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PATOLOGIA

CLINICA

Prof. Gulletta
Lezione del 12/12/2019
1°ora
Argomento: Elettroforesi, Elettroforesi capillare


Parleremo dell’elettroforesi dal punto di vista dell’applicazione che viene effettuata in laboratorio
per andare ad analizzare le frazioni proteiche presenti nel siero di sangue. Questa indagine è
fondamentale per diagnosticare alcune particolari situazioni cliniche, che potrebbero interessare il
sistema di produzione e di catabolismo elettroforetico delle proteine, ma soprattutto per
cominciare a chiarire quelle che sono le patologie che alterano alcune frazioni proteiche, facendo
riferimento soprattutto alle alterazioni che interessano l’albumina e tutte le frazioni delle gamma
globuline. L’importanza di avere la disponibilità di utilizzare l’elettroforesi per caratterizzare le
varie frazioni è proprio quella di cominciare a porre un punto fermo rispetto a quelle che sono le
alterazioni delle frazioni proteiche, delle proteine presenti nel plasma (plasmacellule), in
particolare per quello che riguarda le modificazioni quali e quantitative, soprattutto quantitative
nell’albumina, e delle interazioni anche in questo caso quali e quantitative della componente
gamma. Tali modificazioni hanno luogo poiché le varie frazioni proteiche hanno una mobilità
elettroforetica.

Il principio dell’elettroforesi è quello secondo il quale sottoposte ad un campo elettroforetico da
una differenza di potenziale, escludendo le condizioni saline (pH e tampone), le proteine si
caricano in funzione del loro punto isoelettrico e si spostano in funzione della differenza di
potenziale. Il supporto utilizzato per avere la disponibilità del tracciato della mobilità
elettroforetica è differente a seconda che si voglia separare le diverse componenti non solo delle
proteine ma anche e soprattutto delle proteine presenti nel siero o presenti nelle urine o delle
proteine presenti nei diversi fluidi biologici e se vogliamo separare frammenti di DNA. La
metodologia utilizzata è legata al fatto che si carica una molecola o una macromolecola ed a
determinate condizioni questa si separa dalle altre presenti contestualmente nella stessa matrice
biologica. Noi utilizziamo l’elettroforesi per andare a separare le diverse componenti delle
sieroproteine, quindi la matrice biologica che andiamo ad utilizzare viene direttamente ottenuta
dal siero di sangue, dal prelievo di sangue venoso, che subisce una manipolazione preanalitica, che
non altera la qualità della matrice biologica utilizzata. È necessario però stare attenti alle
condizioni della corsa elettroforetica, alla durata, all’utilizzo del supporto e della matrice che
possono variare e che ci possono dare una sensibilità analitica, cioè una capacità di distinguere
una frazione dall’altra che può essere diversa.
La fase più importante risulta essere quella analitica, in cui è fondamentale prestare molta
attenzione, successivamente a questa esistono tutta una serie di problematiche legate
all’interpretazione clinica del dato analitico ottenuto.

Negli ultimi anni in laboratorio, per meglio caratterizzare le sette frazioni proteiche, è diventata
preponderante una metodica analitica definita elettroforesi capillare.
Quest’ultima, ha un grande vantaggio, è basata sul fatto che la mobilità elettroforetica delle
proteine viene sviluppata, tenendo sempre il tutto in una soluzione salina ad una determinata
concentrazione molare, e somministrando il campione alla differenza di potenziale adatta,
evitando l’effetto Joule, l’effetto calore, che potrebbe distorcere la velocità elettroforetica delle
proteine. Il campione viene fatto migrare in un capillare, quindi la corsa elettroforetica è
perfettamente indirizzata, ciò ci permette di avere una migliore separazione delle varie frazioni
proteiche, con effetto di endosmosi si centralizza rispetto al percorso del flusso dentro al capillare,
ed alla fine del percorso analitico c’è un sistema di rilevazione delle frazioni man mano che
arrivano.

