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Aislamiento y purificación de enzimas
Introducción
Las enzimas se encuentran distribuidas ampliamente en los sistemas vivientes y son el principal factor en
el crecimiento, mantenimiento y propagación de los sistemas vivientes. De hecho, cualquier alteración en
estas “pequeñas visagras” puede conducir a condición patológica y aún a la muerte. Los primeros tiempos
del desarrollo de la enzimología estuvieron llenos de controversias acerca de las enzimas, relacionadas a
su estructura, naturaleza química, aparecimiento y funciones. La controversia Pasteur-Liebig ya fue
mencionada antes.
Una vez comprendido que las enzimas tienen la capacidad de trabajar en sistemas libres de células, se hicieron
serios intentos acerca de su aislamiento y purificación.
Entre 1920 y 1928 Willstatter y sus colegas llevaron a cabo los primeros intentos de purificación de enzimas.
Dixon y Kodama intentaron la purificación de xantina oxidasa.
La primera enzima en ser cristalizada fue la ureasa en 1920 por Sumner. A esto siguió la purificación y
cristalización de proteasas como la tripsina y la pepsina por Northrop.
Antes de que las enzimas sean aisladas y purificadas son importantes ciertas consideraciones generales.
Traducido por: Cecilia Carpio
Las enzimas extracelulares son más fáciles de aislar que las enzimas intracelulares
Independientemente de la fuente, por ejemplo tejidos de plantas o de animales, las enzimas extracelulares
se colectan fácilmente. Su colección usualmente no requiere la destrucción de tejidos y por tanto reduce
los gastos y tiempo requerido para procesos tales como homogenización o cualquier otro proceso.
Muchas enzimas están presentes en varias fuentes pero solo algunas las contienen en cantidades
comparativamente grandes
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La mayoría de enzimas son comunes a muchos organismos y son requerimientos básicos para el
metabolismo general. Sin embargo, diferentes tejidos contienen diferentes cantidades de la misma enzima
y se debe hacer una comparación para evaluar los contenidos cuantitativos de la enzima a partir de lo cual
se puede identificar una fuente ideal.
Estudios preliminares cualitativos y cuantitativos son importantes antes de que una fuente ideal sea
concretada. Muchas veces son necesarios una multitud de experimentos a escala piloto para determinar
una fuente ideal de la enzima de interés. En algunos casos las variaciones estacionales en los rendimientos
tienen que ser calculadas.
Los tejidos animales son una fuente más costosa para la producción comercial de un aislado de enzima. Esto es
principalmente porque muchas veces tiene que ser comprado el animal completo y faenado antes de que un
tejido u órgano específico pueda ser aislado y utilizado como fuente de la enzima. Por ejemplo, la renina
requerida para la producción de queso necesita la adquisición y faenamiento de terneros tiernos para obtener los
contenidos de su cuarto estómago el cual tenía que ser obtenido y procesado inmediatamente.
El tópico de aislamiento y purificación de enzimas será tratado bajo los siguientes puntos:
1. Identificación de la fuente de enzimas.
2. Procedimientos generales de manejo para la fuente y los extractos crudos.
3. Métodos para aislamiento.
4. Métodos para purificación.
5. Desarrollo de ensayos cualitativos y cuantitativos.
6. Estabilización y cristalización.
7. Criterios de pureza.
8. Métodos para la preservación de las enzimas aisladas.
general, una enzima se puede encontrar en cantidades suficientes donde pueda existir su sustrato en cantidades
abundantes. Las amilasas, por ejemplo, se encuentran en semillas de cereales en germinación, mientras que las
proteasas serán abundantes en legumbres germinantes.
Hace unas pocas décadas se ha vuelto una práctica común usar microorganismos para aislar enzimas. Ellos
tienen las ventajas de:
Crecer en medios baratos reduciendo el costo de producción.
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Crecimiento rápido que conduce a menor tiempo en el aislamiento.
Procesos económicos de recuperación en el caso de las enzimas extracelulares.
Algunos de los microorganismos comúnmente usados y las enzimas obtenidas a partir de ellos se dan en la
Tabla 2.2
En general los criterios para escoger una fuente particular para la producción comercial de la enzima de interés
giran alrededor de los siguientes factores:
Las células microbianas y los materiales vegetales son comparativamente baratos a pesar de que algunas
células microbianas pueden requerir medio especialmente formulado para el crecimiento. Pero son fuentes
ideales para enzimas extracelulares como las amilasas, celulasas o proteasas. Los materiales vegetales, salvo
quesean difíciles de cultivar, forman la fuente principal. Las semillas en germinación son muchas veces usadas
para producir amilasas y proteasas. Los tejidos animales son comparativamente más costosos; sin embargo, los
residuos de los camales pueden usarse efectivamente como fuente para enzimas del suero.
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Deben estar rápidamente disponibles
Una fuente localmente disponible se encuentra fácilmente cuando se requiere comparada con una que deba ser
transportada de algún lugar a otro. El transporte incrementa el costo, y disminuye el tiempo disponible si una
fuente particular es rápidamente perecible por tanto aumentarálas pérdidas en caso de demoras de
transportación y procesamiento.
i. Tejido vegetal
En general los tejidos vegetales usados para aislar enzimas son las hojas, sin embargo, algunas veces se
pueden usar plantas enteras tiernas, corteza o raíces. El tejido apical o germinal con frecuencia es la fuente
ideal para las enzimas de interés.
Traducido por: Cecilia Carpio
El tejido es cosechado, limpiado y con frecuencia después de la remoción de las partes no requeridas
puede ser procesado como tal o ser sometido a secado a la sombra. El tejido parcial o totalmente secado
puede entonces ser molido y almacenado por algún tiempo antes de que sea usado para el proceso real de
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aislamiento. A veces se usan los polvos secos de semillas o de otros tejidos (por ejemplo la harina de
fréjol Jack se usa para aislar ureasa) y en tales casos los polvos se producen y almacenan en botellas las
cuales se pueden mantener a temperatura ambiente por un largo período.
En caso de que la enzima sea de localización intracelular, se someten las células aisladas de los
microorganismos a homogenización o cualquier otro método físico o químico factible que rompe sus
paredes/membranas celulares para permitir la colección de su citoplasma como extracto crudo.
