
nasofaringee e può essere isolato anche a livello della pelle e delle sue ghiandole, più raramente
nella vagina, nell’intestino e nel perineo. Può insorgere a causa di infezioni, interventi chirurgici
ortopedici, vascolari, inserimento protesi (per esempio al ginocchio), produce sepsi o causa danni
accidentali. In questo caso può portare alla morte dell’individuo. La virulenza di questo
microrganismo è causata dalla presenza di:
 • TOSSINE:
o citotossine, tossine esfoliative, TSS-1
o enterotossine, che possono contaminare vari alimenti.
• ENZIMI:
o Coaugulasi, che trasforma il fibrinogeno in fibrina, la quale protegge il batterio.
o Ialuronidasi, che idrolizza l’acido ialuronico del tessuto connettivo favorendo la
diffusione batterica. Resistono all’idrolisi degli enzimi gastrici.
o Lipasi, penicillasi, nucleasi, fibrinolisina e catalasi.
• COMPONENTI STRUTTURALI, come gli acidi teicoici, la capsula, la proteina A e il
peptidoglicano.
Le principali malattie causate da questo microrganismo sono:
• ENTEROCOLITE, causata dall’enterotossina B
• Infezioni cutanee, come l’ORZAIOLO, l’IMPETIGINE, SICOSI della BARBA, …
• Infezioni profonde, come POLMONITE, BATTEREMIA, ENDOCARDITE, ...
Per debellarlo, esistono antibiotici specifici. Come spesso accade però, l’uso indiscriminato di
antibiotici ha portato allo sviluppo di ceppi resistenti, quindi insensibili all’azione di questi
antibiotici. Oggi, tra quelli più potenti vi è la vancomicina e la teicoplanina, capaci di debellare le
infezioni di questo batterio.
Per isolare questo batterio si eseguono vari esami colturali e microscopici, seguiti da un test della
sensibilità agli antibiotici, detto comunemente ANTIBIOGRAMMA.
L’antibiogramma è un esame in vitro in grado di valutare il grado di sensibilità (S) o di resistenza
(R) di un batterio nei confronti di un antibiotico. Quindi permette di determinare la terapia più
consona al caso che si sta analizzando. La sensibilità o la resistenza è visibile sulle piastre. Infatti se
la piastra presa in analisi presenta un alone bianco e trasparente intorno all’antibiotico utilizzato,
questo significa che la colonia è sensibile a quell’antibiotico. Se la colonia continua a crescere sulla
piastra in presenza dell’antibiotico, vuol dire che è resistente ad esso.
Gli antibiotici usati nell’esperienza sono quattro e possiedono parametri di resistenza e sensibilità
diversi. I parametri si basano sulla lunghezza in mm del diametro dell’alone formatosi attorno
all’antibiotico.
CLORAMFENICOLO ERITROMICINA RIFAMPICINA CEFOPSITINA
RESISTENZA (R) <18mm <18mm <23mm <22mm
SENSIBILITA’(S) ≥18mm ≥21mm ≥26mm ≥22mm

MATERIALI UTILIZZATI
STRUMENTI

• 10 g di H2O triptonata
• Spatola per pesare il terreno
• 3 piastre petri
• Timer
• Autoclave
 • Spettrofotometro
• Cuvette
• Cappa microbica
• frigorifero
• Micro pipetta
• 1 ansa monouso da 1 microlitro
• Scotch da autoclave: indicatore di sterilità
• Becco di Bunsen: è un bruciatore di un flusso continuo di gas senza rischio che la fiamma
abbia un ritorno nel tubo e giunga fino alla bombola. In genere utilizza agar naturale o gas di
petrolio liquefatto.
• Microscopio ottico dove andarli a prendere.
• Congelatore
• Termostato
• Contenitore apposito: uno per ogni antibiotico. Consiste in un tubicino con una molla per
facilitare il dischetto ad uscire

VETRERIA
• 2 bottiglie graduate
• cilindro graduato
• becher
• parafilm

TERRENI UTILIZZATI
• Mannitol Salt Agar
• Mueller hinton Agar

PROCEDIMENTO

Operazione preliminare: siglare le piastre petri con il nome del terreno che conterranno.

Preparazione terreno Mannitol Salt Agar.

7. Misurare 400ml di acqua deionizzata utilizzando il cilindro graduato.
8. Pesare 15,2 g di Mannitol Salt Agar nella bottiglia graduata ed etichettata con lo scotch da
autoclave.
9. Versare insieme al terreno l’acqua pesata in precedenza. Agitare e autoclavare a 121°C per
15’.
10. Colare il composto su una piastra petri siglata con un pennarello indelebile in precedenza.
11. Lasciare solidificare in frigo.

Preparazione terreno Mueller hinton Agar.