Per cui ciò che rende efficiente l’elettroforesi capillare è sia il fatto che riusciamo a controllare il
pH, quindi il sistema tamponante (di conseguenza la forza ionica), controlliamo il campo elettrico,
la durata della corsa elettroforetica e limitiamo fortemente l’effetto Joule.
Per cui oltre ad una serie di vantaggi analitici, l’elettroforesi capillare ci da la possibilità di poter
utilizzare contemporaneamente una serie di otto o addirittura dodici capillari, quindi 8 o 12
tracciati elettroforetici in un arco di tempo relativamente modesto, effettuando un maggior
numero di analisi.

Lo schema di rilevazione è basato sulla lettura, alla luce ultravioletta, delle frazioni proteiche,
atteso che le proteine, a seconda del contenuto di amminoacidi, abbiano un indice di rifrazione
che consenta di distinguerle le une dalle altre.


Nella diapositiva sopra, vediamo i vantaggi della tecnica, nel nostro caso il grandissimo vantaggio è
la riduzione del tempo per numero di campioni, la possibilità di automatizzare completamente la
performance analitica, la possibilità di avere una separazione delle frazioni proteiche molto più
netta e quindi la possibilità di poterle riconoscere meglio in funzione della loro velocità di
migrazione, per non dimenticare l’accuratezza e la riproducibilità.


L’applicazione dell’elettroforesi capillare non viene effettuata solo per la separazione di peptidi,
proteine, amminoacidi, ma può essere utilizzata anche in campo tossicologico per separare diverse
componenti tossiche, o in campo farmaceutico per verificare la presenza di farmaci
nell’organismo.

Alla fine del processo analitico, quello che otteniamo è un tracciato, con picchi che corrispondono
esattamente alle varie proteine che ci aspettiamo di riconoscere nella nostra indagine e otteniamo
un grafico in cui vengono riassunti i dati, grafico che segue.

Nel grafico noi troviamo l’identificativo del campione, abbiamo la data, il reparto nel quale è
ricoverato il paziente ed il tipico tracciato elettroforetico che viene confrontato con il tracciato
della corsa elettroforetica.
Partiamo dai dati, osservando le bande nere indicate in basso sulla sinistra e confrontando i dati
delle proteine ottenuti dal processo di elettroforesi con i valori di riferimento. Se osservando il
valore di proteine totali (in basso) valore 7.4 g/dl, all’interno dei valori di riferimento, non
sembrerebbe ci possano essere alterazioni patologiche, la percentuale delle singole proteine però
è sicuramente alterata. Bisogna quindi non fare riferimento al dato totale, ma bisogna sempre
interpretare i singoli dati in studio. Per cui anche se apparentemente il soggetto in questione non
sembra essere in una condizione di ipo o di iperproteinemia, le concentrazioni relative alle varie
componenti proteiche sono alterate, e ce ne possiamo accorgere osservando il calcolo percentuale
delle stesse partendo dall’albumina:
- Albumina 49,6 % (valore più basso rispetto ai valori di riferimento)
- Non ci sono grandi e gravi alterazioni delle Alfa 1 e 2
- Ci sono alterazioni delle Beta 1, queste sono un po’ più alte del valore di riferimento
- C’è un importante alterazione delle Beta 2, 18,1%
- Le gamme sono all’interno dei valori di riferimento
Questi dati si possono riassumere esprimendo il rapporto Albumina/Globulina, che dovrebbe
essere intorno ad 1,5-2.0, ma che in questo basso risulta alterato e basso 0,98 (il valore inferiore
ad 1, è dovuto di logico, ad un aumento delle globuline rispetto all’albumina).
Dai dati allora possiamo affermare che c’è un’alterazione delle componenti.
Se osserviamo il tracciato, in alto a sinistra, (grafico con i picchi), possiamo confrontarlo con i dati
appena analizzati, di fatti osservando i picchi, questi, da sinistra verso destra seguono l’ordine
espresso dai valori in basso nella tabella con le percentuali, ci rendiamo conto che il quadro totale
dei componenti ci restituisce un quadro clinico patologico. Potrebbe non osservarsi subito dal
primo picco, quello più alto, che si riferisce all’albumina, una diminuizione percentualmente
registrata della stessa, ma osservandolo bene ci si rende conto che lo stesso (picco) non è
simmetrico, di colpo la retta scende; il discorso chiave è confrontare i dati ottenuti dallo
strumento attraverso il tracciato con i dati percentuale numerici, purchè siano analizzati e
ragionati. Quindi fondamentale è l’interpretazione del dato con relativo studio, dobbiamo quindi
sapere che cosa c’è dal punto di vista delle proteine alterate all’interno del tracciato. Di
conseguenza per completare il percorso dobbiamo eseguire, ottenuto il tracciato alterato, una
seconda indagine di immunoelettroforesi, una valutazione su base elettroforetica, che si ottiene
facendo reagire le varie componenti ottenute con anticorpi monoclonali specifici nei confronti
delle catene pesanti e delle catene leggere delle proteine. Si otterrà quindi, dove c’è l’incontro tra
l’anticorpo monoclonale e la catena, una reazione positiva, che tramite elettroforesi mi restituisce
un secondo tracciato (dalla slide sopra, in alto a destra), dove si ha una colonna di riferimento che
ci indica dove è avvenuta la corsa elettroforetica e una serie di bande (violacee) che indica la
presenza maggiore o minore delle varie componenenti proteiche, ma solo quelle che
eventualmente reagiscono con l’anticorpo monoclonale specifico. Per cui abbiamo bisogno di
avere 3 corsie in cui mettiamo a reagire l’anticorpo monoclonale con le catene pesanti di tipo G,
con le catene pesanti di tipo A, con le catene pesanti di tipo M, con le catene pesanti di tipo K, con
le catene pesanti di tipo Gamma. Facendo questo, e osservando dove si è ottenuta la positività, si
riesce a capire quale catena, quale immunoglobulina è presente in questo complesso di tracciato,
bisogna sostanzialmente risolvere il tracciato. Nel nostro tracciato è presente un IgA, ed è un IgA
con catena K, non abbiamo positività nella corsia dove è presente l’anticorpo anti IgM, quindi non
è una catena M, non è una catena G.
Quest’ ultima indagine, ci consente di chiudere il cerchio facendoci capire che nel caso del
paziente in questione c’è una presenza di componente monoclonale di tipo IgA-K, possibilità che si
crea nei soggetti con Mieloma multiplo.
L’elettroforesi è utile tutte le indagini ad essa connessa e che abbiamo sopra descritto, che ci
permettono di poter inquadrare nel paziente una possibile condizione clinica, che considerando i
valori ottenuti permette di predire quale potrebbe essere la diagnosi finale escludendo altre
possibili condizioni patologiche, prevedendo addirittura l’evoluzione della patologia stessa.

