23/10/2014 ACE

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ARTÍCULOS
CIENCIA Y TECNOLOGÍA CIENTÍFICOS
Nuevas tendencias para el desarrollo de la fermentación
maloláctica en vino con O. oeni
Carmen Berbegal, Olga Lucio, Lucía Polo y Sergi Ferrer
carmen.berbegal@uv.es
ENOLAB
Dep. de Microbiología y Ecología, Facultad de Biología
Universitat de València
Campus de Burjassot, Valencia

La fermentación maloláctica (FML) es un proceso que se puede dar de manera [30.04.12]

natural en los vinos una vez finalizada la fermentación alcohólica (FA), debido a la
presencia de bacterias lácticas (BAL). Estas bacterias transforman el ácido málico en
ácido láctico y la especie principalmente responsable de este proceso es Oenococcus
oeni [1] . El ácido láctico contiene sólo un grupo ácido, en lugar de dos del ácido
málico, proporcionando un gusto más agradable y suave, disminuyendo además la
acidez total del vino. Esta transformación se realiza mediante el enzima maloláctico
que contienen las BAL del vino [2] , y puede verse afectada por diferentes factores
que determinan el crecimiento de estas bacterias como la temperatura, el
contenido en sulfuroso libre, el grado alcohólico y el pH del vino. En estos últimos
años el cambio climático también se ha convertido en un factor de gran repercusión
en el proceso de la FML, ya que el incremento de las temperaturas ambientales en
nuestras latitudes, que afectan al ciclo vegetativo de la vid, conlleva un incremento
de azúcares en el mosto y vinos con mayor graduación alcohólica. Debido a esto, las
BAL como O. oeni tienen mayores dificultades para realizar la FML, por lo que se
requiere un mejor conocimiento de los mecanismos de adaptación de las BALa
estas condiciones estresantes [3] .

Por diversas causas, en los últimos años la industria enológica ha sufrido una
transformación importante, convirtiéndose en un sector de constantes cambios e
innovaciones. Las dificultades para llevar a cabo la FML han promovido el estudio y
desarrollo de diferentes tecnologías para llevar a cabo el proceso, desde las más
tradicionales, incluyendo el uso de cultivos iniciadores liofilizados, hasta las más
innovadoras, aún en desarrollo, como son los cultivos inmovilizados en distintos
soportes, pasando por la coinoculación de levadura-bacteria, de creciente aplicación
en la actualidad.

El proceso biotecnológico para llevar a cabo la FML de más amplia aplicación en

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enología es la inoculación de cultivos iniciadores seleccionados de O. oeni. En los

años noventa, se introdujeron en el mercado enológico estos productos para llevar
a cabo la FML, comenzando con algunos que necesitaban una fase de
acondicionamiento preliminar de las bacterias en la bodega antes de su utilización.
Posteriormente se desarrollaron los cultivos iniciadores con una única etapa de
adaptación, en los cuales el producto consta de bacterias seleccionadas liofilizadas,
ya pre-aclimatadas y por un activador. Después se desarrollaron los cultivos de
inoculación directa que se introdujeron en la industria a principios del año 2000. En
estos tan solo se necesita una simple rehidratación antes de la inoculación en el
vino, facilitando así su aplicación. Más recientemente, se ha diseñado una
estrategia para facilitar todavía más la labor del enólogo en el momento de la
inoculación del cultivo iniciador; son los cultivos líquidos de la especie O. oeni. Estos
cultivos no sufren el tratamiento de secado ni liofilización como ocurre con los
cultivos iniciadores tradicionales, garantizando un mayor número de células viables
activas desde el mismo momento de la inoculación. Por ello, este nuevo método
facilita la implantación del inóculo, se adelanta el inicio de la FML, y disminuye los
riesgos de alteraciones microbianas y las posibles pérdidas de los aromas.

Sin embargo, existen vinos en los que las condiciones que se dan tras la FA son
demasiado adversas para el desarrollo óptimo de O. oeni. La búsqueda de
alternativas a la FML tradicional tras la FA llevó al desarrollo de una nueva técnica:
la coinoculación levadura-bacteria maloláctica. Esta técnica está basada en la
inducción de la FML durante el transcurso de la FA, pudiendo inocularse las
bacterias en diferentes momentos de ésta. Los inicios de aplicación de esta técnica
estuvieron dominados por el miedo de la industria enológica, ya que se consideraba
que la adición de bacterias lácticas antes de la finalización de la FA entrañaba un
riesgo muy elevado, ya que durante este periodo las BAL podían consumir azúcares
y generar un picado tanto láctico como acético, debido al metabolismo
heterofermentativo de O. oeni.