Se ha utilizado un número de métodos para romper y abrir las células y extraer los contenidos celulares
incluyendo los organelos subcelulares. Algunos de ellos se describen brevemente.
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A. Molienda con abrasivos
Los tejidos vegetales o los tejidos microbianos con pared celular se someten con frecuencia a molienda
con un material abrasivo como la alúmina o la arena. La tensión y el corte causa la ruptura de la pared
celular conduciendo a la recolección de las células rotas un homogenato crudo. Sistemas simples de
mortero y pistilo o mezcladores y molinos se usan para lograr los resultados deseados.
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Fig 2.7:Uso de solución hipotónica para lisis de células durante el aislamiento de enzimas
H. Vibraciones ultrasónicas
Las células son sometidas a vibraciones ultrasónicas que dan como resultado su alteración y formación de
un homogenato.
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I. Alteración del pH de la solución
Sometiendo a las células a un medioambiente de pH alterado causa la coagulación de las proteínas de la
membrana celular conduciendo a la formación de poros a través de los cuales las células rotas exudan un
homogenato.
J. Solventes orgánicos
Las membranas son bicapas de lipoproteínas y solventes orgánicos apropiados tales como la acetona,
cloroformo, éter, etc. se emplean con frecuencia para disolver los constituyentes lipídicos conduciendo a
la formación de poros. El citoplasma de la célula entonces fluye hacia afuera como homogenato.
Una vez obtenido el homogenato crudo, el propósito del proceso de purificación debe ser aislar la enzima
de interés con el máximo rendimiento posible basado en el factor de purificación. Adicionalmente la
preparación debe poseer la máxima capacidad catalítica. En otras palabras, debe estar libre de
contaminación con otras proteínas activas e inactivas. Al inicio de la purificación de enzimas, la
formación de cristales se consideró que era la prueba de pureza pero recientes avances han hecho posible
determinar impurezas en preparaciones cristalinas. Por tanto es necesario determinar la pureza mediante el
uso de otros métodos y criterios que pueden mayormente no incluir la medición de la actividad catalítica.
La estrategia general para el uso de métodos de purificación y su secuencia es dependiente de la fuente de
la enzima, instrumentación disponible, la duración de los procedimientos y la economía de los procesos.
Traducido por: Cecilia Carpio
En otras palabras, diferentes investigadores pueden escoger diferentes métodos a su conveniencia para
conseguir la purificación de la enzima deseada. Algunos de los métodos que se usan rutinariamente para
purificación de enzimas se resumen en la Tabla 2.3.
El término gran escala se usa para indicar que se puede manejar una cantidad de proteína mayor que
alrededor de 100 mg en aquella etapa particular en el proceso de purificación. Los detalles de cada método
se discuten brevemente. Se debe recordar sin embargo, que la elección de los métodos y secuencia es
enteramente dependiente de las personas que los usan
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(1) Centrifugación
Las moléculas grandes tales como enzimas pueden ser sedimentadas mediante altos campos centrífugos
(hasta 300 000 g) generados mediante una ultracentrífuga. A pesar de que la velocidad a la cual cualquier
enzima particular sedimentará depende de una variedad de factores que incluyen el tamaño y la forma de
la molécula y la viscosidad de la solución, en general se encuentra que mientras más alto es el peso
molecular, mayor es la velocidad de sedimentación. Este método no es ampliamente usado en
procedimientos de purificación para separar una enzima de otra porque se puede tratar solo pequeños
volúmenes dentro de una ultracentrífuga que opera en altos campos centrífugos. Sin embargo, la
centrifugación es ampliamente usada para remover precipitados o material insoluble en el curso del
aislamiento, por ej. remover los restos celulares después de la homogenización o colectar lo que ha sido
precipitado mediante la adición de sales.
relación decreciente conforme el tubo se llena, de modo que la densidad del medio es más grande en el
fondo del tubo. La mezcla de macromoléculas a ser resuelta es colocada en capas en la parte superior del
gradiente. La centrifugación del tubo en posición horizontal en un rotor que opera a alta velocidad causa
que cada tipo de macromolécula se sedimente hacia abajo del gradiente de densidad a su propia velocidad,
determinada por el peso de la partícula, densidad y forma, en forma de bandas o zonas. Usualmente la
centrifugación se detiene antes de alcanzar el equilibrio. La posición de las bandas de proteína puede ser
localizada ópticamente o drenando el contenido del tubo cuidadosamente a través de un agujerito en el
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fondo y analizando sucesivamente pequeñas muestras. Alternativamente el tubo plástico puede ser
congelado y luego cortado en rodajas finas para el análisis.
A una columna de perlas de gel o gránulos de vidrio poroso se le deja que llegue al equilibrio con un
solvente adecuado para las moléculas a ser separadas. Si la mezcla de moléculas de diferente tamaño se
coloca en la parte superior de tal columna equilibrada las moléculas grandes pasan a través de los espacios
intersticiales entre las perlas. Esto es porque los poros del gel tienen diámetro más pequeño que aquel
requerido para que entren las moléculas más grandes. Las moléculas más grandes por tanto se mueven
hacia abajo de la columna con poca resistencia. Las moléculas pequeñas sin embargo, pueden entrar y son
por tanto removidas efectivamente de la corriente del solvente de elución. Estas moléculas son por tanto
retardadas. El grado de retardo de una molécula es proporcional al tiempo que gasta dentro del poro del
gel que es función del tamaño de la molécula y el diámetro del poro. Las moléculas que tienen diámetro
igual o más grande que el diámetro del poro no entran en el gel y se dice que están excluidas. Las técnicas
usadas son cromatografía en columna o cromatografía de capa fina.
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b. Geles de poliacrilamida:
La polimerización de acrilamida en forma de perlas da como resultado la formación de poliacrilamida.
