LABORATORIO DE BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

ESPECTROFOTOMETRÍA.
Fecha de entrega 11/09/2019

Isabella Fernández, Steven Agredo, Jean Carlos Orozco, Diego Montaño

Universidad Santiago de Cali.

Informe presentado al Prof. Luz Dary Caicedo

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INSERTAR AQUÍ RESUMEN EN INGLES Y ESPAÑOL, JEAN CARLOS

PALABRAS CLAVE: ABSORBANCIA, CONCENTRACIÓN, ESPECTROFÓMETRO, LONGITUD DE ONDA

I. INTRODUCCIÓN

La espectrofotometría es uno de los métodos de

análisis más usados, y se basa en la relación que
existe entre la absorción de luz por parte de un
compuesto y su concentración. Cuando se hace
incidir luz monocromática (de una sola longitud de
onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la
luz incidente es absorbida por el medio y otra
transmitida, como consecuencia de la intensidad del
rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la
intensidad de la luz incidente y P la intensidad del
Figura 1. Espectro electromagnético
rayo de luz transmitido.[1]
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es
En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a
la relación entre la cantidad de luz transmitida que
la forma visible de radiación electromagnética, sino
llega al detector una vez que ha atravesado la
también a las formas UV e IR, que son invisibles.
muestra, It, y la cantidad de luz que incidió sobre
En espectofotometría de absorbancia se utilizan las
ella, Io, y se representa normalmente en tanto por
regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400
ciento: % T = It/Io x 100 La transmitancia nos da
nm) y el visible (400-780 nm). [2]
una medida física de la relación de intensidad
incidente y transmitida al pasar por la muestra. La
relación entre %T y la concentración no es lineal,
pero asume una relación logarítmica inversa.

La absorbancia (A) es un concepto más relacionado

con la muestra puesto que nos indica la cantidad de
luz absorbida por la misma, y se define como el
logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T =
-log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y
transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es
del 100% e indica que la muestra no absorbe a una
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determinada longitud de onda, y entonces A vale
log 1 = 0.
Ley de Lambert-Beer : Esta ley expresa la relación
entre absorbancia de luz monocromática (de
longitud de onda fija) y concentración de un
cromóforo en solución: A = log I/Io = ε·c·l La
absorbancia de una solución es directamente
proporcional a su concentración –a mayor número
de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-;
también depende de la distancia que recorre la luz
por la solución –a igual concentración, cuanto
mayor distancia recorre la luz por la muestra más
moléculas se encontrará-; y por último, depende de
ε, una constante de proporcionalidad -denominada
coeficiente de extinción- que es específica de cada
cromóforo. Como A es adimensional, las
dimensiones de ε dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm
mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea
posible, en M, con lo que las dimensiones de ε
resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así
expresado, en términos de unidades de
concentración molar (o un submúltiplo apropiado),
se denomina coeficiente de extinción molar (εM).
Cuando, por desconocerse el peso molecular del
soluto, la concentración de la disolución se expresa
en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1,
las dimensiones de ε resultan ser distintas, por
ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado
se denomina coeficiente de extinción específico
(εs). La ley de Lambert-Beer se cumple para
soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía
con la concentración, debido a fenómenos de
dispersión de la luz, agregación de moléculas,
cambios del medio [2]
V. DISCUSIÓN.
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II. MÉTODOLOGÍA
Al iniciar la practica nos asignaron para trabajar con
el reactivo azul de bromotimol (100 mg/litro) a pH
ácido, en primer lugar se realizó la determinación de
los espectros de absorción mediante la preparación
de dos tubos de ensayo, uno con 10 ml de agua
destilada que sirvió como blanco y en el otro se
mezcló bien 1 ml de azul de bromotimol(100
mg/litro) con 9 ml de agua destilada y una gota de
acido acético al 5%. El espectro se realizó midiendo
la absorción de luz cada 30 nm, empezando desde
400 hasta 700 nm, cada lectura con una calibración
previa con el blanco a 100 de transmitancia.
Posteriormente se realizaron las graficas
correspondientes de absorvancia vs longitud de
onda en nm.
Seguidamente se comprueba la ley de Beer-
Lambert, donde se analiza la variación de absorción
con respecto a la concentración de la sustancia que
se absorbe. Todo esto se realizó de la siguiente
manera: Primero se colocó el botón de longitud de
onda en el valor correspondiente a la longitud
máxima de absorción, se calibró con el blanco al
100% de transmitancia, se sustituye el blanco por
las soluciones de diferente concentración del Azul
de bromotimol(100 mg/litro), no se calibró el blanco
de nuevo. Posterior a esto se preparó las
disoluciones de la sustancia , a partir de la solución
original del Azul de bromotimol de 100mg, a cada
una de estas disoluciones se les agrega una de ácido
acético, la preparación de las disoluciones se
observan en la TABLA #.
En cada caso se tabularon los datos , se elaboraron
graficas de absorbancia vs. Concentración en mg/l y
se estableció la concentración problema.
III. RESULTADOS
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VI. CONCLUSIONES.

La transmitancia nos indica la cantidad de energía que

logró atravesar el medio absorbente. Pero por otra
parte, la absorbancia expresa de manera cuantitativa la
cantidad de energía que quedó absorbida en las
moléculas del medio absorbente.

Se logró elaborar la curva de calibración.

Bajo los parámetros de la ley de BEER-LAMBERT

efectivamente se corrobora que cuando un rayo de luz
monocromática pasa a través del medio absorbente, su
intensidad disminuye exponencialmente cuando la
concentración del medio aumenta. [3]

REFERENCIAS

[1]/sysroot/home/usuario/Descargas/Guia_TP_2_Qui
mica_II_2010.pdf

[2] https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pd

[3]Modern Analytical Chemistry-David Harvery
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