En cambio, en la actualidad es una técnica de gran aplicación en la industria

enológica, demostrando la mejoría del proceso y desbancando los miedos iniciales
en el sector. Además, los trabajos realizados en investigación enológica hasta la
fecha muestran que la coinoculación aporta una serie de ventajas con respecto a la
inoculación secuencial, utilizada de forma tradicional. Por un lado, se obtiene una
buena implantación de la bacteria maloláctica, debido a que las condiciones del
mosto son más favorables para el desarrollo de la bacteria que las del vino, y las
bacterias tienen la oportunidad de aclimatarse progresivamente a las condiciones de
realización de la FML. Además, se mantiene controlada la población de
microorganismos durante la vinificación, sin dejar la etapa entre final de FA y
principio de FML sin población de bacterias seleccionadas, como ocurre
frecuentemente en la inoculación secuencial, evitando así el desarrollo de
microorganismos perjudiciales. La aplicación se puede realizar mediante la
inoculación de cultivos iniciadores mixtos, lo cual también facilita la manipulación
para el enólogo, ya que ambos microorganismos se inoculan al mismo tiempo. Esta
tecnología también proporciona al proceso de vinificación velocidad y seguridad,
llegando a término la FML entre 0 y 14 días después de la FA en condiciones
óptimas, pudiendo realizar un temprano sulfitado que puede realizarse después de
la FML, es decir, poco después del fin de la FA. Por tanto, el vino queda protegido en
poco tiempo frente a contaminaciones microbianas, sin necesidad de largos tiempos
de espera para la realización de la FML cuando ésta se realiza de forma secuencial.

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Contando pues con distintas técnicas, al enólogo se le abre un abanico de

posibilidades basándose en las características del vino a elaborar, pudiendo
determinar el momento de inoculación de las BAL. Si se opta por la coinoculación, la
inoculación de la bacteria maloláctica puede realizarse en dos momentos distintos
dependiendo de la situación enológica. En el caso de querer elaborar un vino de
rotación rápida (vino joven) o disponer de una FA bien controlada, se recomienda
realizar una coinoculación precoz, es decir, a las 24-48 horas del inicio de la FA,
mientras que si se trata de un vino con pH alto, alta carga microbiana u otras
condiciones fisicoquímicas desfavorables para la FML, se recomienda realizar una
inoculación tardía. También, el enólogo puede optar por una coinoculación
secuencial en los casos en que observen condiciones físico-químicas favorables para
la FML, condiciones para la FA arriesgadas, vino elaborado a partir de variedades con
color inestable o cuando vaya a realizar la FML en barrica sobre lías.

En cuanto al impacto que genera la coinoculación de BAL con levaduras en las

diferentes variables de la vinificación, numerosos trabajos mostraron que
Saccharomyces cerevisiae no resultaba afectada por la inoculación simultánea de
bacterias durante la FA, pudiendo acabar la fermentación al mismo tiempo que los
vinos tradicionales. Sin embargo, se observó que 20 días después de terminar la
FA/FML simultánea, no se detectaron ni glucosa ni fructosa con el protocolo de la
coinoculación, mientras que en la coinoculación secuencial, la glucosa y la fructosa
quedaban con una concentración residual conjunta de 700 mg/L [4-5] . La
coinoculación añade pues la ventaja de que la completa ausencia de estos dos
azúcares incrementa la estabilidad microbiológica del vino. Además, el tiempo en el
que se realiza la FML es mucho más corto cuando se utiliza la coinoculación que en
los vinos tradicionales. Esto implica otra importante ventaja porque el vino queda
terminado en un corto periodo de tiempo, con lo cual el está el mínimo tiempo
expuesto al posible desarrollo de microorganismos indeseables. Según Krieger et al.,
un vino realizado mediante coinoculación acabaría en torno 20-30 días mientras
que un vino tradicional tardaría 70-80 días [4] . Nehme et al. también demostraron
que la tasa de consumo del ácido málico durante el cocultivo es 2.82 veces más
rápida que en solitario y tras la FA, lo cual demuestra que esta estrategia resulta
más favorable para el metabolismo de la bacteria (fig. 1) [6] .

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Figura 1: Variación del consumo de ácido málico durante la coinoculación ■ y la inoculación

secuencial □.

En cuanto a variables como la acidez total, estudios realizados como los de López et
al. demostraron que ésta resulta mayor en vinos coinoculados, como consecuencia
de una menor disminución del ácido tartárico durante el proceso de elaboración [7] .
En vinos coinoculados, la intensidad de color fue significativamente menor debido a
una menor proporción de antocianos coloreados y a una menor polimerización. En
cambio, los vinos con inoculación secuencial mostraron mayor intensidad y
estabilidad del color[7] . En el análisis químico de la composición aromática se
comprobó que en los vinos elaborados mediante coinoculación tenían una mayor
concentración de acetato de etilo, alcoholes superiores, acetatos y ésteres, y menor
de acetoína y butirolactona, lo que suponía una mejora aromática y mayor carácter
afrutado [7] . Del mismo modo, se realizaron multitud de análisis organolépticos de
vinos coinoculados para comprobar su calidad final frente al consumidor. Los
expertos catadores destacaron que los vinos mejor valorados eran los elaborados
con coinoculación a las 12 horas de iniciar la FA, destacando los aromas afrutados y
varietales frente al carácter verde que predominaba en el testigo de la FML
espontánea. Se observó que cuanto más tardía era la coinoculación, más
destacaban las notas lácticas, incrementando también la estructura y el amargor a
medida que se retarda la inoculación [8] . En cambio, los resultados de López et al.
del análisis organoléptico mostraron una preferencia en la fase olfativa hacia los
vinos inoculados con bacteria en el mosto, pero una mejor valoración en la fase
gustativa en los inoculados al final de la FA, aunque en ambos casos se englobaron
en la categoría “Bien” [7] .

