Diseño de un

Bioreactor para la
producción de
Insulina Humana a
partir de E Choli
W3110

2020
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE FIGURAS.........................................................................................................2
RESUMEN..........................................................................................................................4
ABSTRACT........................................................................................................................4
1. OBJETIVOS.................................................................................................................5
2. INTRODUCCIÓN.........................................................................................................6
3. MARCO TEÓRICO......................................................................................................7
3.1. DEMANDA DE INSULINA EN COLOMBIA..........................................................7
3.2. LEGISLACIÓN EN COLOMBIA............................................................................8
3.3. MÉTODO RECOMBINANTE PARA LA PRODUCCIÓN DE INSULINA............10
3.4. ESCHERECHIA COLI K12 W3110.....................................................................11
4. DISEÑO DE REACTORES FEDBACTH PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES..........................................................................................................14
4.1. MATERIAL DEL REACTOR............................................................................15
4.2. VENTAJAS DEL ACERO INOXIDABLE.........................................................15
5. DISEÑO DEL FERMENTADOR................................................................................17
5.1. BALANCE...........................................................................................................17
5.2. DIMENSIONAMIENTO DEL TANQUE Y SISTEMA DE AGITACIÓN................19
5.3. DISEÑO DEL SISTEMA DE ESTERILIZACIÓN................................................21
5.4. TIEMPO DE VACIADO DEL TANQUE...............................................................24
6. SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN.............................................................................27
ETAPAS PRIMARIAS DE RECUPERACIÓN...............................................................27
6.1. ETAPA 1: CENTRIFUGACIÓN (ANTES DEL ROMPIMIENTO CELULAR)......27
6.2. ETAPA 2: ROMPIMIENTO CELULAR (MOLINO DE PERLAS):.......................29
6.3. ETAPA 3: CENTRIFUGACIÓN (DESPUÉS DEL ROMPIMIENTO CELULAR) 29
6.4. ETAPA 4: CROMATOGRAFÍAS.........................................................................30
6.5. ETAPA 5: ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF / TOF [31]................31
7. RIESGOS EN EL PROCESO....................................................................................32
8. REFERENCIAS.........................................................................................................34
9. ANEXOS....................................................................................................................38
9.1. PLANO DEL REACTOR.....................................................................................38

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TABLA DE FIGURAS

Figura 1. Concentración de insulinas permitidas en los medicamentos............................9

Figura 2. Producción de la insulina a través de la bacteria Escherichia coli ..................10
Figura 3. Origen de E. Coli K-12 a partir de cepas MG1655 y W3110............................11
Figura 4. Tabla de principales recombinantes de uso terapéutico producidas por E. coli.
..........................................................................................................................................13
Figura 5. Variación de la altura del medio en el fermentador a través del tiempo..........25
Figura 6. Etapas de separación y purificación.................................................................27
Figura 7. Plano del fermentador.......................................................................................38

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Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

RESUMEN

Una de las contribuciones más importantes de la biotecnología moderna es la

producción de proteínas recombinantes (PR). El hospedero bacteriano más importante
para la producción de PR es Escherichia coli, no obstante otros como Bacillus subtilis y
Bacillus megaterium están cobrando cada vez más relevancia. Debido a su impacto en
el Sector de la salud y en el ámbito económico el presente trabajo se centrara
principalmente en la producción de PR terapéuticas en E. coli. Se abordaran en general
los aspectos de diseño del vector, la cepa, el cultivo y la purificación de la PR, con
énfasis en las oportunidades que la ingeniería metabólica proporciona para mejorar la
producción de PR y las estrategias de cultivo.
Palabras clave: Proteína recombinante, Escherichia coli, Biorreactores, insulina.

ABSTRACT
One of the most important contributions of modern biotechnology is the production of
recombinant proteins (RPs). The most important bacterial host for PR production is
Escherichia coli, however others such as Bacillus subtilis and Bacillus megaterium are
becoming increasingly important. Due to its impact in the health sector and in the
economic field, this paper will focus mainly on the production of therapeutic PR in E.
coli. The design aspects of vector, strain, culture and purification of RP will be
addressed in general, with emphasis on the opportunities that metabolic engineering
provides to improve RP production and culture strategies.

Keywords: Recombinant protein, Escherichia coli, Bioreactors, insulin.

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1. OBJETIVOS

1.1. Objetivo general:

Diseñar un birreactor que permita producir Insulina humana a partir de EColi W3110

1.2. Objetivos específicos:

 Calcular la cantidad de Insulina humana a producir de forma que se pueda
suplir al menos el 20% de la demanda en Colombia
 Hallar las dimensiones del reactor que permita cumplir con la demanda de
Insulina calculada.
 Escoger el material adecuado para el reactor.

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2. INTRODUCCIÓN

Los cambios en la dieta y el estilo de vida de las personas están causando un aumento
dramático en la incidencia de diabetes en todo el mundo. Los pacientes con diabetes
tipo I y tipo II usan insulina, sin embargo, los pacientes con diabetes tipo II en etapa
tardía requieren grandes dosis de esta hormona a medida que desarrollan resistencia a
la misma. El aumento dramático en el número de pacientes diabéticos a nivel mundial y
la exploración de métodos alternativos de administración de insulina, como la inhalación
o la vía oral, están destinados a aumentar la demanda de insulina recombinante en un
futuro próximo. En los próximos 20 años, la OMS ha estimado que la venta de insulina
crecería de 12 mil millones USD a 54 mil millones USD a nivel mundial. [1]
La insulina humana está compuesta por 51 aminoácidos y tiene un peso molecular de
5808 Da. Es producido por las células beta del páncreas y juega un papel clave en la
regulación del metabolismo de carbohidratos y grasas en el cuerpo. La insulina se
sintetiza como un polipéptido único conocido como preproinsulina en las células beta
pancreáticas. La preproinsulina alberga un péptido señal de 24 residuos, que dirige el
polipéptido naciente al retículo endoplásmico. El péptido señal se divide a medida que
el polipéptido se transloca en el retículo endoplásmico del ser humano, dando como
resultado la formación de proinsulina. En el retículo endoplásmico, la proinsulina se
acomoda en la confirmación adecuada con la formación de 3 enlaces disulfuro. Esta
proinsulina se transporta a la red del trans Golgi, donde se convierte en insulina activa
mediante endopeptidasas celulares llamadas convertasas de prohormona (PC1 y PC2)
y exoproteasa carboxipeptidasa E. Las endopeptidasas se separan en dos posiciones,
lo que resulta en la liberación de un fragmento denominado como péptido C. La insulina
madura, así formada, consiste en una cadena A con 21 aminoácidos y una cadena B
que contiene 30 aminoácidos y ambos polipéptidos unidos por dos enlaces disulfuro.
Además, la cadena A tiene un enlace disulfuro intracadena. [2,3]
Desde principios de la década de 1920, los pacientes diabéticos fueron tratados con
insulina, que se purificó del páncreas bovino o porcino. El desarrollo en el campo de la
ingeniería genética permitió la producción de insulina en E. coli y levadura. [4,5]
La bacteria Escherichia coli es un bacilo Gram-negativo que pertenece a la familia
Enterobacteriaceae, es habitante normal del tracto intestinal de animales y también se
encuentra habitualmente en el ser humano, se puede encontrar en el medio ambiente
ya que es capaz de sobrevivir durante cierto tiempo en el agua y los alimentos, de
manera que su aislamiento en los mismos es indicador de contaminación fecal. Esta
bacteria es el hospedero bacteriano más importante para la producción de Proteínas
recombinantes (PR). Aplicando el método de obtención de proteínas recombinantes en
la E. coli se insertan genes humanos en el ADN de las bacterias para que estas

