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ISTOCHIMICA E IMMUNOCITOCHIMICA

Procedure chimiche specifiche possono fornire informazioni sulla funzione delle cellule e sulle
componenti extracellulari di un tessuto

Le procedure istochimiche e citochimiche sono basate sul legame specifico· di un colorante, sull'uso contro particolari
componenti della-cellula di un anticorpo marcato con una molecola fluorescente oppure sull'attività enzimatica
intrinseca di proteine cellulari ed extracellulari. Inoltre, è anche possibile localizzare molecole di grandi dimensioni
tramite il processo di autoradiografia, in cui i precursori metabolici della molecola, marcati con isotopi radioattivi,
vengono incorporati dalle cellule o dai tessuti vivi prima della fissazione. Molte di queste procedure possono venire
impiegate sia con il microscopio ottico che con il microscopio elettronico.
Prima di discutere della chimica delle colorazioni di routine e dei metodi istochimici e citochimici più comuni, è utile
esaminare brevemente come sia composta una sezione di un campione fissato e incluso.

Composizione chimica dei campioni istologici

La composizione chimica di un tessuto pronto per la colorazione di routine è spesso notevolmente


diversa da quella del tessuto vivo

Le componenti che rimangono dopo fissazione consistono per lo più di grandi molecole che non sono facilmente
solubili, in particolare dopo trattamento con il fissativo. Sono queste molecole di grandi dimensioni, e in particolare
quelle che reagiscono con altre grandi molecole a formare dei complessi macromolecolari, che vengono preservate in
una sezione di tessuto. Esempi di questi complessi macromolecolari sono:
 nucleoproteine, formate dagli acidi nucleici legati alle proteine della cromatina;
 strutture citoscheletriche intracellulari e proteine associate;
 proteine extracellulari, che per loro natura costituiscono aggregati insolubili di grandi dimensioni, con
formazione di legami covalenti tra i singoli elementi, come nel caso delle fibre collagene o delle fibre
elastiche;
 complessi tra proteine, carboidrati e fosfolipidi sulla superficie delle membrane cellulari.

Queste molecole costituiscono la struttura delle cellule e dei tessuti e sono perciò alla base dell'organizzazione interna
dei tessuti osservabile al microscopio.
Spesso un elemento strutturale è anche un'unità funzionale. Per esempio, nel caso delle proteine che formano il sistema
contrattile delle cellule muscolari scheletriche, i singoli filamenti visibili sono anche le strutture responsabili del
processo di contrazione. L'mRNA citoplasmatico è visualizzabile come parte di strutture subcellulari (per esempio il
reticolo endoplasmatico rugoso delle cellule secretorie, o i corpi di Nissl delle cellule nervose), ma è anche uno degli
attori principali della sintesi proteica.

Numerose componenti dei tessuti vengono perse durante la preparazione di sezioni colorate con EE

Sebbene gli acidi nucleici, le proteine e i fosfolipidi siano mantenuti nelle sezioni di tessuto, molte altre molecole
vengono perse. Per esempio, piccoli acidi nucleici come tRNA(RNA transfer) o altri piccoli RNA sono difficilmente
mantenuti in situ dalla fissazione. Per poterli osservare si rende necessario l'uso di fissativi più forti, come la
paraformaldeide o la glutaraldeide, che sono in grado di formare dei reticoli molto più stretti rispetto alla formaldeide.
Nel caso dei lipidi, che vengono estratti dall'uso di solventi organici durante l'inclusione in paraffina, si usano fissativi
contenenti metalli pesanti oppure si fissa il tessuto per congelamento. Altre molecole, anche di grandi dimensioni,
possono andare perse per processi di idrolisi dipendenti da condizioni non ottimali di pH del fissativo stesso. Per
esempio:
 glicogeno, un polimero formato da lunghe catene di carboidrati, usato come riserva da cellule epatiche e muscolari;
 proteoglicani e glicosaminoglicani, complessi extracellulari di carboidrati che si trovano nei tessuti connettivi.

