UNIVERDIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y

BIOQUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA
CÁTEDRA BIOLOGÍA MOLECULAR

PRÁCTICA N°8
DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION

CATEDRATICO:

Dra. XIMENA TABORGA

ESTUDIANTES:

Univ. APAZA GUTIERREZ LOURDES

Univ. NELSON POMA MAMANI

Univ. RENE CARLOS CHAMBI NICOLAS

Univ. ZAMORANO QUISPE FANNY LIZSHET

DÍA DE PRÁCTICA: JUEVES “B”

GRUPO: PAR

FECHA: 12 DE AGOSTO DEL 2019

LAPAZ-BOLIVIA
 DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION
1. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Verificar la desnaturalización y renaturalización del DNA por espectrofotometría

y electroforesis en gel de agarosa.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Comparar el efecto desnaturalizante por el cambio de temperatura sobre la

hebra de DNA.
Observar el efecto hipercromico del DNA mediante las absorbancias.
Ver e indicar la diferencia entre desnaturalización y renaturalización.

2. METODOLOGIA

Muestra de DNA
Estas 3
temperaturas: 4ºC
37ºC 60ºC al
baño maría
Preparar 4 eppendorf para 4
diferentes temperaturas: 4ºC 37ºC
60ºC 80ºC poner a cada uno de
estas temperaturas 600 ul de
muestra de DNA .La última
temperatura se lo realiza a
ebullición y los otros a baño maria
estufa, refrigerador. Calculando
siempre la temperatura.

Temperatura 4°C:

El tubo a la temperatura de 4°C al

refrigerador por espacio de 10 minutos
Temperatura 37 °C:
El tubo a la temperatura de 37 °C se
lo realizo en una estufa por espacio de
10 minutos

El tubo eppendorff a la
temperatura de 60°C se lo
realizo en baño maría por
espacio de 10 minutos

Temperatura 60°C

Temperatura 80 °C:

El tubo eppendorf a la temperatura de

100°C se lo realizo en ebullición por
espacio de 10 minutos
 Electroforesis

Pasados los 10 min llevamos al

baño de hielo todos los tubos

De cada temperatura sacar 200ul

de muestra a otro eppendorf y
agregar una gotita de tampón de
cargado a cada uno todo el
proceso sobre hielo para luego
cargar al gel y su posterior corrida
para luego leer en el

Después de la corida
electroforética
 Poner el resto de la muestra que es
400ul más 200ul de TNF 1x para luego Leemos a 260 nm cada
llevar al espectrofotómetro y leer a 260 temperatura
nm cada muestra en su temperatura

3. RESULTADOS

Corrida electroforética de las muestras de DNA en diferentes condiciones de

temperatura en gel de agarosa revelado con bromuro de etidio en el
transiluminador

TRATAMIENTO CON
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
FORMALDEHIDO

TEMPERATURA ABSORBANCIA 1.solo DNA

2.0%
37ºC 0,261
3.6%
60ºC 0,176 4.8%
TRATAMIENTO CON CALOR
5.10%
95ºC 0,225
6. Temp ambiente
120ºC 0,104
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 7 :37°C

8 :60°C

9 :95°C
TABLA Nº1 ABSORBANCIA A 260 nm PARA EL EXTRACTO DE DNA

CONCENTRACION ABSORBANCIA

0 0.280

6 0.845

9 1.021

10 0.845

BACTERIANO A DIFERENTES TAMAÑOS

GRAFICA Nº1 Desnaturalizacion del DNA

0.3
ABSORBANCIAS

0.2
0.1
0
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
TEMPERATURA

TABLA Nº2 ABSORBANCIA A 260nm DE LA MUESTRA DE DNA TRATADA CON

FORMALDEHIDO

Nota: se realizó 3 veces la lectura correspondiente en el espectrofotómetro por lo que

se hizo el cálculo correspondiente para obtener la absorbancia

4. DISCUSION

La estructura helicoidal del DNA se mantiene gracias a interacciones no covalentes.

Por un lado, el apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece
interacciones hidrofobicas entre éstas, y por otro lado, cada base está unida a su
pareja mediante puentes de hidrógeno. La energía libre de las interacciones no
covalentes que mantienen la estructura helicoidal del DNA no es muy superior a la
energía de los movimientos térmicos a temperatura ambiente, por lo que es posible
desestabilizar la estructura tridimensional del DNA mediante un simple aumento de la
temperatura.

La desnaturalización del DNA en la práctica se llevó a cabo por un factor físico que es
la temperatura, ambiente, 60 ºC, 100 ºC Y 120 ºC. El cual se verifico midiendo el
comportamiento electroforético y el cambio de absorbancia del mismo.

Según la corrida electroforética se observó cualitativamente la desnaturalización del

DNA a diferentes niveles por la varianza de las temperaturas donde a mayor
temperatura, mayor energía calórica.

Para los resultados de la práctica se utilizó diferentes temperaturas las cuales fueron a
37 °C, 60 ºC, 100 ºC y 120 ºC en las cuales se realiza la desnaturalización del DNA al
llevarlos a 10 minutos en dicha temperatura luego se llevó al hielo durante 5 minutos
para su respectiva renaturalización del DNA. Se sembró 10 uL de la muestra de
diferentes temperaturas en un gel de agarosa y se hizo la corrida correspondiente, a,
60 ºC,100 °C y 120 ºC. que corresponden a las bandas 8, 9 y 10 se observa bandas
de DNA bien definidas y borrosas eso muestra que la renaturalización del DNA fue
exitosa y a la temperatura, de 100 ºC que corresponde al carril 9, luego se llevó a
espectrofotometría para comprar los resultados con el sembrado de DNA a las
diferentes temperaturas ya que se hizo diluciones con 230 uL de TNE con 20 uL de la
muestra, y los resultados muestran que a la temperatura de 37 °C la absorbancia es
de 0,261, 60 ºC, es de 0,176 la cual disminuye y a 100 ºC 0,225, 120 ºC. 0.104 en el
caso de 100 ºC desnaturalizado, lo que indica que el DNA absorbe más luz a 260 nm.