Successivamente si può anche utilizzare la tecnica dell’immunotipizzazione mediante
isoelettroforesi che permette di confermare l’indagine iniziale.
Uno Studente chiede al professore se può essere effettuata anche la proteinuria di Bence Jones, il
prof risponde:


La proteinuria di Bence Jones è un’indagine che sta piano piano scomparendo poiché è talmente
evidente la presenza di proteine nelle urine che tale indagine non risulta essere più diagnostica,
oltre ai problemi legati alla raccolta ed alla conservazione dell’urina stessa, per cui quello che si
preferisce fare è andare a misurare nel siero di sangue le cosiddette catene leggere libere, poiché
nel caso di una neoplasia o di un mieloma, c’è una iperproduzione delle stesse.



Linee guida sull’utilizzo dell’elettroforesi sieroproteica e di immunofissazione:
- Sospetto di una qualsiasi discrasia plasmacellulare (mieloma multiplo, macroglobulinemia
di Waldenstrom, amiloidosi…)
- Neuropatia periferica inspiegabile, dovuta ad esempio ad esposizione a sostanze tossiche
- Anemia di nuova insorgenza associata o meno ad insufficienza renale e/o dolore osseo
- Lombalgia ( in cui si sospetta il mieloma multiplo)
- Ipercalcemia sine causa interpretabile come possibile sindrome paraneoplastica
- Formazioni di rouleaux nello striscio di sangue
- Insufficienza renale sine causa
- Fratture inspiegabili o lesioni litiche rilevate con la radiografia
- Proteinuria di Bence Jones
Se un soggetto di 50-60 anni si sottopone ad un tracciato elettroforetico, ed in quest’ultimo
compare una piccola alterazione nella regione gamma, quest’ultima (vedi tracciato sopra,
precedentemente descritto) è come una collinetta con una base non tanto larga e con un profilo
regolare, se in questa regione compare quello che viene definito un piccolo “picchè”, un piccolo
picco,questo picco deve essere indagato. Il soggetto anche se non manifesta nessun problema
precedente all’analisi può presentare questa piccola alterazione all’indagine elettroforetica, picco
che viene definito “picco monoclonale di origine non benigna”. Da quest’ultimo approfondendo
le indagini si può classificare il paziente rispetto all’evoluzione del picco monoclonale in malattia
conclamata, e si può prevedere come evolve, in quanto tempo ed in che senso evolve.
…2° ora