In questi ultimi casi è opportuno adottare dei fissativi non acquosi per il glicogeno o aggiungere alla soluzione di
fissativo degli agenti specifici che preservino la struttura delle molecole extracellulari contenenti carboidrati.

Le componenti solubili dei tessuti, gli ioni e le piccole molecole vengono ugualmente persi durante la
preparazione di sezioni da inclusioni in paraffina

Ioni come il sodio e il cloro, metaboliti, intermedi di vie biosintetiche, precursori di macromolecole come aminoacidi e
nucleotidi e il glucosio vengono persi durante la preparazione di sezioni ottenute da inclusioni in paraffina e colorate in
EE. La maggior parte di queste sostanze non forma alcuna struttura riconoscibile all'interno delle cellule, anche se esse
rappresentano i costituenti fondamentali dei processi sintetici e delle reazioni cellulari. In alcuni casi è possibile studiare
queste molecole in speciali preparati, anche se le tecniche impiegate comportano in genere una considerevole perdita
dell'integrità strutturale del tessuto. Il loro studio può fornire informazioni essenziali sul metabolismo cellulare, sul
trasporto attraverso le membrane cellulari e altri processi vitali delle cellule. L'acqua, che è una molecola estremamente
versatile, partecipa a tali reazioni e processi e contribuisce a stabilizzare queste strutture macromolecolari mediante
legami idrogeno.

Immunocitochimica

L'altissima specificità della reazione tra un antigene e un anticorpo è alla base dell'immunocitochimica

Gli anticorpi, o immunoglobuline, sono glicoproteine che vengono secrete da particolari cellule del sistema
immunitario e che hanno la capacità di riconoscere con estrema specificità una proteina, o meglio una porzione di una
proteina detta antigene. In laboratorio è possibile stimolare il sistema immunitario di un animale in modo che produca
anticorpi contro una determinata proteina che si vuole visualizzare. In seguito, una volta purificati gli anticorpi dal
sangue dell'animale, questi vengono coniugati chimicamente con un fluoroforo. Un fluoroforo è una molecola che
assorbe la luce a una data lunghezza d'onda (per esempio luce ultravioletta) ed è in grado di riemettere luce a un'altra
lunghezza d'onda visibile (per esempio verde, rossa o gialla). La fluoresceina, uno dei fluorofori storicamente più
utilizzati, assorbe nell'ultravioletto ed emette luce verde. Sezioni di tessuto sottoposto a blanda fissazione, ottenute al
criostato e distese su un vetrino, vengono incubate con gli anticorpi coniugati con fluoresceina; questo permette di
localizzare l'antigene riconosciuto dall'anticorpo all'interno del tessuto. Per poter osservare un'immunofluorescenza
(cioè una reazione immunocitochimica che utilizza anticorpi coniugati a fluorofori) è necessario utilizzare un
microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale. Questi strumenti permettono di determinare con estrema
precisione la localizzazione della proteina all' interno di una cellula, oppure di ricostruire la distribuzione
tridimensionale della proteina (▪Figura 1.4).
Spesso l’analisi in immunofluorescenza viene combinata con metodi citochimici basati sull'uso di coloranti fluorescenti
per poter meglio identificare le strutture cellulari in campo oscuro. I coloranti più utilizzati a questo scopo sono
molecole in grado di intercalarsi tra le basi del DNA, come l'Hoechst o il DAPI ( 4',6-diamidino-2-fenilindolo ), che
quando si intercalano sono in grado di assorbire luce ultravioletta ed emettere luce azzurra. Ciò permette di distinguere
il nucleo della cellula. Altri coloranti consentono di riconoscere, per esempio, i mitocondri, oppure i filamenti
citoscheletrici di actina (in quest'ultimo caso si sfrutta una proteina, la falloidina, che possiede un'alta affinità per
l'actina, coniugata direttamente con un fluoroforo). L'immunofluorescenza non si combina facilmente con una
colorazione istologica standard come l'EE. Ciò si deve al fatto che i metodi di fissazione che valgono in un caso, male si
adattano all'altro. Inoltre, l'inclusione in paraffina spesso causa un'autofluorescenza aspecifica dei tessuti, che maschera
i segnali specifici dati dagli anticorpi.