Con el procedimiento con formaldehido de acuerdo a los resultados obtenidos

observamos en el carril 1 (control) una corrida normal, con respecto al carril 2
observamos una corrida similar ya que tiene 0% de formaldehido, en los siguientes
carriles 3 y 4 se ve claramente un rastro blanco en los pocitos (formaldehido)
indicando que no hay corrida de la muestra debido a la carga eléctrica que posee el
formaldehido desnaturalizando así al DNA también dando entender que el DNA esta
con proteínas por la luminosidad que presenta el pocito ya que el DNA no es puro. El
formaldehido es un mutágeno químico sobre el DNA, los mutágenos químicos
ocasionan inestabilidad general que produce cambios químicos en el DNA; cambian
químicamente las bases, con lo que causan errores de apareamiento.

5. CONCLUSIONES

 En la práctica se logro verificar la desnaturalización y renaturalizacion del DNA

por los métodos de espectrofotometría y electroforesis en geles de agarosa.
 Se llevo la muestra de DNA a diferentes temperaturas y se comparo el efecto
desnaturalizante sobre la hebra del DNA.
 Se diferencio lo que es desnaturalización y renaturalizacion y cuando estos
procesos se pueden producir.
6. CUESTIONARIO

1.- Explique la desnaturalización del DNA con el factor de concentración de

sales.

Cuando se rompen las fuerzas de unión entre las dos hebras de DNA, por lo tanto el
DNA es desnaturalizado es de una sola hebra.

La forma más corriente de desnaturalizar el DNA es por el calentamiento. Otro agente

desnaturalizante es el pH porque cambia la carga de algunos grupos que forman parte
de los puentes de hidrogeno. En agua destilada (con una fuerza iónica muy reducida)
se producen la separación de hebras. Este fenómeno se debe a que en agua muy
pura, la fuerte repulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfatos no es
contrarrestada por los correspondientes contra iones.

2.- Como se puede detectar estructuras secundarias de DNA por electroforesis.

Actualmente se aplican en una cadena de análisis combinados entre ellas y con otras
metodologías como extracciones, modificaciones enzimáticas y químicas, y
purificación. Todo con el fin de probar hipótesis sobre el papel de las biomoleculas en
el flujo de la información genética.

3.- A que se debe el efecto hipocrómico?

El efecto hipercrómico es el incremento de absorbancia en un material. El caso

opuesto es el efecto hipocrómico. El caso más conocido es la hipercromicidad del
ADN, que ocurre cuando el dúplex se desnaturaliza, dando dos cadenas sencillas que
absorben más en el ultravioleta. Esta característica del ADN es una forma de seguir el
proceso de desnaturalización de la molécula: a medida que el proceso avanza, se
observa un incremento en la absorbancia.

4.- Que es estructura secundaria del DNA?

Es una estructura en doble hélice. Permite explicar el almacenamiento de la

información genética y el mecanismo de duplicación del ADN
5.- Proponga una cadena de 20 nucleótidos, saque el Tm con las formulas
expuestas en la introducción de esta práctica y utilice el programa
Oligocalculator. Discuta los resultados

El cálculo de Tm para moléculas menores de 50 pb: utilizando la siguiente formula

Tm= 2°C (A+T) + 4°C(G+C)

Tm= 2°C (4+2) + 4°C (9+5)

Tm= 18+ 56

Tm= 74°C

Calculo del Tm según el programa de Oligocalculator; Se introdujo los datos 20

nucleótidos el cual dio como resultado 66°C de la temperatura de fusión que varía en
4°C que se obtuvo con la formula.

7. BIBLIOGRAFIA
Montoya Y, Baldeviano C, Caballero A, Cáceres O, Calderón R, De los Santos,
M, et al. (1999). Guía de práctica del curso teórico-práctico: electroforesis de
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revisión: 7/05/2019
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https://bitesizebio.com/10248/agarose-gels-do-not-polymerise/ . Última revisión:
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Sánchez, R. (2019). Guía de Prácticas de Biología Molecular. La Paz. Bolivia
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http://www.edvotek.com/site/pdf/101sp.pdf
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Bandow J, Baker JD, Berth M, Painter C, et al. (2008). Improved image analysis
workflow for 2-D gels enables large-scale 2-D gel-based proteomics studies -
COPD biomarker discovery study. Proteomics
Guadalupe Yunuén; M. C. Humberto; Juliette Morlon-fitgot ; ¨AISLAMIENTO DE
ACIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE GELES DE AGAROSA¨; INSTITUTO DE
INVESTIGAC IONES BIOMEDICAS U. N. A. M. Obtenido de:
https://www.google.com/search?
rlz=1C1ASRM_enBO760BO762&sourceid=chrome&ie=UTF8&q=https%3A%2F
%2Fwww.google.com%2Furl%3Fsa%3Dt%26source%3Dweb%26rct%3Dj
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%26ved%3D2ahUKEwin5aM9IriAhVJX60KHRZwCTEQFjAGegQIARAB
%26usg%3DAOvVaw16PzUcfnFaWOUpKxCkWLLZ&gws_rd=ssl
http://biomodel.uah.es/tecnicas/inicio.htm#elf.