6. Misurare 400ml di acqua deionizzata utilizzando il cilindro graduato.
7. Pesare 12,5 g di Mueller hinton Agar nella bottiglia graduata ed etichettata con lo scotch da
autoclave.
8. Versare insieme al terreno l’acqua pesata in precedenza. Agitare e autoclavare a 121°C per
15’.
9. Colare il composto su due piastre petri già siglate in precedenza.
10. Lasciare solidificare in frigo.
Semina delle piastre.

1. Sulla piastra Mannitol Salt Agar isolare lo Stafilococco con la semina a quadranti e incubare
a 37°C per 24 ore.

2. Preparazione dell’inoculo.

o Prelevare un po’ di soluzione fisiologica ed inserirla in un flacon

o Prelevare con l’ansa lo S. aureus e scaricarlo nella flacon
o Con una pipetta prelevare 1 ml della soluzione appena creata ed inserirla in una
cuvetta (inoculo).
o Inserire l’inoculo nello spettrofotometro a 600 nm e standardizzarlo a 0,5.
o Misurare la densità ottica. Se non raggiunge lo 0,5 aggiungere ancora lo
Stafilococco.

3. Protocollo di diffusione dell’antibiotico per la creazione dell’antibiogramma.

o Immergere un tampone nel flacon contenente la sospensione e scartarlo sulla piastra

contenente Mueller Hinton Agar.
o Effettuare una croce e poi diffonderlo su tutta la piastra, in modo da creare un
tappeto.

o Con l’aiuto di una pinzetta prelevare da un contenitore apposito il discheto di

antibiotico.
o Entro 15 minuti depositare il dischetto al centro del Meller Hinton Agar
precedentemente seminato. Il lato dischetto che si vedrà è quello su cui vi è stampata
una scritta, che corrisponde al nome dell’antibiotico.
o Incubare a 37° C per 24 ore.
o A fine incubazione misurare l’alone formatosi attorno all’antibiotico e calcolare la
deviazione standard.

CALCOLI
Dopo aver misurato il diametro delle due piastre, confrontare i valori delle piastre dei colleghi
presenti all’esperienza e aventi gli stessi antibiotici analizzati.
In questo caso sono stati presi i valori dei diametri dell’eritromicina e del cloramfenicolo.
 • CLORAMFENICOLO
CHIARA X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7
24 mm 24mm 28mm 27mm 26mm 26mm 27mm 27mm

• ERITROMICINA
CHIARA X1 X2
35mm 38mm 36mm

A questo punto calcolare la media dei due antibiotici e la deviazione standard.

MEDIA= Xm =

Xm(eritromicina)= = 36,3mm

Xm(cloramfenicolo)= = 26,14mm

DEVIAZIONE STANDARD= ꝺ =

ꝺeritromicina = 1,52
ꝺcloramfenicolo = 1,37

CONCLUSIONI
CLORAMFENICOLO ERITROMICINA
RESISTENZA (R) <18mm <18mm
SENSIBILITA’(S) ≥18mm ≥21mm
Dai risultati ottenuti dalla media degli antibiotici eritromicina e cloramfenicolo si può dedurre che:

Xm(cloramfenicolo)= 26,5mm > 18mm Xm(eritromicina)=36,3mm > 18mm

Lo S. aureus è sensibile all’eritromicina. Lo Staphylococcus aureus è sensibile

al cloramfenicolo.

Facendo un confronto si può affermare che l’eritromicina è un antibiotico più potente del
cloramfenicolo, in quanto è in grado di debellare più colonie di S. aureus.
 CONTA VITALE
ESCHERICHIA
COLI

SCOPO
Coltivare E. coli determinandone il numero di cellule vitali per creare una curva di crescita.
PRINCIPIO TEORICO
L’E. coli è un batterio Gram negativo, aerobio o anaerobio facoltativo, flagellato, e vive come
simbionte nel colon dell’intestino umano. Infatti contribuiscono alla produzione di vitamina K e
contrastano la colonizzazione intestinale di patogeni. Fermenta il lattosio a 37°C- 44°C.
Essendo un enterobatterio vive comunemente nell’intestino di animali a sangue caldo (uccelli,
mammiferi, compresi l’uomo). La presenza nei corpi idrici segnala condizioni di fecalizzazione,
insieme agli enterococchi.
Non tutti però si possono considerare “alleati” dell’uomo. Infatti alcuni ceppi sono patogeni e
causano infezioni per via esogena (gastro enteriti) ed endogena (urinaria). Ad esempio, le infezioni
gastro intestinali sono causate da 6 gruppi di E.coli:
EIEC, EHEC e EAEC colpiscono intestino crasso
EPEC, DAEC, ETEC, EAEC colpiscono il tenue
Alcune delle infezioni per via esogena sono:
• Gastroenterite, detta anche diarrea del viaggiatore. È mediata dal rilascio di tossine
termolabili e termostabili che richiamano acqua ed elettroliti nel lumen intestinale e da
adesine.
• Diarrea infantile, causata dall’adesione del batterio all’intestino tenue. Ciò comporta la
distruzione dei microvilli delle cellule intestinali.
Il terreno prediletto dagli Escherichia coli è il Mueller Hinton Agar, terreno molto nutriente
composto da:
• Estratto di carne bovina 2,0 g
• Idrolizzato acido di caseina 17,5
• Amido 1,5
• Agar 17,0
pH finale è di 7,3 ± 0,2
La crescita microbica un incremento dei costituenti cellulari che porta all'aumento di dimensioni
della cellula batterica, all'aumento numerico della popolazione batterica o entrambe le cose. Se un
microrganismo aumenta di dimensioni e non si divide è detto cenocitico. In questo caso non si ha
aumento numerico della popolazione. Se un microrganismo aumenta di dimensioni e si divide
dando origine a due cellule figlie fa aumentare il numero di cellule della popolazione.
Nell’esperienza si è realizzata una curva di crescita E. coli, che serve per effettuare il test di crescita
in presenza di agenti stressanti. La curva serve per comprendere quanti microrganismi sono vitali e
quali no. Per far ciò si calcola la torbidità del campione attraverso la densità cellulare. La
sospensione cellulare appare torbida poiché le cellule trattengono la luce. All’aumentare le cellule,
aumenta la quantità di luce trattenuta, quindi aumenta il grado di torbidità. La torbidità viene
misurata attraverso uno strumento, lo spettrofotometro. L’unità di misura della torbidità è
l’assorbanza (A).