Los geles se usan para separar moléculas que tienen un peso molecular de hasta 300 000 Da. Sin embargo,
a tamaño de poro tan grande pierde la rigidez mecánica y se llega a comprimir en la columna. A pesar de
que se los puede usar en el rango de pH de 2-11, son inestables frente a bases debido a la hidrólisis de los
grupos amida. El agente de entrecruzamiento es la bisacrilamida y la reacción se lleva a cabo en presencia
de persulfato de amonio. Los geles son insolubles en agua y en solventes orgánicos comunes.
c. Geles de agarosa:
Se producen a partir de agar. Los geles son hidrofílicos y casi completamente libres de grupos cargados.
Tienen tamaños de poro más grandes y se pueden usar convenientemente para separar moléculas que
tienen un peso molecular de unos pocos millones de Da. Son compatibles con todos los solventes acuosos
y completamente estables dentro de un rango de pH de 4-10. Temperaturas de congelación y superiores a
30 C alteran la estructura del gel.
d. Styragel:
El styragel es un polímero entrecruzado de poliestireno usado para separaciones completamente no
acuosas. Se pueden preparar en un amplio rango de porosidades y la estructura del gel no es afectada por
temperaturas tan altas como 150 C. Se pueden usar con solventes como CCl4, tricloro benceno, cresol,
Traducido por: Cecilia Carpio
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(3) Diálisis o ultrafiltración
Una membrana de diálisis tal como el celofán se puede usar para separar proteínas globulares o moléculas
con peso molecular de alrededor de 200000 Da. Se puede cambiar el tamaño de poro mediante
tratamientos químicos y mecánicos. El método es usado de rutina para separar pequeñas moléculas
orgánicas, sales y solventes orgánicos de los extractos crudos. La capacidad de manejo de volumen es
generalmente baja. El proceso no puede ser empleado para separar una enzima de la otra. La ultrafiltración
por otro lado es una modificación del procedimiento de diálisis en la cual pequeñas moléculas e iones
pasan a través de una membrana de diálisis bajo la influencia de presión aplicada (usualmente gas N a 4
atmósferas de presión). Esto conduce a concentración de la solución de enzima, lo cual es útil para reducir
el volumen de la muestra de extracto durante el procedimiento de purificación.
compuestos no cargados que pueden ser marcados con grupos cargados o una variación de pH.
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La muestra que contiene las especies iónicas a ser separadas se deja filtrar a través del intercambiador por
un tiempo tal que sea suficiente para alcanzar el equilibrio, E-Y + X == E-X + Y, donde E es el
intercambiador y X y Y son los iones intercambiables. El intercambiador y los contraiones son de carga
opuesta. En el caso de que el ion a ser intercambiado es catión, entonces moléculas neutras y aniónicas no
se enlazarán y serán lavadas de la columna. Los iones intercambiados enlazados (X) pueden luego ser
eluidos bien sea filtrando el medio con concentraciones crecientes de Y o en otro caso con cambio de pH,
favorable para la elución de X. Este principio es también aplicable para la separación de proteínas y ácidos
nucleicos capaces de poseer ambas cargas positiva y negativa.
La naturaleza anfotérica de las macromoléculas particularmente de las proteínas, se puede explotar para
propósitos de purificación usando cromatografía de intercambio iónico. Por ejemplo a la proteína deseada
se la puede hacer que se comporte como catión bajando el pH de la mezcla de proteínas (el pH se baja
hasta un límite donde la mayoría de las otras proteínas en la mezcla se comportan como aniones). Si se
cromatografía esta mezcla sobre un intercambiador de cationes removerá muchas de las especies proteicas
aniónicas. Este proceso removerá de la muestra original muchas de las proteínas no deseadas y la mezcla
resultante es rica en la proteína deseada. Si el pH de esta mezcla resultante se incrementa ahora la proteína
deseada existirá predominantemente como anión (el pH se incrementa a un límite donde la mayoría de las
otras proteínas en la mezcla se comportan aún como cationes). Si la preparación es cromatografiada ahora
sobre un intercambiador de aniones, se perderán muchas proteínas catiónicas. Por tanto debe estar claro
que la cromatografía de intercambio aniónico y catiónico usada secuencialmente puede permitir un alto
grado de purificación. Las resinas usadas de rutina son:
(2) Electroforesis:
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moléculas tienen la misma carga, pueden no migrar juntas porque si existe diferencia en sus pesos
moleculares tendrán diferente relación carga: masa. La movilidad electroforética se afecta por los
siguientes factores:
La muestra:
La relación carga: masa de la muestra dicta la movilidad electroforética. La masa comprende el tamaño y
la forma de la molécula.
I. Carga: mientras más grande es la carga, más grande es la movilidad, la carga sin embargo
depende del pH del medio.
II. Tamaño: mientras más grande es la molécula más grandes son las fuerzas friccionales y
electrostáticas ejercidas sobre ella por el medio. Por tanto las partículas grandes se mueven más
lentamente que las pequeñas.
III. Forma: los contornos redondeados generan menos retardo friccional y electrostático comparado
con los contornos agudos.
Otros factores:
Incluyen el campo eléctrico, el medio, el tampón, etc. Las técnicas de rutina empleadas incluyen:
La electroforesis zonal también puede ser utilizada como un método a gran escala o preparativo donde se
puede purificar grandes cantidades de un componente para caracterización adicional. En base al medio de
soporte, las técnicas se clasifican como:
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Electroforesis en papel
Electroforesis en gel
Electroforesis en acetato de celulosa
Técnicas especializadas que incluyen el gel de disco, gel con gradiente, alto voltaje, electroforesis de dos
dimensiones, etc.
Esta técnica fue descubierta por H. Svensson en Suecia y tiene alto poder de resolución. Una simple
comparación ayudaría a establecer su superioridad. Mientras la electroforesis de papel resuelve las
proteínas del plasma en 6 bandas, el enfoque isoeléctrico las resuelve en al menos 40 bandas. Las
moléculas de proteína pueden tener una carga neta positiva en solución ácida porque la mayoría de grupos
amino tienen una carga neta positiva y la mayoría de grupos carboxilo están protonados y eléctricamente
sin carga. Con un incremento gradual en pH, el número de grupos carboxilo que tiene carga negativa se
incrementa, mientras el número de grupos positivamente cargados decrece. A cierto valor de pH, el punto
isoiónico, la carga neta de la molécula de proteína es cero. El número y tipo de grupos protolíticos y sus
constantes de disociación determinan así el punto isoiónico de una molécula. A pesar de que hay una
variación considerable en el punto isoiónico de la proteína, están generalmente en el rango de pH de 3-11.