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elaboren el nuevo material, que para este caso es la insulina humana; y así elaborar un
proceso de reproducción de estas células para lograr una producción en masa. [6,7]

3. MARCO TEÓRICO
3.1. DEMANDA DE INSULINA EN COLOMBIA

La diabetes es una enfermedad que ha afectado a muchos colombianos desde siempre.

La Asociación Colombiana de Diabetes estimó que el 7 % de los
colombianos padece esta enfermedad, es decir cuatro millones de personas y, de
éstos, la mitad no lo sabe.[8] Esto nos deja al menos 2 millones de colombianos
diagnosticados con la enfermedad. De estos dos millones de colombianos
aproximadamente 17% se les prescribe insulina como tratamiento. En promedio estos
pacientes que necesitan del medicamento consumen 63,6 UI de insulina diariamente
con rangos desde 33,33 hasta 1000 UI diarias. [9] Hay que tener en cuenta que durante
los últimos años los diagnosticados con diabetes han aumentado, lo que crearía un
aumento de la demanda de insulina. Según datos de la Organización Mundial de la
Salud esta enfermedad afecta a 382 millones de personas y se calcula que para el año
2030 padecerán 560 millones de seres humanos en el mundo.[10] Esto demuestra la
importancia de estar preparados para el aumento de la demanda de insulina en
Colombia y en el mundo. En base con los datos anteriormente mencionados se hace un
cálculo aproximado de cuanta insulina sería necesaria producir para suplir la demanda
en Colombia tal como lo muestra la siguiente formula:

N° de pacientes con diabetes x Porcentaje de pacientes que se les transcribe insulina x

Consumo de insulina promedio por paciente = Unidades de insulina que se necesitan
diariamente en Colombia.
El resultado final queda en Unidades de Insulina por día necesarias, luego este
resultado se multiplicó por un factor de conversión, para calcular los gramos de Insulina
pura y demanda en Colombia diariamente. Este cálculo se realiza por medio de la
siguiente ecuación:

6 17 necesitan Insulina 6 3,6 UI promedio 3,5 mg Insulina pura

2 ×10 Pacientes × × × =756 , 84 gr de Insulina pura al di
100 Pacientes dia 100 UI
Ya que para este proyecto se desea cubrir gran parte de la demanda de Insulina en
Colombia, se podría decir que este proceso se quiere cubrir al menos 20% de la
demanda lo que sería aproximadamente 151 gr de insulina al día.

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3.2. LEGISLACIÓN EN COLOMBIA

En Colombia todos los medicamentos se encuentran legislados por el ministerio de

salud y protección social en la resolución número (111166 DE 2015 26 AGO 2015) Por
medio de la cual se define y se implementa el estándar de datos para medicamentos de
uso humano en Colombia, esta a su vez debe cumplir con las normas farmacológicas
decretadas por el instituto nacional de vigilancia de medicamentos y alimentos
(INVIMA). [11,12]

Basándose en las normas farmacológicas de 2019 publicadas por el INVIMA, la insulina

debe cumplir con la norma 9 de hormonas y reguladores hormonales, específicamente
el numeral 9.1.10. de insulinas, la cual te remite a la norma 8 de medicamentos
gastrointestinales y de metabolismo, específicamente el numeral 8.2.3.N10 de
Antidiabéticos, hipoglicemiantes orales y parenterales e Insulinas, por la cual se
aceptan [12]:

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Figura 1. Concentración de insulinas permitidas en los medicamentos.[12]

3.3. MÉTODO RECOMBINANTE PARA LA PRODUCCIÓN DE INSULINA

Siguiendo la metodología descrita por Rosabelhi (Et al. 2008) primeramente, se clonan
los genes con la β-galactosidasa en el plásmido pBR322. La recombinación de los
plásmidos es amplificada en E. coli. Se lleva a cabo una transformación de la bacteria,
en dos nucleótidos diferentes, luego la reacción entre la proteína β -gal y el gen de la
insulina con la metionina hace que el complejo proteico cambie, expulsando de esta

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manera la molécula de la metionina y produciendo al final la insulina con menos

aminoácidos que al inicio del proceso por el método de la recombinación.

El mecanismo de la separación de la insulina es a través del sistema RP-HPLC

(Reversed-Phase High Performance Liquid Cromatography) por sus siglas en inglés, la
cual es utilizada para separa la insulina de otras especies, basada en una gran variedad
de diferentes aminoácidos y gracias a la hidrofobicidad de la insulina relacionada con
otros componentes. La tendencia de las proteínas debe ser generalmente con las
proteínas mas grandes que se encuentren en una fase estacionaria, en la cuela tiene
una gran limitación del soporte de alcalinidad.[13]

Figura 2. Producción de la insulina a través de la bacteria Escherichia coli .[13]

3.4. ESCHERECHIA COLI K12 W3110

La Escherichia coli W3110 y MG1655 son usadas para una cantidad substancial de
trabajos sistemáticos enfocados en la caracterización de la E. Coli K-12 Escherichia coli
W3110 y MG1655 se utilizan para una cantidad sustancial de trabajo sistemático
destinado a caracterizar. Por ejemplo, se ha utilizado W3110 para crear una base de
datos de los niveles de expresión de E. coli proteínas en diferentes condiciones de

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crecimiento, para la construcción de un mapa físico del cromosoma de E. coli, y para la

secuenciación sistemática de cromosomas. De todos modos, ha notado que la W3110
contiene varias mutaciones puntuales, como, así como una inversión de un segmento
cromosómico considerable así también, la cepa MG1655 ha logrado el estado de
representar el K-12 naturalmente. Por ejemplo, MG1655 se utilizó como fondo genético
para caracterizar los fenotipos de varias mutaciones de ARN polimerasa para estudios
sobre el control de la síntesis de ribosomas, sin embargo, W3110 y MG1655 están
estrechamente relacionados entre sí y son derivados de la cepa Lederberg W1485, que
surgió de la cepa original de E. coli K-12 después del tratamiento con luz UV (Figura 2).