La situazione clinica del


paziente è importante per
poter richiedere il test
appropriato, infatti cambia
molto se ci troviamo in un
caso di MGUS, di mielosa
multiplo smouldering o in
caso di mielosa multiplo
Franco, cioè evidente che
ha già segno e sintomi
importanti, ad esempio la
lesione ossea, o se siamo in
presenza di patologie meno
comuni.

La gammopatia monoclonale di significato non determinato, ne stiamo parlando un po’ in più


perche questa è una problematica, è
una situazione clinica con cui ci
possiamo confrontare più
frequentemente e che dobbiamo
saper gestire, sia in termini di indirizzo
nei confronti del paziente , sia in
termini di indagini, non solo in
laboratorio ma anche di ulteriore
approfondimento. È una condizione
caratterizzata da un moderato
aumento delle plasmacellule all’interno
del midollo del 10- 5%, ci può essere
qualche plasmacellula anche in circolo
perché vengono rilasciate. Vi può
essere presente una proteina
monoclonale nel sangue, non ci sono
manifestazioni cliniche e non ci sono manifestazioni ossee, i dati statistici dicono che al di sotto
dei 50 anni è veramente raro trovare una situazione de genere e che invece questa condizione
aumenta in maniera significativa dopo quest’età, indipendentemente dal sesso abbiamo
Un sostanzioso numero di
persone, circa il 4.7%. Quindi la
fasci d’età è già di per se
indicativa, è importante sin
dall’inizio identificare,
caratterizzare, valutare e studiare
il paziente perché anche in
questo caso i dati in laboratorio
sono fortemente suggestivi. La
componente monoclonale
superiore a 30 g/L, nei dati iniziali
del primo tracciato, plasmacellule
clonali midollari in quantità
superiore al 10%, sono un
segnale chiaro e predicono
un’altra indagine da eseguire, la
biopsia midollare, quindi ci sono
dati iniziali che vanno
immediatamente raccolti perché
predicono un rischio di
progressione dell’1% annuo,
rischio che persiste a 25-30 anni,
studi dimostrano che il mieloma
multiplo è sempre preceduto da
MGUS che però non è stato
riconosciuto ma dal punto di vista
clinico e patogenetico anche c’è
sempre una base di iperplasia
plasmacellulare e iperproduzine
della componente monoclonale
che non è stata riconosciuta.
Al contrario se noi avessimo fatto
un’indagine in un soggetto già
sotto analisi per l’età abbiamo
l’obbligo di andare avanti.
Altro punto importante, per cui è
importante caratterizzare la situazione,
è la componente monoclonale
superiore a 15, unita al dato
precedente di 30 g/L, già chiaramente
patologico, il punto critico, il punto di
non ritorno è rappresentato da un
valore superiore a 15 considerando
tutta la componente monoclonale, IgA
e IGE, Dal punto di vista dell’evolutività
, della gravità, della prognosi ; diverso
è il discorso per le IgG rispetto a IgA e
IgE. Il rapporto Kappa/ lambada è lo
score diagnostico per il mieloma
working group , un gruppo di persone,
ricercatori, che si interessano di mieloma a tutto tondo, e ci hanno l’indicazione che il rapporto FLC,
delle catene leggere libere iperprodotte è alterato, in genere il rapporto è superiore a 1 con kappa
> di lambda. Con i metodi sensibili attualmente disponibili riusciamo a misurarlo.