En la electroforesis convencional, el pH entre ánodo y cátodo es constante y los iones positivamente
cargados migran hacia el cátodo y los iones negativos al ánodo.
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con esta técnica porque el efecto de orientación trabaja contra la difusión. Así una vez que se alcanza una
orientación final estable, la resolución se retendrá aún si el experimento continúa por largo tiempo.
El electroenfoque también necesita disposición para estabilización de las zonas de separación de proteínas
contra flujo convectivo en la solución. Están en uso tres vías que incluyen:
a. Gradiente de densidad:
Gradientes de densidad adecuados para electroenfoque se pueden hacer con muchos solutos no cargados,
los cuales se pueden disolver en agua a una concentración que incrementará suficientemente la densidad.
Los compuestos no deben reaccionar con las proteínas y deben tener un bajo contenido de metales
pesados. Deben ser de alta pureza. La sacarosa es el compuesto más preferido sin embargo se pueden usar
otros compuestos como el manitol, sorbitol, etilenglicol, dextrano y ficoll.
Traducido por: Cecilia Carpio
b. Geles:
En el electroenfoque el gel sirve solamente como un anticonvectante y no como un tamiz molecular.
Obviamente la concentración del gel debe ser baja para proporcionar poro de gran diámetro. Para
proteínas grandes con peso molecular que excede 200 kDa, concentración más baja de acrilamida se
podría usar en combinación con agarosa. La acrilamida es el gel preferido para electroenfoque. Los geles
agarosa-almidón no son preferidos ya que en estos geles el gradiente de pH se desvía considerablemente
durante experimentos prolongados.
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c. Electroenfoque de convección de zona
El aparato está construido por dos cajas rectangulares, siendo la superior la cubierta. La superficie de
arriba de la caja inferior es corrugada con crestas, separadas mediante depresiones correspondientes a las
crestas de la cubierta. Así encajan la una con la otra dejando un espacio de pocos milímetros entre ellos,
produciendo una onda estrecha como un canal similar a una serie de tubos en U amplios interconectados.
La solución portadora de anfolitos se llena en este espacio con los electrodos situados a los dos extremos.
Un líquido refrigerante se deja que pase a través de los canales huecos construidos entre las dos cajas para
mantener una temperatura constante. Cuando se enciende la corriente, se forma un gradiente de densidad
en cada depresión de la parte del fondo mediante el soluto. Cuando las proteínas se llegan a inmovilizar a
su pH isoeléctrico, la densidad se incrementa localmente y las proteínas sedimentan en las depresiones de
la parte inferior. Las proteínas se pueden separar como fracciones sin contaminación por las fracciones
vecinas después de completar el experimento.
El peso molecular promedio de los anfolitos es de alrededor de 800 Da mientras que las proteínas tienen
un peso molecular de 10000 Da o más. Diálisis o filtración por gel puede ser usada efectivamente para su
separación. A veces otros métodos como la precipitación por sulfato de amonio; cromatografía de
intercambio iónico y de partición se puede usar.
1. Cambio en pH
Una enzima es menos soluble en su punto isoeléctrico dado que a este pH las fuerzas electrostáticas
repulsivas dentro de las moléculas de enzima dejan de existir. Bajo tal condición las moléculas de enzima
tienden a precipitar. El ajuste del pH al valor apropiado se puede por tanto usar para precipitar la enzima.
Es importante señalar que la enzima de interés es completamente inactiva debido a este procedimiento.
Este procedimiento aisla adenosintrifosfatasa de corazón de res.
El método se emplea a veces para remover impurezas, como en el caso del aislamiento de la adenilato
Traducido por: Cecilia Carpio
quinasa. Cuando se aisla la enzima a partir de músculo de cerdo, los cristales son suficientemente grandes
como para ser usados en cristalografía de rayos X y son excepcionalmente estables a pH bajo.
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una disminución en las interacciones soluto-solvente y a su vez en la solubilidad de las proteínas. Muchas
sales se han empleado para fraccionamiento por sal o precipitación salina de enzimas. La sal más
ampliamente usada y preferida es el sulfato de amonio debido a las siguientes ventajas:
Es barata
Es altamente soluble en agua
No causa efectos dañinos en la enzima a ser purificada.
Es un ácido débil y el factor de purificación alcanzado es de alrededor de 10 veces. Es mejor usado en
etapas de purificación iniciales.
Las enzimas gliceraldehído fosfato deshidrogenasa y fructosa bisfosfato aldolasa han sido aisladas y
purificadas usando fraccionamiento con sulfato de amonio. La enzima gliceraldehído fosfato
deshidrogenasa de músculo de conejo es fácil de purificar debido a su abundante existencia y contiene
NAD+ fuertemente enlazado. Es soluble en altas concentraciones de sulfato de amonio (hasta una
saturación de 70%) lo cual es la base del procedimiento de purificación.
1. Cromatografía de afinidad:
La técnica explota la capacidad para el enlazamiento específico no covalente de las enzimas con otras
moléculas llamadas ligandos. La mayoría de las veces un análogo del sustrato (una molécula que se parece
al sustrato pero que no causa una reacción fructífera) específico para la enzima de interés es enlazado a
una matriz sólida e inerte (como la agarosa). Cuando se carga la mezcla en la parte superior de la columna,
solamente la enzima deseada se enlazará al análogo de sustrato inmovilizado y se retardará. Todas las
otras enzimas y proteínas pasarán hacia abajo y saldrán de la columna.
Si se alteran las condiciones, la enzima enlazada al ligando se disociará y será eluida. Las fracciones se
Traducido por: Cecilia Carpio
pueden colectar y chequear su actividad. La enzima colectada por esta técnica es bastante pura. En la
Tabla 2.3 se dan algunos sistemas estándar matriz-ligando.
Un número de problemas está asociado con el uso de esta técnica para purificación de enzimas. Estos
incluyen:
1. Acoplar un análogo de sustrato adecuado a la matriz es una tarea difícil.
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2. El enlazamiento del ligando a la matriz puede interferir con la propiedad de enlazamiento de la enzima
conduciendo a pérdida parcial o completa de la especificidad. El uso de brazos espaciadores puede ser
necesario.