Figura 3. Origen de E. Coli K-12 a partir de cepas MG1655 y W3110.[14]

La Escherichia coli K12 (EcK12) se usa comúnmente con fines de tecnología genética y
se considera una cepa de seguridad debido a su incapacidad para adherirse a las
células epiteliales. La composición convencional de microbiota intestinal es crítica para
la resistencia a la colonización fisiológica contra la mayoría de las especies bacterianas,
incluidos los patógenos.
Después de su primera identificación en 1922 y su posterior caracterización, E. coli K12
(EcK12) se ha utilizado ampliamente con fines de clonación genética y debido a
defectos genéticos, EcK12 se considera patógeno y es incapaz de adherirse a las
células epiteliales intestinales y, por lo tanto, de colonizar vertebrados. EcK12 (W3110),
que difiere de la cepa parental K12 por una gran inversión cromosómica, y los
derivados genéticamente modificados no pudieron colonizar el tracto intestinal de los
vertebrados en absoluto, y los cobayas que albergan un microbiota intestinal
convencional mostraron resistencia a la colonización desafío peroral.[15]

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La metodología de ADN recombinante requiere de una amplia variedad de mutantes de

Escherichia coli que son comunes en los laboratorios de Biología Molecular. Muchas de
estas cepas son derivadas de manipulaciones genéticas realizadas a partir de la
década del 40 del siglo XX.
El uso extendido de E. coli en este campo se debe a su fácil manipulación, su rápido
crecimiento, el bajo costo de los medios de cultivo empleados para su propagación y el
conocimiento acumulado de su bioquímica, fisiología, la dinámica poblacional y
adaptación de su genoma. Estas cepas también son ampliamente utilizadas como
hospederas para la expresión de proteínas recombinantes en los procesos
biotecnológicos.
Los experimentos de evolución adaptativa en el laboratorio con algunas de estas cepas
de E. coli han demostrado la versatilidad de este microorganismo describiéndose un
amplio número de mutaciones adaptativas. Este fenómeno hace que la aplicación del
concepto de sistema de siembra por lotes no sea suficiente para garantizar los
genotipos originales de los mutantes. La pérdida del genotipo de interés se observa
sobre todo en cepas donde es abolida la actividad de la enzima RecA del sistema de
reparación de ADN, con una marcada disminución de la velocidad de crecimiento sobre
medios sólidos agarizados. La Colección Central de Microorganismos del Centro de
Ingeniería Genética y Biotecnología de La Habana (CIGB) ha desarrollado estrategias
para la verificación de los bancos de mutantes de E. coli de importancia biotecnológica.
Las metodologías combinan métodos moleculares y crecimiento en medios de cultivos
selectivos.[16]
La producción de PR en bacterias es una tecnología que surgió hace cerca de 30 años
y respondió a una necesidad de proveer proteína de uso terapéutico con un abasto
asegurado (que no dependiera de fuentes animales) y calidad constante. La primera PR
aprobada para su uso en humanos fue la insulina humana producida en Escherichia coli
por la empresa Genentech. Desde entonces, la tecnología de producción de PR ha
tenido un avance muy importante. Hasta el año 2010, el número de productos
biofarmacéuticos aprobados por la administración de Alimentos y drogas de los EUA
(FDA) era más de 200, de los cuales la gran mayoría son PR La importancia económica
de las PR de uso terapéutico es innegable: las 10 PR de mayor venta durante 2009
sumaron más de 50.000 millones de dólares en ventas.
Muchas de las PR terapéuticas requieren modificaciones postraduccionales que no
pueden ser llevadas a cabo por cepas bacterianas silvestres, por lo que son
preferentemente producidas por células eucariontes superiores. A pesar de ello, la
bacteria E. coli sigue siendo una plataforma ampliamente usada para la producción de
PR, ya que presenta una serie de ventajas importantes:

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Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

Su genoma es conocido desde hace varios años, lo que amplía considerablemente las
posibilidades de su manipulación genética, existe una gran cantidad de conocimiento
acumulado sobre su fisiología y metabolismo, se tienen varios vectores bien
establecidos para la producción de PR, puede crecer rápido en medios muy simples,
con altos niveles de producción de PR. Actualmente, cerca del 30 % de las PR de uso
terapéutico son producidas empleando k, las más importantes pueden consultarse en la
tabla 1. De un total de 58 productos aprobados por la FDA en el periodo 2006-2010, 17
son producidos usando E. coli y 32 empleando células de mamífero.[6]

Figur
a 4. Tabla de principales recombinantes de uso terapéutico producidas por E. coli. [6]

4. DISEÑO DE REACTORES FEDBACTH PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS

RECOMBINANTES

En los sistemas de cultivo fed batch, una solución concentrada del sustrato limitante es
alimentada al sistema con el fin de aumentar el crecimiento celular más allá del
permisible en la fase batch (S-O Enfors 2011) [17]. El medio de alimentación es
comúnmente una solución concentrada de la fuente de carbono/energía (en vez del

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Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

medio completo utilizado para cultivos continuos), comúnmente la concentración

máxima posible, de modo de minimizar el aumento del volumen del medio de cultivo. A
su vez se suele complementar con elementos trazas y vitaminas. La fermentación fed
batch en general es la estrategia de elección con fines productivos. Sin embargo, dicha
técnica posee una serie de desventajas, como la inhibición por sustrato, transferencia
de oxígeno limitada, formación de compuestos secundarios inhibitorios y limitaciones de
disipación de calor (Wang & Lee, 1998) [18].
La acción de control sigue una estrategia fija, que generalmente consiste en controlar la
tasa específica de crecimiento a un valor lo más grande posible evitando el
metabolismo de sobreflujo (ocasionado por una fermentación mixta). En la fermentación
mixta, posiblemente por una limitación río abajo del glicólisis, la fuente carbonada no es
completamente oxidada produciendo compuestos secundarios, que a su vez son
inhibidores del crecimiento celular. Al restringir su formación es posible prolongar el
crecimiento celular y aumentar los parámetros productivos. En caso de existir
restricciones físicas de transferencias de oxígeno, el control debe considerar dicha
restricción adicional mediante una estrategia de control diferente.
El metabolismo celular global puede ser simplificado mediante una reacción biológica
global que define al sistema:

∑ k i . Si →v k X . X + ∑ k j . P j
i j

En donde, Si, X y Pj son la concentración molar instantánea del sustrato i, la biomasa y

el producto j. ki, kX y kj corresponden a los coeficientes estequiométricos del sustrato i,
la biomasa y el producto j. v corresponde a la velocidad a la que ocurre la reacción
global.
La derivada temporal de la concentración de sustratos y productos se conoce como la
tasa volumétrica de consumo (rS) y formación (rP), respectivamente. Las tasas
volumétricas de consumo y producción, normalizadas por la biomasa (r/X), corresponde
a las tasas específicas de formación (CS) y consumo (CP), respectivamente.
Particularmente, la tasa específica de formación de biomasa (CX) tiene una
nomenclatura diferente y se le identifica con la letra griega µ. En general, se suele
modelar la velocidad de la reacción global a través de la velocidad de consumo del
sustrato limitante mediante una cinética tipo Monod:
C Smáx . S
C S=
K S+ S

Para relacionar las tasas de consumo/formación se definen los rendimientos:

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k X CX r X
Υ X= = =
P k P CP r P

Luego, conociendo los rendimientos y la velocidad a la cuál ocurre la reacción es

posible modelar el proceso de manera dinámica. Acoplando las reacciones celulares
con los balances de masa, se tiene:
d (C . V )
=F ¿ . C¿ −F out . C ( t )+ Cc . X . V
dt
En donde C, corresponde a la concentración instantánea del sustrato/producto; V
corresponde al volumen del medio de cultivo; Fin y Fout corresponden a los flujos de
entrada y salida al sistema; Cin es la concentración del sustrato/producto en la
alimentación; y Cc corresponde a la tasa específica de formación/consumo del sustrato
o producto c. [19]

4.1. MATERIAL DEL REACTOR

Acero Inoxidable: [20] Los aceros inoxidables son aleaciones a base de hierro, con
bajo contenido de carbono y un mínimo de 11% de cromo. La mayoría de los grados
comerciales contiene al menos 11% de cromo y hasta 0.8% de carbono. Algunos
grados contienen níquel como segundo elemento de aleación. Cuando el contenido
total de la aleación excede aproximadamente el 50%, la designación “resistente al
calor” es más aplicable que inoxidable.

Su principal característica es su alta resistencia a la corrosión. Esta resistencia es

debido a la formación espontánea de una capa de óxido de cromo en la superficie del
acero. Aunque es extremadamente fina, esta película invisible está firmemente adherida
al metal y es extremadamente protectora en una amplia gama de medios corrosivos.
4.2. VENTAJAS DEL ACERO INOXIDABLE

Resistencia a la corrosión: Todos los aceros inoxidables tienen una alta resistencia a
la corrosión. Los grados de baja aleación, resisten la corrosión en condiciones
atmosféricas; los grados altamente aleados pueden resistir la corrosión en la mayoría
de los medios ácidos, incluso a elevadas temperaturas .

Resistencia a la alta y baja temperatura: Algunos grados resisten grandes

variaciones térmicas y mantendrán alta resistencia a temperaturas muy altas, otros
demuestran dureza excepcional a temperaturas criogénicas.
Facilidad para la fabricación: La mayoría de aceros inoxidables pueden ser cortados,
soldados, forjados y mecanizados con resultados satisfactorios.

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Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

Resistencia Mecánica: La característica de endurecimiento por trabajo en frío de

muchos aceros inoxidables, se usa en el diseño para reducir espesores y así, los
costos. Otros aceros inoxidables pueden ser tratados térmicamente para hacer
componentes de alta resistencia.
Estética: El acero inoxidable está disponible en muchas terminaciones superficiales. Se
mantiene fácilmente dando por resultado una alta calidad.
Propiedades Higiénicas: La facilidad de limpieza del acero inoxidable lo hace la
primera opción en hospitales, cocinas, e instalaciones alimenticias y farmacéuticas.
Ciclo de Trabajo: El acero inoxidable es un material durable, y es la opción mas barata
considerando el ciclo vital. [20]
Para la elaboración del reactor existen variedad de catálogos los cuales podemos
encontrar en internet, solo para nombrar algunos reactores aptos para la producción de
insulina encontramos, [2](1000L Bacillus fermentador, insulina biorreactor, 316 de acero
inoxidable tanque de fermentación, US$ 26.151,60 - US$ 49.210,00 ), (Leachables de
biorreactor de insulina biorreactor diseño vijay singh onda biorreactor de usuario, US$
50.073,00 )[21]

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Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

5. DISEÑO DEL FERMENTADOR

REACTOR BATCH
Para el diseño del reactor por lote (Batch) se considera la utilización del
microorganismo Escherichia Coli W3110 trp-PNF21B y las condiciones de cultivo e
inoculo, con otras consideraciones, se adopta según los resultados reportados por
Gosset, et al.[22]
INOCULO
Tabla 1. Compuestos que componen el inoculo.
3 g/L K2HPO4 0.5 g/L (NH4)2HPO4
3 g/L NaH2PO4 3 g/L Glucosa*
3 g/L MgSO4 . 7 5 g/L Extracto de
H2O levadura*
Tabla 2. Compuestos que componen el inoculo.

En efecto, para la alimentación del fermentador se considera tomar un 10% del inoculo,
sin contener en ello Glucosa ni (NH 4)2HPO4, los cuales son alimentados continuamente
con una solución estéril de Glucosa y (NH4)2HPO4 con concentraciones de 330 g/L y 85
g/L, respectivamente.

5.1. BALANCE

d Cx
=r x =μ C x (1)
dt
Cx Cx t
d Cx Cx
∫ = dt=t−t 0 (2)
dt ∫ μ Cx ∫
=
Cx 0 C x0t 0

C s μ max
μ= (3)
k s+ C s

Cx t
k s +C s
∫ d C x =∫ dt (4)
Cx 0
μ max C x C s t
0

∆ C x C x −C x 0
Y x/ s= = (5)
−∆ C s C s 0−C s

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k Y C k Y C
( s x /s x
) s x /s
(
( t−t 0 ) μ max = C + C Y +1 ln C 0 + C +C Y ln C
x0 s 0 x/ s x x0 s 0 x/ s
s0

s
) (6)

CX 20 g/ L
1.21 g / L
0.3 g/ g
0.018 g/ g
330 g/ L
Tiempo de la fase de crecimiento* 8h
Tiempo total de la fase de inducción* 16 h
Vo 14 L
F 0.6 L/h
μmáx 0.935 h-1
Km 0.71 g/L
Flujo de aire 1 vvm
Tabla 2. Datos de producción a considerar.*durante la escala laboratorio.