MATERIALI UTILIZZATI
STRUMENTI
• 10 g di H2O triptonata
• 7 provette per le diluizoni seriali
• spatola per pesare il terreno
• 6 piastre petri
• 6 puntali monouso
• autoclave
• 3 anse monouso da 1 ml
• porta provette con 7 provettoni (16x 1 cm)
• soluzione fisiologica in spruzzetta: H2O distillata
• micropipetta
• scotch da autoclave: indicatore di sterilità
• termostato
• spettrofotometro
• cappa microbiologica (per incubazione)
• frigorifero

VETRERIA
• 1 bottiglia graduata
• cilindro graduato
• becher
• parafilm

TERRENI
• Mueller Hinton Agar

MICRORGANISMI
• E. coli
SOSTANZE
• Acqua deionizzata
PROCEDIMENTO
Preparazione terreno Mueller Hinton Agar.
12. Misurare 400ml di acqua deionizzata utilizzando il cilindro graduato.
13. Pesare con una spatola sulla bilancia tecnica 12,5 g di Mueller Hinton Agar nella bottiglia
graduata ed etichettata con lo scotch da autoclave.
14. Versare insieme al terreno l’acqua pesata in precedenza. Agitare e autoclavare a 121°C per
15’.
15. Una volta che il terreno si sarà solidificato sotto cappa, colare il composto su una piastra
Petri siglata con un pennarello indelebile in precedenza. Le piastre vanno siglate da -1 a -6.
16. Lasciare solidificare sotto cappa.

Diluizioni seriali.
1. Siglare le provette da -1 a -6
2. Preparare una soluzione fisiologica contenente 10ml di acqua deionizzata ed Escherichia
coli in sospensione.
3. Effettuare delle diluizioni seriali 1:10 (1ml in 9ml) partendo dalla provetta -1. Utilizzare una
micropipetta da 1ml e 6 puntali monouso per ogni diluizione.
4. Prelevare con la micropipetta la diluizione -1 inserendola nella piastra -1 per seminarla.
Ripetere il passaggio per le altre provette e piastre. La semina avviene per assorbimento.
5. Incubare nel termostato a 37°C per 24ore.
6. Passate le 24 ore effettuare la conta microbica sulle piastre -4,-5,-6.
Costruzione curva di crescita.
1. Per calcolare la densità ottica e quindi il grado di torbidità di ogni diluizione, preparare 6
cuvette da 1ml l’una.
2. Prelevare con la micropipetta 1 ml di soluzione dalla prima provetta e inserirla nella prima
cuvetta. Ripetere i passaggi per tutte le provette. Quindi in totale si avranno 6 cuvette con 6
diluizioni diverse.
3. Mettere una alla volta le cuvette nello spettrofotometro per misurare l’assorbanza(A) di
ognuna di esse.
4. Con i risultati ottenuti costruire una retta di taratura.

RISULTATI
Qui sotto sono riportati i dati ottenuti:
DILUIZIONE ASSORBANZA
-1 0,592
-2 0,548
-3 0,588
-4 0,067
-5 0,116 Prendere in considerazione solo queste due
-6 0,525 diluizioni per effettuare la conta delle piastre.
CALCOLI

Piastra -5: = 320.000.000 CFU = 3,2*10^8 CFU

Piastra -6: = 1.080.000.000 CFU = 1,1*10^9 CFU

RETTA di TARATURA

x y(retta)
3,2*10^8 0,116
1,1*10^9 0,525
3,2*10^9 0,934
1,1*10^10 1,343
3,2*10^10 1,752
1,1*10^11 2,161
3,2*10^11 2,57
1,1*10^12 2,979
3,2*10^12 3,388
1,1*10^13 3,797