3. La fuerza de enlazamiento enzima-ligando es un factor crucial. Si es muy débil entonces el retardo de
la enzima no será satisfactorio, mientras que si la interacción es muy fuerte planteará un problema de
elución.
4. Las enzimas que catalizan reacciones bisustrato crean problemas especiales. Es necesario estudiar y
poner particular atención a las técnicas de elución involucradas. En el caso de la alcohol
deshidrogenasa de hígado, se enlaza a un análogo de AMP ligado a la matriz pero su elución requiere
el uso de NAD y pirazol. El pirazol es un inhibidor competitivo de la enzima.
2. Elución de afinidad:
Es una técnica complementaria a la cromatografía de afinidad. Se usa con mezclas de enzimas
parcialmente purificadas y es más ventajosa que la cromatografía de afinidad ya que:
a. Reacciones complejas de enlazamiento del análogo de sustrato son limitadas.
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b. Las columnas son más baratas porque los intercambiadores de iones son más baratos que las matrices
de afinidad.
Se han desarrollado variaciones para contrarrestar estos problemas. Se mencionan algunas de ellas:
a. Ultrafiltración de afinidad de flujo cruzado
La técnica usa membranas microporosas con un tamaño de poro de 3-5 mm. Se fabrican de acetato de
celulosa, politetrafluoroetileno (PTFE) o polivinilideno. Membranas preparadas activadas están ahora
disponibles comercialmente.
Cuando la mezcla se incuba con la membrana, ésta retiene el complejo ligando proteína mientras el
material no deseado pasa a través de los poros de la membrana. Se puede utilizar un cambio de tampón
para liberar la proteína del complejo. Las velocidades de flujo son usualmente altas y mejoran
enormemente los pasos tales como el lavado y la elución. Es importante notar que el ligando usado debe
ser muy específico y el material de la membrana debe tener mínima adsorción no específica.
b. Precipitación de afinidad
La técnica usa polímeros que son solubles bajo condiciones particulares y precipitan cuando cambia una
condición cualquiera como pH, fuerza iónica, temperatura o por la adición de un agente tal como un ion
metálico.
antes mencionadas causando la precipitación del complejo. El precipitado se separa y se somete a cambio
en el tampón lo cual conduce a facilitar el aislamiento de la enzima deseada. La técnica es más barata ya
que elimina las costosas reacciones de enlazamiento de matrices y ligandos; más aún puede ser utilizada
en la primera etapa de purificación.
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Convencionalmente, para separar la lectina de germen de trigo uno tendría que usar una matriz insoluble a
la cual se le une covalentemente N-acetil glucosamina. Pero en lugar de tal matriz, el polímero de N-acetil
glucosamina, la quitina, un constituyente natural de los exoesqueletos de los artrópodos, puede ser
parcialmente desacetilado para formar quitosano. El quitosano puede actuar como un polímero que
permanece en solución o suspensión en base a la alteración de condiciones. Este polímero tiene afinidad
por la lectina de germen de trigo. La técnica consiste en incubar el extracto de germen de trigo con
quitosano a pH 5.5 donde el quitosano existe como solución. Después de que se completa el tiempo de
incubación, se cambia el pH a 8.5 en el cual el complejo quitosano-lectina de germen de trigo precipita.
Este complejo se separa y redisuelve al alterar el pH a 5.5. Después de esto una simple filtración en gel
puede separar el quitosano y la lectina de germen de trigo.
pruebas de actividad en muestras pequeñas drenadas desde la solución principal. El gel de fosfato de
calcio tiene la ventaja de que inicialmente las otras proteínas son removidas seguido por una súbita
remoción de la enzima dejando una solución inactiva con muchas proteínas.
Un tampón ligeramente alcalino se usa para la elución de la enzima adsorbida a partir de las fracciones
activas. Usualmente se usa tampón fosfato a pH 7.6. Si esto falla para eluir la enzima, se repite hasta que
se hace una remoción adicional de los contaminantes. La elución final se hace usando fosfato que contiene
sulfato de amonio al 10%.
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El volumen del eluyente no debe ser grande y se pueden usar agitadores de alta velocidad para
incrementar la eficiencia.
3. Métodos adicionales:
Algunos otros métodos, los cuales no son tan populares ahora, incluyen cromatografía en hidroxiapatita,
cromatografía hidrofóbica y precipitación mediante polietilenglicol y concentración por liofilización. Las
sales de metales pesados se pueden usar para purificación de enzimas. Dan como resultado la
precipitación y forman cristales característicos. Los metales pesados son luego removidos cuidadosamente
mediante el uso de agentes quelantes. En años recientes el uso de la técnica de Western blotting ha llegado
también a ser una herramienta común para el aislamiento de enzimas.
En Western blotting la mezcla es sometida a SDS-PAGE y luego transferida sobre una membrana desde el
gel. La membrana está enlazada con anticuerpos específicos contra la enzima deseada y por tanto después
de la incubación solamente la enzima se enlaza con el anticuerpo. Esto reacciona luego con un segundo
anticuerpo que está marcado con una enzima que hace posible una detección del complejo mediada por
color.
SDS
Elección de los métodos de purificación
Los lectores al momento están conscientes de que hay muchos métodos que se pueden usar para la
purificación de enzimas. Se debe notar que un solo procedimiento no es suficientemente bueno para dar un
aislado de enzima 100% puro. La elección de los métodos y su secuencia de uso son dependientes de
varios criterios, los cuales se discuten a continuación:
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Por esto se emplean usualmente técnicas más sofisticadas basadas en afinidad y especificidad de las
enzimas.
(A) Rendimiento
(B) Actividad específica
(C) Factor de purificación
(A) Rendimiento
El extracto crudo con frecuencia es sometido a fraccionamiento y para chequear la presencia de la enzima
deseada en la fracción purificada, se compara su actividad con aquella del extracto crudo. Se determina
luego el rendimiento usando la fórmula,
formación del producto o la utilización del sustrato y esto puede cambiar con las enzimas (por ejemplo la
actividad de la amilasa se puede seguir mediante la desaparición del almidón mientras aquella de la
fosfatasa se puede seguir mediante el fosfato inorgánico generado como resultado de la catálisis
enzimática.