A partir de los anteriores datos se pueden determinar algunos parámetros importantes,

como la concentración inicial de biomasa, y la concentración final de sustrato. El
rendimiento de producto viene dado por la siguiente ecuación:
C P−C P 0
y PS= (7)
C S 0−C S

Viendo que la concentración inicial de producto es cero, y luego despejando C S,

tenemos que:
C S ≅ 262.78 g/ L

Ahora determinamos la concentración inicial de biomasa con la ecuación del

rendimiento de biomasa:
C X −C X 0
y XS= (8)
C S 0−C S

C X 0 ≅ 4.83 g/ L

Conociendo este último parámetro podemos determinar el tiempo de fermentación del

medio a través de la ecuación 6.
t f =1.76 h

BALANCE DE MATERIA

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Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

C 6 H 12 O6 + aO2 +b NH 3 → cC H 1.77 O0.49 N 0.24 +d H 2 O+e CO 2 +fC 257 H 383 N 65 O77 S 6

6 γ S −4 a=c γ B + 337 f γ P

PM S=180 γ S =4

PM B=24.97 γ B =4.07

PM p =5808 γ P =¿ 4.085

(PM )B 24.97
Y XS =c =0.3=c × → c=2.16
(PM )S 180

( PM ) P 5808
Y PS =f =0.018=f × → f =0.000558
(PM )S 180

6 γ S−c γ B −337 f γ P 6 ( 4 ) −2.16 ( 4.07 ) −337 ( 0.000558 )( 4.085 )

a= = =3.61
4 4

Con esto determinamos la cantidad mínima de oxígeno para que la bacteria pueda
respirar.
5.2. DIMENSIONAMIENTO DEL TANQUE Y SISTEMA DE AGITACIÓN.

En un estudio [23], se determinó el escalonamiento del proceso de escalamiento para

nuestro microorganismo de interés, iniciando con pruebas en laboratorio para
determinar los parámetros más relevantes a tener en cuenta, y a partir de ello realizaron
los cálculos para plantas pilotos y grandes industrias. Entre sus resultados también se
encontraron datos relevantes para el proceso de agitado del tanque debido a la similitud
de ambos estudios en escala laboratorio se eligió un volumen de 1200 L, cuya
velocidad de agitado para un diámetro del impulsor de 0.46 m, resulta ser de 4.71 rps;
con 4 deflectores.
Conociendo el volumen podemos determinar el resto de parámetro del tanque, a través
de relación ya establecidas en la literatura.
π
V= D H (9)
4 T T

Para determinar el diámetro del tanque y su altura se usa como heurística de diseño
una relación de altura-diámetro 2:1; reemplazando esta relación y despejando el
diámetro del tanque se tiene que:

20
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

2V
DT =
√
3

π
=0.92 m

Por tanto la altura del tanque será de 1.84 m

Según el artículo el medio de cultivo o caldo, tendrá en su gran mayoría agua, por lo
que asumiremos que el caldo posee las mismas propiedades químicas que el agua
pura. Se sabe que la viscosidad del agua es baja, un muy buen mecanismo de
agitación para sistemas líquidos con baja resistencia al esfuerzo cortante son los
agitadores de paleta plana también conocidos como turbina de disco Rushton, el cual
son el sistema de agitación más común en las industrias fermentadoras. Se sabe que
este tipo de turbina tiene un numero de potencia (N’ p) equivalente a 5,9 para el régimen
turbulento, y de 70 para el régimen laminar.
Ahora se puede determinar los parámetros de la turbina con las siguientes relaciones
establecidas.

WB
=1 /4 (10)
Di

LB
=1/5 (11)
Di

W BF
=0.1 (12)
DT

Ha
=1 (13)
Di

H a=H b (14)

HL
=1 (15)
DT

Los resultados se muestran en la siguiente tabla: .

Ancho de la cuchilla (WB) 9.2 cm

Largo de la cuchilla (LB) 11.5 cm
Ancho del deflector (WBF) 9.2 cm
Separación fondo-cuchilla (Ha) 0.46 m
Separación entre cuchillas (Hb) 0.46 m
Altura del líquido (HL) 0.92 m
Tabla 3. Parámetros del sistema de agitación

21
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

Ahora se procede a determinar el redimen de agitado del sistema por medio del número
de Reynolds, teniendo en cuenta que la densidad del sistema es de 1000 kg/m 3, y la
viscosidad de 1.8x10-5 PA.s .

N i D i∗ρ
N ℜ, c = =66442.4 (16)
μ

Para ese número de Reynolds el sistema de agitado se encuentra en régimen

turbulento, por tanto la potencia requerida por el sistema es:

P=N ' p∗ρ∗N i3∗D i5 ≅ 72W (17)

Y por último determinamos el tiempo necesario de agitado para que el sistema alcance
la homogeneidad, también conocido como tiempo de mezclado.
2 1 1
ρVL DT
t m=5.1 DT 3
( )( )
P
3
DI
3
(18)

Donde VL es el volumen de líquido contenido en el tanque, el cual se calcula con la así:

π
V L= DT 3 (19)
4

Por tanto el volumen del líquido y el tiempo de mezclado son 611,58 L, y 12.40 s.
El estándar de las cuchillas Rushton es de 4 cuchillas por lo que se dispondrá de ellas,
además se tendrán 3 discos para así garantizar una completa homogeneidad del
sistema.
Y por último, el material más común de construcción de tanques fermentadores es
Acero inoxidable 304, espesor 3/16 in, siendo este el que se usara; y para el sistema de
control de control se contará con un tablero de control para temperatura y regulador de
velocidad. Para el primer parámetro se montará un sistema de resistencia de inmersión
con termostato, voltímetro y autotransformador a fin de regular el voltaje y conseguir la
temperatura deseada, y para regular la velocidad del motor se instalará un motor
reductor con variación de frecuencia [24]

5.3. DISEÑO DEL SISTEMA DE ESTERILIZACIÓN

En su estudio, Seeger et al[25], determinaron un sistema de esterilización para el

reactor batch en la producción de insulina a partir de la E-coli, en el cual el medio era
calentado hasta una temperatura de 121 °C. Sabiendo que se presume que el medio

22
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

tiene las propiedades químicas muy similares al del agua pura se procede a calcular el
tiempo necesario para esterilizar el sistema, y se utilizaron datos provenientes de un
ejemplo del libro FUNDAMENTALS OF BIOCHEMICAL ENGINEERING de Rajiv Dutta.
[26]
Planteamos una probabilidad de que sobrevivan microorganismos contaminantes de 1
en 10000 y la utilización de una bobina para el calentamiento.

V =1.2 m3 kJ
R=8.314
kmol . K

n=0.0001

T =121 ° C

P=500 kPa

Primeramente calculas el aspecto de diseño total:

23
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

∇=ln ( nn )=ln ( N n∗v ) ≅ 40.9640

0 0
(20)

De las tablas de vapor del Felder y Rousseau se tiene que vapor de agua saturado a
500 kPa cuenta con una entalpia de vaporización ( H g ) equivalente a 2747.5 kJ/kg, y una
temperatura de saturación (TH) de 151.8 °C. Además, de las tablas de propiedades
químicas la densidad del agua ( ρ w ) a 25 °C es 1000 kg/m3.