Si parla di stratificazione del rischio, rischio relativo, capire il paziente a che sotto popolazione
appartiene dal punto di vista del rischio, alto/basso? Vedrete che la coesistenza di tutti e tre i fattori
il rischio aumenta, ma nell’arco di anni, la curva che vedete nel grafico riguarda ben trent’anni,
l’evoluzione non è dall’oggi al domani tra MGUS e mieloma. Se noi facessimo una diagnosi di
MGUS ad 80 anni lo terremmo sotto controllo, ma l’attesa di vita del paziente quale sarebbe?
In generale come tratteremo il paziente, quali saranno i LEA ( livelli essenziali di assistenza)?
Un paziente con questa diagnosi deve essere monitorato, se c’è almeno un fattore di rischio. Il
MGUS è una situazione inapparente, perciò si tratta di accidentalità , perché il primo dato può
comparire senza nessun iniziale sospetto di malattia
La diagnosi di mieloma invece prevede che le plasmacellula clonale midollare superiore al 10%, il
midollo per definizione è policlonale o multivariato, nel midollo normalmente ci sono una grande
varietà di cellule, se l’immagine che avete al microscopio invece risulta anche se modestamente
una certa uniformità cellulare, tante cellule tutte uguali, siete difronte ad un midollo patologico.
Nel caso del mieloma, la cellula che si ripete in maniera clonale è la plasmacellula, per proliferazione
neoplastica. Poi vanno fatte una serie di ulteriori indagini per ottenere dati, ad esempio la famosa
CRAB ( in italiano carcinosi, iper calce mia, insufficienza renale e lesioni ossee) quattro segni sotto
l’acronimo CRAB, da un lato saranno importanti i segni, dall’altro i dati ottenuti in laboratorio, il
rapporto FLC e altri ancora che aumentano enormemente la probabilità.
Di fronte ad un MGUS che peggiora, in 10 anni, con uniformità del midollo si parla già di mieloma,
con la componente monoclonale misurata, ma ci sono tutte una serie di dati.

Ora vorrei attirare la vostra attenzione su un problema attuale, di cui parlano molto anche i media,
la malattia rare, che dovrebbero essere sempre al centro della nostra attenzione.
Questa slide ne spiega le condizioni, la malattia rare sono croniche e ciò implica tutta una serie di
problematiche, come il problema associato all’assistenza del malato e non solo, anche della
famiglia, perché in genere sono soggetti in età pediatrica, quindi si tratta di considerare la patologia
dal punto di vista socio assistenziale e non esclusivamente assistenziale. Ancora le malattie rare
sono degenerative, progressive e che spesso portano alla morte più o meno rapidamente. Sono
malattie disabilitanti, l’esigenza di assistenza del malato aumenta con il passar del tempo, la qualità
di vita dei pazienti è compromessa dal fatto che io malato perde progressivamente l’autonomia,
fino al punto che nn sn più capaci di fare nulla, in queste malattie inoltre il livello di dolore fisico è
molto alto oltre al dolore morale. Spesso non ci sono cure, terapie adeguate e la società dovrebbe
farsi carico a tutto tondo del paziente. Per quanto riguarda le statistiche invece, si contano circa
8000 malattie rare certificate, il 75% di esse colpiscono i bambini, il 30% di questi bambini muoiono
prima dei 5 anni, l’’80% delle malattie rare hanno una base genetica predefinita, per cui sono stati
identificati i geni alterati che portano a queste malattie.
Il professore ricorda che il 29 febbraio è la giornata mondiale dedicata alle malattie rare, spostata
al 28 febbraio negli anni non bisestili e lui si impegna in primo luogo a sensibilizzare gli studenti
verso queste patologie .

C’è stata una proposta in regione Piemonte, di


preparare e rendere competenti delle persone,
come punto centrale, di riferimento, per la
famiglia del malato attraverso una struttura
attrezzata. La prima difficoltà per le famiglie è
avere un riferimento è molto spesso non si riesce
a fare diagnosi, in quanto il riconoscimento non è
immediato e facile, quindi vi è un primo momento
di disorientamento, di peregrinazione da un
centro all’altro per fare diagnosi, che una volta
fatta esige di un riferimento continuo di un centro
che si fa carico della terapia e del sostegno clinico. Il nostro sistema è incapace di fornire terapie ,
ma ancora più grave è l’incapacità del sistema sanitario di fornire assistenza a tutto tondo.

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