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(A) Ensayos cualitativos
Los ensayos cualitativos no son estequiométricos y se usan solamente en el primer paso para determinar
que la enzima de interés está presente en la fuente escogida para aislarla o a veces como una prueba
confirmatoria para el aislado final. Estos ensayos son simples de diseñar. Poco conocimiento de la
reacción catalizada, sustrato requerido y otros requerimientos (incluyendo las condiciones de reacción
propias) es suficiente para formular el ensayo cualitativo.
Hay dos tipos de ensayos cuantitativos. El ensayo de dos puntos y el ensayo cinético.
b. Ensayo cinético
Se denomina también ensayo de monitoreo continuo. Las lecturas son registradas continuamente para la
determinación de la velocidad de reacción por lo tanto se obtienen múltiples lecturas. Cuando la
concentración de sustrato disminuye, la velocidad de reacción también decrece. En la mayoría de ensayos
enzimológicos clínicos se adopta este método.
bajo muchas condiciones de laboratorio. Por tanto, son necesarios pasos específicos para evitar la
desnaturalización y pérdida de la actividad de la enzima. Las recomendaciones generales están en la línea
de preservación de las proteínas pero las mejores condiciones para cada enzima deben ser determinadas
específicamente. Se puede decir que las enzimas son óptimamente estabilizadas mediante condiciones
específicas de pH, fuerza iónica, composición aniónica/catiónica, etc. de la solución. Se debe notar que las
condiciones de estabilidad son diferentes de las condiciones de actividad óptima.
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General enzymology 2017
Para almacenamiento a largo plazo, se debe mantener a las enzimas a temperaturas criogénicas de
alrededor de -70 C o bajo nitrógeno líquido. A pesar de que la mayoría de laboratorios utilizan técnicas
de congelación convencional que usan temperaturas entre 0 y -20 C, las enzimas guardadas soportan
ciclos no intencionales de congelación y descongelación, ya que se requieren temperaturas altas para
mantenerlas libres de escarcha. La estabilidad de la enzima puede incrementarse grandemente añadiendo
igual volumen de glicerol y mezclándolo apropiadamente con la muestra. Esto permite que la proteína
permanezca en la fase líquida a bajas temperaturas y evita su posible desnaturalización debida a ciclos de
congelación-descongelación.
Aún otra preocupación es acerca de los contaminantes microbianos y sus actividades degradantes sobre las
proteínas. Las muestras deben ser filtradas a través de microfiltros estériles compuestos de un material que
enlaza poca proteína y colocadas en tubos criogénicos estériles para evitar la contaminación bacterial. Una
muestra congelada de enzima debe ser descongelada solo en las cantidades requeridas y usada
inmediatamente. Para evitar desperdicio de las muestras de enzima, se deben almacenar en pequeñas
cantidades. Una vez descongelada la enzima se debe mantener temperatura fría (4 C) lo más que se pueda
antes de equilibrarla a la temperatura de ensayo. Ciertos aditivos incrementan la estabilidad de las enzimas
para almacenamiento a largo plazo a temperaturas criogénicas y a veces para almacenamiento a corto
plazo en soluciones. Estos aditivos incluyen el glicerol, sacarosa y ciclodextranos. Las cantidades
requeridas de los estabilizadores son diferentes para enzimas diferentes y deben ser resueltos
específicamente. Algunas enzimas se estabilizan en presencia de sus cofactores, sustratos o aún
inhibidores que se enlazan a su sitio activo para formar compuestos transitorios que tienen más
estabilidad.
Las enzimas pueden a veces perder la actividad debido a su adsorción inespecífica sobre las paredes de los
dispositivos de almacenamiento hechos de vidrio o de plástico ordinario. Por tanto, es aconsejable usar
contenedores hechos de polipropileno o polietileno. El problema puede ser contrarrestado con la adición
de proteínas portadoras inertes adicionadas a una concentración mucho más alta que la de la enzima, la
cual satura las superficies de unión y deja a las moléculas de enzima libres e intactas. Albúmina de suero
bovino y gelatina han utilizado frecuentemente los enzimólogos a nivel mundial con gran éxito para este
propósito. La gelatina a una concentración de 1 mg/mL satisface para la mayoría de soluciones stock de
enzimas, ya que no interfiere con los ensayos ultravioleta debido a su carencia de aminoácidos aromáticos.
La cristalización de enzimas fue inicialmente tomada como criterio de pureza, sin embargo, más tarde se
encontró que muchas enzimas cristalizadas contenían hasta 50% de impurezas. Con frecuencia se necesitó
recristalización antes de decir que un cristal es suficientemente puro. El método empleado más
comúnmente es la formación de cristales a partir de soluciones con sulfato de amonio donde la solución se
mantiene en reposo por largos períodos de hasta semanas durante los cuales se pueden obtener cristales de
buena calidad. Hay dos enfoques comúnmente empleados. La sal se añade a una solución de enzima
comparativamente concentrada hasta que aparece una ligera turbidez después de lo cual se deja reposar a
la solución y la concentración de sal se incrementa lentamente mediante la adición de unas pocas gotas de
solución saturada de sal después de intervalos de largo tiempo. Alternativamente, se pueden usar sistemas
capilares de adición. La diálisis o la simple evaporación de la solución puede producir resultados
Traducido por: Cecilia Carpio
Algunos investigadores han usado metales pesados para formar tales cristales de enzimas. Por ejemplo la
enzima fosfopiruvato hidratasa fue cristalizada inactiva como una sal de mercurio. En general, se ha
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realizado la cristalización de enzimas desde los 1930s y los cristales de enzima tienen algunas ventajas
frente a las soluciones. Algunas de ellas incluyen:
Pueden ser fácilmente empacados, almacenados y transportados.
Tienen menor opción de ataque microbiano y cambios espontáneos.
Se pueden utilizar convenientemente en microcantidades.
Se pueden usar para estudios cristalográficos para conseguir más información sobre la enzima.