Figura 1.4 • Immagine al microscopio confocale


di una cellula muscolare cardiaca di ratto. Questa
immagine è stata ottenuta al microscopio confocale,
utilizzando un metodo di immunofluorescenza
indiretta. Sono stati impiegati due anticorpi primari
non coniugati, uno contro il trasportatore del lattato
(MCT1), l'altro contro la proteina di membrana
CD147, che è strettamente associata all'MCT1. Il
primo anticorpo è stato poi localizzato mediante un
anticorpo secondario coniugato con rodamina (un
fluoroforo che emette luce rossa), mentre il secondo
anticorpo è stato localizzato con un anticorpo
secondario coniugato con fluoresceina (in verde).
Siccome le due proteine sono strettamente
associate, i due anticorpi primari, e di conseguenza
anche i secondari, si colocalizzano all'interno della
cellula. La sovrapposizione della luce rossa e di
quella verde causata dalla colocalizzazione dei due
anticorpi appare come luce gialla. Nell'immagine le
due proteine si colocalizzano sulla superficie della
cellula (in giallo), mentre l'MCT1 è presente da solo
anche in strutture all'interno della cellula (in rosso).
(Per gentile concessione dei Dr.Andrew P. Halestrap
e Catherine Heddle.)
In immunoistochimica si usano due tipi di anticorpi: gli anticorpi policlonali, che sono una miscela di
anticorpi purificati dal siero di un animale immunizzato, e gli anticorpi monoclonali, che sono un
unico tipo di anticorpo prodotto da linee cellulari immortalizzate chiamate ibridami

Quando si vuole sviluppare un anticorpo contro una proteina, come per esempio lactina di ratto, generalmente si
purifica la proteina dai tessuti o dalle cellule di un ratto e la si inietta in un altro animale, per esempio un coniglio.
Nell'animale ricevente l'actina di ratto verrà riconosciuta dal sistema immunitario come una proteina esogena
(antigene), scatenando una reazione immunitaria. Durante la reazione immunitaria si attiva una cascata di interazioni
cellulari che porta all'attivazione di cloni di cellule del sistema immune, i linfociti B. Verranno attivati unicamente i
linfociti B che hanno la caratteristica di produrre anticorpi che reagiscono con l’actina di ratto. Nel loro insieme questi
sono detti anticorpi policlonali, perché rappresentano una miscela di anticorpi diversi che riconoscono porzioni diverse
dell’actina e che sono stati prodotti dai diversi cloni delle plasmacellule, derivanti dai linfociti B (vedi anche Capitolo
14). Questa miscela di anticorpi può essere purificata dal siero dell'animale coniugata a un fluoroforo e quindi utilizzata
per rivelare la presenza e la localizzazione dell'actina in cellule e tessuti di ratto.
Nel caso degli anticorpi monoclonali (■ Cartella 1.3), dopo aver immunizzato l'animale (di solito un topo, ma anche
un ratto o un coniglio), si estraggono dal tessuto linfatico (milza o linfonodi) i linfociti B attivati, che in vitro vengono
immortalizzati tramite fusione con una linea cellulare di mieloma (il mieloma multiplo è un tumore che deriva da una
singola plasmacellula). La linea selezionata, nello specifico, non produce anticorpi. Si ottengono così gli ibridomi,
linee cellulari immortalizzate, ognuna delle quali produce anticorpi di un'unica specificità, secreti nel mezzo di coltura.
Gli ibridomi vengono quindi selezionati per la reattività degli anticorpi prodotti contro l'antigene di interesse (per
esempio actina di ratto) e clonati. .Ogni clone produrrà grandi quantità di anticorpi identici della stessa specificità, potrà
essere congelato in azoto liquido e quindi rappresentare una riserva praticamente illimitata per la produzione di
anticorpi.