Ahora, para un calentamiento del medio a través de una bobina se tiene la siguiente
ecuación:
− A∗U H∗t H

T =T H + ( T 0−T H )∗e C p∗M (21)

Pero se sabe que:

M =ρ m∗V (22)

Por Tanto:
− A∗U H∗t H

T =T H + ( T 0−T H )∗e C p∗ρ m∗V (23)

Despejando t H :

−C p∗ρ m∗V ( T −T H )
t H= ∗ln (24)
A∗U H ( T 0−T H )

Entonces el tiempo necesario para calentar el medio desde una temperatura de 25 °C

hasta 121 °C es de 0.27 h aproximado.

Luego:
− A∗U H ∗t −1
tH tH − Ed −1 tH − Ed
∗T (
∗ T H + (T 0 −T H )∗e
C ∗ρ ∗V
p m
)
∇ H =∫ k d dt=k d 0 ∫ e R
dt =k d 0∫ e R
dt (25)
0 0 0

Reemplazando los valores numéricos y utilizando la herramienta online de wólfram para

resolver la integral definida, ∇ H =4.0125

Ahora, para el proceso de enfriamiento se tiene que:

24
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

A∗UC

T C =T 0C + ( T 0−T 0C )∗e
( −mc ∗t C
M
(
∗ 1−e m ∗C c p
)) (26)

Se sabe que T 0=T puesto que es la temperatura que tiene el sistema luego del proceso
de calentamiento, y también m c =ρ w∗ν .
A∗U C
− ρ w∗ν∗t C
C C
T =T 0 + ( T −T
C
)∗e
( ρ m∗V
(
∗ 1−e
ρ ∗ν∗C
w p
)) (27)
0

Sustituimos las variables conocidas:

315=298+96∗e (
−6.18∗t C )

Despejamos y se obtiene que t C =0.28 h, que es el tiempo necesario para que el sistema
se enfrié de 121 °C hasta 42 °C. Ahora se calcula el aspecto de diseño del proceso de
enfriamiento:
tC tC −Ed −1 tC −E d ( ) −1
∗T ∗(298+ 90∗e −1.40∗t )
∇ C =∫ k d dt=k d 0∫ e R
dt =k d 0∫ e R
dt (28)
0 0 0

Nuevamente haciendo uso de wólfram se obtuvo que: ∇ C =1.2511

∇ T =∇ H +∇ C +∇ hold (29)

Luego:

∇ hold =∇ T −∇ C −∇ H =35.7004

Ahora se calcula la constante de muere térmica a la temperatura final del proceso de

calentamiento (121 °C):
−E d −1
∗T
k d=k d 0∗e R
=152.299 h−1 (30)

Por último, se calcula el tiempo de retención de la siguiente forma:

∇hold
t hold = =0.23 h (31)
kd

El tiempo por tanto de esterilización es de:

t est=t H + t C +t hold =0.78 h (32)

25
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

5.4. TIEMPO DE VACIADO DEL TANQUE

Por último, determinaremos el tiempo de vaciado del reactor, para ello se tienen en
cuenta las dimensiones anteriormente determinadas, propiedades del medio, al igual de
que se utilizara una tubería, 0.15 m de diámetro, de acero inoxidable (material no
reaccionante, resistente y no contaminante), para la corriente de vaciado del reactor. De
la literatura:

P0∗(H T −H L )

√
−ρm∗g∗h−Patm
−dh H T −h
u= = (33)
dt DT
0.5∗ρm∗( −1)
Do
Dónde: P0 es la presión inicial del sistema, la cual es de 13 kPa [27]; g es la gravedad, h
es la altura del medio a medida que avanza el tiempo, D o es el diámetro de la tubería,
Patm es la presión atmosférica en el orificio la cual es cero debido a que la tubería no
está abierta al exterior.
Despejando y añadiendo límites de integración tenemos que:

t h/HT
D dh
0 √
∫ dt= 0.5∗ρm∗( DT −1) ∫ P ∗( H −H )
o H /H 0 T
H T −h
L
L
− ρm∗g∗h−Patm
T
(34)

Se diseñó un programa en el software de Matlab para determinar el tiempo en que se

vacía el reactor:

26
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

clear, clc
S1=pi*0.92^2; %sección del depósito
S2=pi*0.15^2; %sección del orificio
H=1.84; %altura del depósito
h0=0.92; %altura inicial de agua en el depósito
pAtm=0; %presión atmosférica
p0=13000; %presión inicial del aire en el depósito
rho=1000; %densidad del agua kg/m3
hFin=0;
%equilibrio
if p0*h0>H*(p0-pAtm)
hFin=((rho*9.8*H+pAtm)-sqrt((rho*9.8*H+pAtm)^2-4*rho*9.8*(p0*h0-
H*(p0-pAtm))))/(2*rho*9.8);
end

c=-sqrt((S1^2/S2^2-1)*H*rho/(2*p0*(H-h0)))*H;
a=rho*9.8*H^2/(p0*(H-h0));
b=pAtm*H/(p0*(H-h0));

f=@(x) 1./sqrt(1./(1-x)+a*x-b);
t=zeros(50,1);
h=hFin:(h0-hFin)/50:h0;
i=1;
for i=1:length(h)
t(i)=c*integral(f,h0/H,h(i)/H);
end
plot(t,h)
grid on
xlabel('t(s)');
ylabel('x(m)');
title('Vaciado de un depósito')

Los resultados se muestran a continuación:

27
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

Figura 5. Variación de la altura del medio en el fermentador a través del tiempo.

Observamos que el fermentador se vacía en un tiempo muy corto equivalente a 7

segundos.

Por tanto, el tiempo necesario para un ciclo de producción de insulina a partir de E-coli
es:

t T =t ¿ + t f + 2t est +t v (35)

Donde tll es el tiempo de llenado del reactor el cual puede ser despreciado, y en este
caso el tiempo de vaciado también puede ser despreciado resultando que el tiempo del
ciclo es:

t T =3.31 h

28
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

6. SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN

En el desarrollo de los procesos biotecnológicos han requerido el desarrollo de

procesos de purificación. Las productos obtenidos por esta vía deben cumplir no solo
rigurosos requerimientos de calidad y seguridad establecidos por las agencias
regulatorias, sino también su camino hacia el mercado debe ser corto. La estrategia
fundamental de la purificación de productos es simple: remover todos los contaminantes
mientras se trata de retener en el mayor grado posible el producto de interés; para
estos procesos se llevan a cabo las siguientes etapas. [28]

Para obtener la liberación selectiva de producto(insulina) en la bacteria E.coli W3110

que es Gram negativa, existe una región de espacio entre la membrana citoplasmática
y la pared celular externa que se denomina periplasma Los productos ubicados en el
periplasma pueden liberarse selectivamente al interrumpir la integridad de la pared
celular externa mientras se mantiene intacto el citoplasma.[29]
Por lo que este producto intracelular puede liberarse rompiendo las células y luego
pueden recuperarse y purificarse.
Por tal motivo requerimos de métodos de separación y purificación que a continuación
mostraremos las etapas en la figura 6.