Muchas pruebas son las mismas que las técnicas usadas para purificación. Una sola banda con
electroforesis, o la sedimentación de un solo componente o con ultracentrífuga. Esto es porque las
constantes de sedimentación de las proteínas no están uniformemente distribuidas y descansan en valores
muy probables, incrementando las opciones de contaminación mediante proteínas no enzimáticas. Como
ocurre con frecuencia, muchas proteínas tienen pesos moleculares o formas similares lo cual conduce a su
agrupación en una sola banda o coeficiente de sedimentación. Aún la movilidad electroforética no es un
criterio que pudiera tomarse como una prueba del 100% de pureza, ya que muchas proteínas pueden tener
cargas eléctricas similares que dan como resultado la misma movilidad. La sensibilidad de las pruebas de
afinidad se supone es la prueba ideal pero aún hay muchas veces cuando los contaminantes terminan en
las preparaciones finales. La segunda desventaja cuando se trabaja con soluciones de proteínas es que
ninguna técnica es suficientemente sensible para detectar pequeñas cantidades de contaminantes. Las
pruebas de solubilidad son una mejor alternativa. Una serie de soluciones de enzima en incrementos
regulares se mezclan con una cantidad constante de agua o una solución de sal, se agita y luego se filtra o
centrifuga y se estima la proteína en el líquido resultante. Si se grafica la cantidad frente a la cantidad
tomada inicialmente el gráfico es inicialmente lineal (ya que toda la proteína adicionada se disuelve, y se
obtiene un gráfico con pendiente 1) pero conforme se hacen las adiciones posteriores, la solución se llega
a saturar y se obtiene una línea horizontal. Si una segunda proteína contaminante está presente,
inicialmente la proteína que es más soluble alcanza la etapa de saturación después de la cual la proteína
que es menos soluble continúa disolviéndose hasta que alcanza su punto de saturación, la cual se vuelve
aparente mediante un doblez que se ve en el gráfico.
Un procedimiento simplificado, propuesto por Northrop, usa la determinación de dos puntos, uno a la
aparición del doblez y el otro alejado a la derecha. Se toman dos tubos y en el primero se añade una
cantidad de proteína suficiente para generar una ligera turbidez. Al segundo tubo se añade 10 veces la
cantidad adicionada al primero, se mezcla y ambos tubos son centrifugados. Si los sobrenadantes
contienen exactamente las mismas cantidades de proteína, entonces la preparación es considerada pura.
Sin embargo, si hay un incremento, es considerada como una solución impura o contaminada.
La recristalización se usa con frecuencia ya que se ha observado que el valor de actividad específica
Traducido por: Cecilia Carpio
alcanza un valor constante después de unos pocos ciclos de recristalización. Se toma entonces como que la
pureza es máxima. En el caso de isoenzimas de una enzima particular, se usa con frecuencia separación en
gel de agar.
La elección del tipo y número de métodos usados para la determinación de la pureza de la preparación
enzimática es dependiente de la elección de las personas que trabajan con ellas así como de las
instalaciones disponibles y del soporte económico.
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(8) Métodos de preservación de las enzimas purificadas
Una vez que las enzimas son purificadas y estabilizadas, son preservadas hasta su utilización posterior. Los
métodos de preservación utilizados dependen del volumen de aislado, la frecuencia y el período de utilización y
de las instalaciones de almacenamiento disponibles. Por mucho la preservación criogénica ha sido la técnica
más efectiva. Sin embargo, esta instalación no está disponible en la mayoría de laboratorios. Algunos
laboratorios de investigación almacenan sus aislados a temperatura de congelación en congeladores profundos
(-4 a -20 C) y se añaden con frecuencia a tales preparaciones algunos materiales estabilizantes para
incrementar su calidad y tiempo de almacenamiento. Muchos otros usan polvos de acetona y cristalizan las
enzimas.
En general son comunes algunas precauciones para el almacenamiento de todos los aislados, los cuales
incluyen:
1. El almacenamiento debe ser en microalícuotas.
2. Se deben evitar los materiales tales como vidrio, cuarzo o plástico ordinario cuando se escogen los
contenedores.
3. La preparación debe ser microfiltrada para remover cualquier posible contaminación bacterial antes de
preservarla.
4. Si se usa una parte de la microalícuota para un experimento, la solución remanente no debe ser preservada.
5. Algunas enzimas, especialmente las enzimas alostéricas son inestables a 0 C y pierden sus interacciones
subunitarias.
6. Se recomiendan con frecuencia estabilizantes, sin embargo, la cantidad exacta y el tipo de estabilizante
requerido necesita ser determinado específicamente.
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Son sintetizadas en las células: Casi todos los sistemas vivientes a excepción de los virus contienen enzimas.
De hecho las células pueden sobrevivir, crecer y llevar a cabo todos los cambios y transformaciones dentro de
ellas, con las enzimas. Sin embargo, es interesante notar que las enzimas pueden ser sintetizadas en mezclas de
reacción que contienen todos los componentes requeridos para su síntesis.
Funcionan como catalizadores: Se requieren para llevar a cabo las diversas reacciones biosintéticas y de
degradación en las células. Permiten a la célula almacenar materiales (por ejemplo, la glucosa se almacena
como glucógeno en el hígado y el músculo por la acción de enzimas específicas), o pueden utilizar los
materiales almacenados (por ejemplo, en la degradación del glucógeno, las moléculas de glucosa se forman
nuevamente). Oxidan sustancias para producir energía, (por ejemplo, la glicólisis, la ruta de la Hexosa
monofosfato (HMP), la Cadena de Transporte de Electrones (ETC), producen ATP y equivalentes reductores
que generan energía química en las células) y sintetizan nuevos materiales según se requiera (por ejemplo, la
síntesis de Novo de nucleótidos, aminoácidos, azúcares, etc).
En su mayoría son universales: Salvo algunas diferencias, las enzimas que catalizan reacciones similares son
comunes a todos los sistemas vivos. Por ejemplo, la hexoquinasa aislada de procariotes y de eucariotes
catalizan reacciones similares.