CARTELLA 1.3
Correlazioni cliniche - Uso degli anticorpi monoclonali in medicina
Gli anticorpi monoclonali sono oggi comunemente usati per tecniche di immunocitochimica, ma hanno anche grande rilevanza
nell' applicazione clinica. Anticorpi monoclonali coniugati con composti radioattivi vengono usati per localizzare e diagnosticare
alcuni tipi di metastasi, per differenziare i sottotipi e gli stadi di progressione delle neoplasie, per diagnosticare malattie infettive,
per identificare microrganismi e parassiti nel sangue e nei fluidi corporei. Recentemente gli anticorpi monoclonali hanno trovato
applicazione anche come agenti terapeutici, sia veicolando immunotossine, chemioterapici o radioisotopi alle cellule del tumore,
sia funzionando come veri e propri farmaci, data la capacità di bloccare l'attività di proteine extracellulari (anticorpi anti-VEGF) o
di recettori di membrana (anticorpi anti-HER2) che sono necessari alla cellula tumorale per sopravvivere.

I metodi di localizzazione di una proteina in un tessuto basati sull'uso di un anticorpo possono essere
diretti o indiretti

Per identificare un antigene in una cellula o in un tessuto, inizialmente si è utilizzata la tecnica


dell'immunofluorescenza diretta, basata sull'uso di un anticorpo primario (policlonale o monoclonale), coniugato
con il fluoroforo, che reagisce direttamente con l’antigene del tessuto (▪ Figura 1.5a). Siccome un anticorpo
normalmente reagisce con il suo antigene in maniera stechiometrica (1 molecola di anticorpo per 1 molecola di
antigene, cioè in rapporto 1:1), l’intensità del segnale fluorescente è piuttosto bassa.
Nel caso dell'immunofluorescenza indiretta (tecnica chiamata anche" sandwich"), si ha una sensibilità molto
maggiore, perché il segnale dell'anticorpo primario (nel nostro esempio, anticorpo monoclonale di topo contro actina di
ratto) viene amplificato usando un secondo anticorpo (anticorpo secondario policlonale) che riconosce in maniera
selettiva l'anticorpo primario (nel nostro esempio, anticorpo secondario di capra contro anticorpo di topo). In questo
caso il fluoroforo viene coniugato solo all'anticorpo secondario (▪ Figura 1.5b). Siccome diversi anticorpi secondari
possono reagire contemporaneamente con una stessa molecola di anticorpo primario, si ha un aumento dell'intensità del
segnale. Un secondo vantaggio della rivelazione indiretta sta nel fatto che un singolo anticorpo secondario (per
esempio, un anticorpo di capra che riconosca un qualunque anticorpo di topo) può essere usato per localizzare il legame
tessuto-specifico di differenti anticorpi primari (▪ Figura 1.6). Combinando anticorpi primari prodotti in specie differenti
con anticorpi secondari coniugati a fluorofori diversi, è anche possibile localizzare in contemporanea due proteine nello
stesso preparato (vedi Figura 1.4). Lo svantaggio dell'immunofluorescenza indiretta sta nel fatto che è costosa, laboriosa
e non facilmente adattabile a procedure automatiche, come invece avviene per l'immunoistochimica con HRP. Al
giorno d'oggi, per ragioni di sensibilità e di praticità, si utilizza quasi esclusivamente la seconda tecnica.
Gli anticorpi primari e secondari possono essere coniugati con altre sostanze che permettono di visualizzare dove
avviene il legame dell'anticorpo all'antigene in un tessuto. Nel caso della microscopia ottica tradizionale è possibile
coniugare gli anticorpi con enzimi (come la perossidasi di rafano o HRP), che convertono un substrato solubile e
incolore (cioè la DAB) in un prodotto insolubile e colorato, che precipita all'interno della sezione istologica dove
avviene la reazione enzimatica. La colorazione ottenuta con l'immunoperossidasi può essere osservata con il
microscopio a luce trasmessa tramite metodi di immunocitochimica diretti o indiretti (vedi Figura 1.3b); questo metodo
ha il vantaggio di essere applicabile a sezioni tagliate in paraffina e colorate con le classiche tecniche istochimiche. Per
tale ragione l'immunoperossidasi è la tecnica di elezione in anatomia patologica. Nel caso della microscopia elettronica,
invece, gli anticorpi vengono coniugati con dell'oro colloidale o della ferritina (una molecola contenente
ferro). Siccome queste molecole sono elettrondense, vengono facilmente visualizzate come dei puntini scuri di un
determinato diametro (dipendente dal tipo di metallo utilizzato).