Molino de
Centrifugación perlas Centrifugación

Espectrometría de
masas Cromatografías

Figura 6. Etapas de separación y purificación.

ETAPAS PRIMARIAS DE RECUPERACIÓN

5.5. ETAPA 1: CENTRIFUGACIÓN (ANTES DEL ROMPIMIENTO CELULAR).

La centrifugación es una de las principales operaciones utilizada para la separación de
células de caldos biológicos, especialmente cuando los caldos no son fácilmente
filtrables, o la adición de ayudas-filtro no es recomendable por razones de costos o de
producción excesiva de desechos contaminantes.

29
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

La centrifugación también es empleada en la remoción de desechos celulares de caldos

de células que han sido sujetas a rompimiento, en la separación de precipitados
proteicos y para la recuperación de productos insolubles como los cuerpos de inclusión.
[30]
Las células se concentran por centrifugación a 3750 g (Avanti JLA-16.250, EE. UU.)
Durante 15 minutos a 4°C.[31]
Se debe tener en cuenta las siguientes recomendaciones:
a) El diámetro aparente de las bacterias es del orden de diez veces menor que el
de las levaduras, por lo que su velocidad de sedimentación es cien veces menor,
ya que esta es proporcional al cuadrado de la partícula
b) Las células contienen más del 70% de agua por lo que su densidad es muy
semejante a la de los caldos, por lo tanto el parámetro Δρ puede ser muy bajo
c) Algunos caldos biológicos son muy viscosos propiedad que dificulta la
sedimentación
d) La velocidad de sedimentación puede ser incrementada en un equipo centrifugo
aumentando la velocidad de rotación o la distancia de sedimentación (diámetro
de la centrifuga).[5]

Factor de Escalamiento (Factor G)

En la caracterización y escalamiento de centrifugas frecuentemente se emplea el factor
G, que es una medida relativa de la velocidad de sedimentación de una partícula en un
campo centrifugo con respecto a su velocidad de sedimentación en el campo
gravitacional.
vw w 2 r
G= =
vg g

G puede ser referida a un radio característico el cual generalmente es el radio exterior

del campo centrífugo. Esto permite desarrollar expresiones prácticas para estimar la G
de la siguiente forma:

G=5,6∗10−7 N 2 D
Donde N está en rpm, el diámetro del tazón de la centrifuga (o punto de interés) D en
mm y G es adimensional. [32]

30
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

5.6. ETAPA 2: ROMPIMIENTO CELULAR (MOLINO DE PERLAS):

La molienda con perlas es uno de los métodos de rompimientos mecánicos preferibles
a gran escala debido a su facilidad de operación, controlabilidad y habilidad para
procesar cargas concentradas de suspensión celular.[33]
El principio es aplastar las células entre las perlas de vidrio y el acero, deja un fuerte
estrés sobre el producto y su costo por lo general es barato.
La suspensión de biomasa se alimentó en la cámara de vidrio de 600 ml del Dynomill
Type MultiLab (CH-4005, WA Bachofen, Suiza) cargada con perlas de Zirconia de 0,3
mm [cargas de perlas del 75% (v/v)]. La disrupción celular se lleva a cabo bajo
velocidad de punta del impulsor 10 m/s durante 17 min. La cámara de interrupción se
enfría mediante una camisa exterior que circulaba con agua enfriada con hielo. [34]
El balance de masa de proteína liberada puede ser expresado mediante la ecuación
[30]:
dR
V M= =k ( Rm−R)V M
dt
Integrando y re-arreglando
Rm
ln =kt
Rm−R

La ecuación anterior establece que la velocidad de liberación de la masa de proteína

(células rotas) es proporcional a la masa de proteína presente no liberada donde:
VM: Volumen libre del molino. [L3].
Rm: Concentración máxima de proteína obtenible. [M/L 3].
R: Concentración de proteína liberada en el tiempo t. [M/L 3].
t: Tiempo de operación. En el caso de la molienda por lotes el tiempo de operación t es
igual al tiempo de residencia de las células en el molino. [t].
k: Constante de velocidad específica de primer orden que depende del tipo de célula,
del tipo y velocidad del agitador, de la carga y tamaño de las perlas, de la concentración
celular y de la temperatura. [t−1].

5.7. ETAPA 3: CENTRIFUGACIÓN (DESPUÉS DEL ROMPIMIENTO CELULAR)

Después del rompimiento celular se realiza una centrifugación diferencial, la cual Se
basa en la diferencia en la densidad de las moléculas. Esta diferencia debe ser grande

31
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

para que sea observada al centrifugar. Las partículas que posean densidades similares
sedimentarán juntas.[32]
Con la centrifugación diferencial se obtienen dos fracciones: sedimento y
sobrenadante. El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su
forma, tamaño y densidad.
Se recogen muestras a intervalos regulares y se clarificaron por centrifugación a 16,249
g (Centrifugadora de suelo refrigerada MSE Mistral 6000) durante 1 minuto para
eliminar los restos celulares. [34]