Son principalmente proteínas por naturaleza: Salvo algunas excepciones, casi todas las enzimas son de
naturaleza proteica y están formados de forma natural por aminoácidos. Las excepciones incluyen las ribozimas
o moléculas de ARN catalítico. Se creía antiguamente que todas las enzimas son de naturaleza proteica, sin
embargo, el concepto se modificó con el descubrimiento de RNA de empalme automático de Tetrahymena spp.
También son activas en sistemas libres de células: Una de las propiedades más notables de las enzimas es que
son activas aún en sistemas libres de células. Durante las etapas de desarrollo de la enzimología, algunos
científicos incluyendo Pasteur creían que las enzimas eran inseparables de las células, dando lugar a la famosa
controversia Pasteur-Liebig, la cual duró hasta la evidencia mostrada por Buchner de que son capaces de
permanecer activas en sistemas libres de células. Las técnicas actuales con frecuencia usan enzimas
inmovilizadas, electrodos de enzimas, etc para dianóstico.
Catalizan reacciones disminuyendo la energía de activación: las enzimas se combinan transitoriamente con
los reactantes para producir un estado de transición estable que tiene una energía de activación más baja que el
estado de transición de la reacción no catalizada. Por tanto aceleran las reacciones bioquímicas bajando la
energía de activación. Cuando los productos de la reacción se forman, se regenera el catalizador libre.
Son altamente sensibles a parámetros ambientales: las enzimas funcionan dentro de un rango limitado de
condiciones y su actividad es marcadamente afectada por varios parámetros. Estos incluyen factores como pH,
temperatura, concentración de sustrato, inhibidores, activadores, iones, radiaciones, etc. por ejemplo una
alteración drástica en el pH o en la temperatura conduce a la desnaturalización de la estructura “3D” del sitio
activo reduciendo por tanto grandemente o deteniendo completamente la catálisis.
Traducido por: Cecilia Carpio
Pueden ser sintetizadas en formas precursoras: Ciertas enzimas, especialmente aquellas que actúan lejos del
sitio de síntesis son sintetizadas usualmente en formas precursoras. Las proteasas son los mejores ejemplos
estudiados. Los precursores se denominan como formas zimógenas y tienen que ser activadas antes de que
puedan actuar sobre sus sustratos. Ejemplos incluyen el tripsinógeno, quimotripsinógeno, pepsinógeno, etc. Su
activación se lleva a cabo habitualmente mediante la eliminación de una secuencia líder que comprende unos
pocos aminoácidos.
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Reaccionan específicamente: Las enzimas son específicas en acción, reaccionan con un solo sustrato o con
limitados sustratos. Aquellas que reaccionan con un solo sustrato se denominan enzimas absolutamente
específicas (el ejemplo incluye la glucoquinasa que convierte la glucosa en glucosa-6-fosfato) mientras que
otras podrían ser específicas de grupo (ejemplo: la hexoquinasa) o ampliamente específicas (un ejemplo es la
tripsina que puede actuar sobre proteínas, péptidos, ésteres, etc). Se ha encontrado también especificidad en
términos de arreglos geométricos o espaciales (las D aminoácido oxidasas no actúan sobre los L-aminoácidos)
o propiedades ópticas de los sustratos.
Pueden ser dependientes de coenzima/cofactor: ciertas enzimas son dependientes de compuestos inorgánicos
o de pequeños compuestos orgánicos para su actividad. Estos componentes cumplen varias funciones que
incluyen el incremento de la afinidad por el sustrato, disminución de Km, acoplando enzima y sustrato,
afectando la proximidad y orientación, juganod un rol en la catálisis, etc.
Muchas enzimas son alostéricas en naturaleza: las enzimas alostéricas son aquellas que tienen un sitio
diferente al sitio de enlazamiento del sustrato. También tienen una estructura de subunidad y muestran cinética
sigmoidal, debido a la cooperatividad positiva o negativa. Usualmente sirven como puntos regulatorios en la
secuencia metabólica. El ejemplo mejor estudiado es de la aspartato transcarbamilasa. Ella cataliza la
transferencia del aspartato al carbamilfosfato en la síntesis de Novo de pirimidinas.
Pueden estar localizadas dentro de la célula: muchas veces las enzimas que son responsables de una vía
metabólica particular se encuentran cerca una de otra, localizadas en una región específica de la célula o en un
organelo subcelular particular. Dicha unión puede deberse en algunos casos a un mero agregado sin alguna
unión físicoquímica de los diversos componentes entre sí (por ejemplo las enzimas de la vía glicolítica)
mientras que en otros forman un complejo multienzima (ejemplos incluyen el complejo de la ácido graso
sintetasa, los complejos de la cetoácido deshidrogenasa y los complejos involucrados en la síntesis de
pirimidina).
Pueden mostrar preferencias direccionales mientras catalizan reacciones reversibles: trabajan con igual
eficiencia in vitro e in vivo. Aunque algunas reacciones muestran preferencias direccionales cuando las
enzimas están presentes en las células pero son libremente reversibles en los sistemas libres de células, esto se
debe principalmente a las necesidades específicas y al estado de energía de la célula. Esta capacidad ha sido
muy útil en la explotación comercial de enzimas de importancia industrial. Muchas enzimas se utilizan
regularmente en diagnóstico y diagnóstico diferencial, tratamientos terapéuticos, fermentaciones industriales,
etc.
Pueden reusarse efectivamente en sistemas libres de células: las enzimas después de la inmovilización en
matrices sólidas se pueden reutilizar muchas veces para llevar a cabo la conversión catalítica de sustratos
específicos.
Las enzimas son a veces mejores herramientas que al usar las células microbianas completas: Esto es
Traducido por: Cecilia Carpio
especialmente cierto en transformaciones de un solo paso; donde las células microbianas requieren un control
estricto de los parámetros de crecimiento y nutrición y aún tienen la opción de soportar mutaciones espontáneas
afectando de ese modo el rendimiento global. Las enzimas aisladas e inmovilizadas no pierden su eficiencia por
tiempo considerable.
Algunas enzimas pueden actuar sobre sí mismas: Este es un rasgo característico de tetrahymena RNA, sin
embargo muchas enzimas pueden actuar sobre sí mismas para su activación. (por ejemplo: la pepsina puede
actuar sobre el pepsinógeno y llevar a cabo su activación).
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