Figura 1.5 • Immunofluorescenza diretta e indiretta. a. Nell'immunofluorescenza diretta un anticorpo primario


marcato con un fluorocromo reagisce direttamente con il proprio antigene, se e dove questo è presente nel campione.
Le strutture marcate vengono osservate al microscopio a fluorescenza, in cui una luce (generalmente nell'ultravioletto)
eccita il fluoroforo, in modo che quest'ultimo emetta una luce a una differente lunghezza d'onda (generalmente nel
visibile). La lunghezza d'onda di emissione dipende dal tipo di fluorocromo. b. Nell'immunofluorescenza indiretta si
usano invece due passaggi: nel primo, l'anticorpo primario non marcato interagisce con il proprio antigene; nel secondo,
un anticorpo secondario marcato con un fluorocromo reagisce con l'anticorpo primario. In entrambi i casi la
visualizzazione delle strutture marcate all'interno del tessuto avviene tramite osservazione al microscopio a
fluorescenza.

Figura 1.6 • Microtubuli visualizzati con metodo immunocitochimico. La foto mostra la distribuzione dei
microtubuli (elementi del citoscheletro) che originano dal centrosoma e si dirigono radialmente verso la periferia, in una
cellula di tumore della mammella. I microtubuli (in verde) sono stati rivelati usando anticorpi monoclonali primari anti-
tubulina-α e anti-tubulina-β e anticorpi secondari coniugati con fluoresceina (anti-immunoglobulina-G di topo prodotti
immunizzando una capra e coniugati con fluoresceina isotiocianato). L'incubazione con gli anticorpi è stata effettuata
direttamente sul vetrino e permette di contare nella cellula più di 120 microtubuli. Questi si originano dal centriolo e si
estendono radialmente in modo uniforme per circa 20-25 μm. 1400x. (Per gentile concessione dei Dr. Wilma L. Lingle e
Vivian A. Negron.)

Figura 1.3 • Procedure istochimiche in microscopia elettronica e ottica . a. Colorazione istochimica per la
localizzazione tramite TEM delle ATPasi di membrana in cellule epiteliali di cistifellea di coniglio. Le aree scure
visibili nella fotografia al microscopio elettronico indicano la localizzazione dell'enzima ATPasi. Questo enzima è
localizzato sulla membrana plasmatica delle cellule epiteliali, nei domini laterali, dove sono situate le pompe del
sodio. Queste cellule sono coinvolte nel trasporto attivo di ioni e molecole attraverso le membrane plasmatiche.
26000x. b. Colorazione istochimica per la localizzazione di macrofagi tramite microscopio ottico in campo chiaro.
La fotografia proviene da una sezione ottenuta da una inclusione in paraffina di un campione tessutale di rene di
topo affetto da patologia ipertensiva renale. La reazione istochimica, basata sull'uso di anticorpi coniugati con
perossidasi e DAB, rivela in marrone la presenza della proteina marcatore F4/80+, espressa in maniera specifica
sulla membrana plasmatica dei macrofagi. La sezione è stata incubata con un anticorpo primario contro la
proteina F4/80+ di topo ottenuto in ratto, e quindi con un anticorpo secondario contro le immunoglobuline lgG di
ratto ottenuto in capra e coniugato con l'enzima perossidasi. il campione è stato poi lavato e incubato con una
soluzione contenente la DAB. Nelle aree dove sono presenti i macrofagi, e quindi dove si localizza il complesso di
anticorpi e perossidasi, la DAB viene convertita per ossidazione dalla perossidasi in un precipitato di colore
marrone. Il campione è stato colorato anche con ematossilina per evidenziare i nuclei delle cellule. 400x. (Per
gentile concessione del Dr. Joseph P. Grande.)