Para ofrecer un mayor abanico de posibilidades al sector enológico y continuar

mejorando el difícil proceso de la FML se siguen desarrollando otras técnicas
alternativas para la inducción de ésta. Nuevas tendencias apuntan al uso de
cultivos iniciadores de BAL inmovilizadas. Esta tecnología proporciona numerosas
ventajas en comparación con la utilización de células libres, ya que el soporte de
inmovilización actúa como un agente de protección contra los efectos fisicoquímicos
del pH, la temperatura, solventes o incluso metales pesados, prolongando así la
actividad y estabilidad celular. La alta concentración de bacterias de estos sistemas
permite tiempos de fermentación más cortos, la eliminación de la fase de

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crecimiento y procesos en continuo. Del mismo modo, facilita la fermentación a

bajas temperaturas, aumentando la calidad del vino, permite una fácil
recuperación, regeneración y reutilización del producto inmovilizado y reduce el
riesgo de contaminaciones microbianas debido a las altas densidades celulares
iniciales [9] .

Prueba de ello son los numerosos trabajos que se han realizado con el fin de
inmovilizar bacterias lácticas en diferentes soportes desde los años 80 y los trabajos
de revisión realizados hasta la fecha [9-11] . Ejemplo de estos ensayos son los
trabajos de Rossi y Clementi [12] , que estudiaron el catabolismo del ácido málico de
O. oeni inmovilizado en gel de poliacrilamida. En este caso, las propiedades de las
células inmovilizadas eran similares a las de las células libres pero el cultivo
inmovilizado era más fácil de recuperar y volver a utilizar. Otros materiales de
inmovilización para O. oeni con mejores perspectivas para su utilización a nivel
industrial estudiados fueron k-carregan [13-14] y gel de alginato cálcico [15] . Más
tarde se trabajó con poliacrilamida, silicagel, quitosan y virutas de madera para la
inmovilización de Lactobacillus con resultados satisfactorios [16-17] . La
inmovilización de L. casei en gel de Ca-pectato y quitosan modificado químicamente
para la realización de la FML en vino, mostró que la tasa de degradación de ácido
málico por parte de las células inmovilizadas fue dos veces superior al de las células
libres. Maicas et al. [18] estudiaron la posibilidad de emplear células de O. oeni
inmovilizadas en una esponja de celulosa cargada positivamente para la realización
de la FML en vino. Los efectos de la carga de la superficie del material de
inmovilización, el pH y la composición de medio fueron evaluados, lográndose tasas
de degradación del ácido málico 3-4 veces mayores que con células libres.
Aougurdis et al. [19] inmovilizaron células de O. oeni en material celulósico
deslignificado, además evaluaron su estabilidad en repetidas FML y la formación de
productos volátiles en comparación con los resultados obtenidos al inmovilizar L.
casei en un estudio anterior[20] . Los datos mostraron que el material celulósico era
un buen soporte para la inmovilización de O. oeni. Se comprobó también su
estabilidad con la repetición de once fermentaciones durante un mes y se observó
la formación de productos volátiles en concentraciones aceptables.

Recientemente se han realizado ensayos utilizando la combinación de diferentes

materiales para la inmovilización. Ejemplo de ello, son los trabajos de Callone et al.
[21] ,
quienes estudiaron la inmovilización de levaduras y bacterias en microesferas
de alginato cubiertas de una capa de sílice. Esta capa de sílice se obtuvo por tres
metodologías diferentes con el objetivo de estudiar las diferencias en el intercambio
de masa a través de esta capa y el mantenimiento de la viabilidad de las células.
Los resultados confirmaron la eficacia de la inmovilización de las células en esta
matriz de doble capa y que el recubrimiento de sílice mejoraba la estabilidad
mecánica y reducía la fuga de células.

La biotecnología sigue aportando nuevas herramientas para abordar las actuales

condiciones de vinificación. Como muestra la literatura, existen distintas
posibilidades para facilitar la FML en bodega, mejorando la implantación de la
bacteria, la rapidez y efectividad del proceso, el perfil aromático del vino, la
seguridad microbiológica y la facilidad de uso por parte del enólogo. No obstante, se
debe seguir investigando y mejorando las distintas tecnologías y dirigir los esfuerzos
hacia aquellas que permitan en definitiva la mejora del perfil aromático y gustativo

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del vino, asegurando la calidad del producto final.

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