5.8. ETAPA 4: CROMATOGRAFÍAS

Cromatografía Q Sepharose[31]
La muestra de proteína se aplicó a una columna llena con Q Sepharose y se equilibró
con Tris 0,5 M pH 8,6, seguido de Tris 20 mM pH 8,6. Después de la aplicación, la
columna se enjuaga con tampones: QW - Tris 20 mM pH 8,6 + isopropanol al 20%
(conductividad 0,5 mS). Las proteínas se eluyeron con tampón QE1 - Tris 20 mM pH
8,6 + isopropanol al 30% (conductividad 0,42 mS) y tampón QE2 - Tris 20 mM pH 8,6 +
isopropanol al 30% (conductividad 3 mS).
Cromatografía RP-HPLC[31]
La separación se lleva a cabo en una columna ACE 5C18-300 usando un gradiente de
acetonitrilo. Fase móvil A: 2000 ml de solución de sulfato de sodio 0.2 M pH 2.3
precalentado en agua tibia a 25 ° C - 30 ° C con 440 ml de acetonitrilo, pH 2.3. Fase
móvil B: 1250 ml de solución de sulfato de sodio 0.2 M pH 2.3 precalentado en agua
tibia a 25 ° C - 30 ° C con 1250 ml de acetonitrilo, pH 2.3. La fracción principal eluída de
la columna se diluyó 3 veces con H 2O y luego la insulina se precipitó con cloruro de
zinc.
Cromatografía Sephadex G-25[31]
El precipitado de insulina se suspende en agua y el pH se ajusta a 3,0. Para
intercambiar el tampón de muestra, la muestra de proteína se aplica en una columna
empaquetada con Sephadex G-25 equilibrada con acetato de amonio 5 mM, pH 4.0. La
insulina se eluyó con el mismo tampón.
Cromatografía UHPLC [31]
La separación de la muestra se realizó usando el sistema Waters Acquity UHPLC con el
software Empower 3, equipado con una columna ACQUITY UPLC® CSH ™ C18 de 1.7
μm, 2.1 × 50 mm. Los análisis se llevaron a cabo a 23 ° C a una velocidad de flujo de
0.713 ml / min y detección espectrofotométrica a 220 nm. El volumen de inyección fue
de 2 μl. Se empleó un gradiente de dos tampones A1 y B1. El eluyente A1 fue 9,66 g de

32
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

NaH2PO4 x H2O y 24,58 g de NaClO4 x H2O en 1000 ml de agua, pH 2,5. El eluyente B1

fue 9,66 g de NaH2PO4 x H2O en 1000 ml de agua, pH 2,5, mezclado con acetonitrilo
1:1 (v/v).

5.9. ETAPA 5: ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF / TOF [31]

Los espectros de masas se adquirieran usando un analizador 4800 MALDI TOF / TOF
(Applied Biosystems). El instrumento debe ser operado en modo de reflector de iones
positivos. Se usa 0,5 μl de muestra en una placa 384 Opti-TOF MALDI y se mezclan
con 0,5 μl de una solución saturada de matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico
(CHCA) de Sigma-Aldrich, disuelta en 50:50 agua/acetonitrilo con 0.1% TFA -
concentración final (SigmaAldrich). La calibración se logra con una mezcla de
calibración del analizador de proteómica 4700 proporcionada por Applied Biosystems.
Al final de todo el proceso, se obtiene en promedio 40.000 UI de insulina humana
recombinante de hasta 99% de pureza.

33
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

6. RIESGOS EN EL PROCESO

Los procesos de producción de proteína recombinante como la Insulina, pueden

generar fallas ya sea en la primera etapa de la obtención de la proteína recombinante,
la cual es la fermentación; dado que el microorganismo empleado realiza la
biotransformación de los sustratos suministrados en el medio de cultivo en productos,
entre los cuales se encuentra la proteína heteróloga. Resulta de gran importancia
obtener altos niveles de crecimiento celular, así como alta concentración de la proteína
recombinante dentro de la célula, dado que del comportamiento de estos dos
parámetros depende el recobrado total del proceso. Por esto se hace necesario realizar
un análisis de riesgo a los procesos de fermentación que utilizan la bacteria E.coli como
hospedero, para obtener una biomasa que cumpla con los parámetros de calidad para
la pureza, concentración celular y la expresión de la proteína recombinante con fines
terapéuticos, vacunales o diagnósticos.
García, et al [35] Realizó un análisis de riesgo empleando la metodología AMEF, para
determinar qué factores del proceso fermentativo ponen en riesgo la obtención de la Pr
en E. coli con la calidad requerida, para disminuir el rechazo de lotes. A partir de este
análisis se determinó que son tres las causas potenciales que tienen mayor influencia
en las fallas de un proceso fermentativo de E. coli recombinante:
1. La inadecuada manipulación durante la inoculación.
2. La presencia de fagos.
3. El personal no calificado.
La importancia de la inadecuada manipulación en la calidad del producto viene dada
por la posibilidad de contaminación del cultivo, ya que esta es una operación crítica en
la que los operarios realizan operaciones manuales de trasvasar las soluciones
estériles, utilizando sifones con mangueras que se conectan al fermentador en un área
Clase D.
La presencia de fagos trae como consecuencia la lisis del cultivo, lo que inhibe el
crecimiento del microorganismo e implica que no se alcancen las concentraciones
celulares establecidas en el proceso. Esto atenta contra la productividad del proceso, al
no obtenerse la cantidad de biomasa por volumen de cultivo, pudiendo llegar a la lisis
total de las células con el consiguiente rechazo del lote de producción. Este parámetro
está estrechamente relacionado con la cepa de E. coli empleada. Las fuentes
potenciales de fagos son aquellos componentes que no admiten la esterilización por
calor, como los antibióticos y los bancos de células.
El personal desempeña un papel clave en las operaciones de la industria
biotecnológica, la cual se caracteriza por la existencia de procesos complejos en los
que debe trabajarse en ambientes controlados. La permanencia del personal en las

34
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

áreas clasificadas requiere del respeto de normas de comportamiento estrictas, del uso
adecuado del vestuario, del cumplimiento de los procedimientos establecidos para la
manipulación en cada paso, para lo que se requiere de una alta conciencia y
capacitación del operador.

ACCIONES ULTERIORES PARA MINIMIZAR EL RIESGO

Una vez identificaron las causas potenciales que influyen directamente en la calidad del
producto, proceden a proponer acciones para minimizar el riesgo:
 Realizar una evaluación del tiempo de vigencia de los elementos empleados en
las conexiones como mangueras y conectores.
 Simular el proceso de fermentación sin la adición del microorganismo, para
comprobar la posibilidad del mantenimiento de las condiciones de esterilidad de
la tecnología establecida.
 Desarrollar técnicas compendiales validadas para la detección de fagos en los
bancos celulares y las soluciones de antibióticos utilizadas como marcadores de
selección.
 Calificar inicialmente a los operarios cuando un nuevo proceso se realice en el
área de trabajo.
 Realizar una evaluación del desempeño cuando se detecte una no conformidad
asociada a un operario específico y en función del resultado proceder a su
recalificación.

35
Diseño de un biorreactor para la producción de Insulina humana a partir de E coli W3110

7. REFERENCIAS

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the Treatment of Diabetes: Insulin Analogs. Endocrine Reviews, 22(5), 706–717.
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Microbiology and Biotechnology, 67(2), 151–159.
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[7] INSTITUTO NACIONAL DE SALUD. (2015). DOCUMENTOS DE EVALUACIÓN DE
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perspectiva del Observatorio de Diabetes de Colombia, Bogota: Observatorio de
Diabetes de Colombia, 2013.
[10] M. Díaz, «Diabetes: las cifras van en aumento,» El Espectador, 18 Noviembre
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8. ANEXOS

8.1. PLANO DEL REACTOR

Figura 7. Plano del fermentador

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