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Tesina Sistemi di Controllo per la Bioingegneria

Sara Maria Brancato Matricola: M54859


10 luglio 2019

1 Genetic Toggle Switch


I network di regolazione genica rappresentano un nuovo campo di ricerca dall’alto po-
tenziale nella medicina; essi si basano sulla comprensione, sintesi e controllo di processi
biologici che avvengono per mezzo dell’espressione di uno o più geni che si reprimono
o attivano tra di loro. Tuttavia, solo un piccolo numero di circuiti genetici è stato
testato, sia per la difficoltà di interagire con le cellule e con sistemi più complessi, sia
per la natura stocastica dell’espressione genica, sia per la difficoltà nel modellare la
loro dinamica. Solitamente il controllo viene fatto per mantenere l’espressione di un
gene costante entro un certo intervallo di tempo, controllando la differenza di un livello
di riferimento e la concentrazione del gene misurata attraverso la fluorescenza. Oltre
la regolazione genica, è di grande interesse il mantenimento di un circuito genetico
bistabile in uno stato di equilibrio instabile; esso rappresenta una sfida del controllo
simile a quella del pendolo inverso, ed dimostrerebbe il potenziale della cybergenetica
nella comprensione del destino cellulare e del loro differenziamento.
In quest’ottica si colloca il Toggle Switch basato su LacI e TetR, studiato per la prima
volta da Garden and Collins [1] e il cui controllo è stato ulteriormente studiato negli
ultimi anni. [3][2]

1.1 Descrizione
Il circuito è composto da due geni (LacI e TetR), la cui espressione reprime la tra-
scrizione dell’altro. La repressione dei promotori di LacI e TetR può essere regolata
aggiungendo molecole diffusive quali, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) e
anhydrotetracycline (aTc), rispettivamente.
Dalle pseudo reazioni (vedi Appedice) si deriva il seguente modello matematico:

dmRN ALacI kLm


= kLm0 +  ηLacI − gLm · mRN ALacI (1)
dt T etR 1
1+ θT etR
· 1+(aT c/θaT c )ηaT c

dmRN AT etR kTm


= kTm0 +  ηLacI − gTm · mRN AT etR (2)
dt LacI 1
1+ θLacI
· 1+(IP T G/θIP T G )ηIP T G

1
dLacI
= kLp · mRN ALacI − gLp · LacI (3)
dt
dT etR
= kTp · mRN AT etR − gTp · T etR (4)
dt
m0 m p m p
I parametri kL/T ,kL/T ,kL/T , gL/T ,gL/T rappresentano rispettivamente il tasso di tra-
scrizione stocastica e il tasso di trascrizione per attivazione dei promotori, tasso di
traduzione, tasso di degradazione dell’mRNA e tasso di degradazione delle proteine
(espressi in min− 1).
La repressione che un gene ha sull’altro e l’ IPTG/aTc sul LacI/tetR ha un compor-
tamento descritto dalla funzione di Hill : h− (x, θ, η) = (1+(x/θ)
1
η ) , con θ valore di soglia

per cui c’è la repressione e η (detto coefficiente di Hill) che rappresenta la cooperatività
che c’è tra le molecole.

Le variabili di stato sono le concentrazioni di mRNA trascritto e la concentrazione


di proteine tradotte, sia di LacI che di TetR. Lo switch dello stato finale può essere con-
trollato attraverso gli induttori IPTG e aTc. Per semplicità si sceglierà come induttore
da controllare il solo aTc, che sarà l’ingresso di controllo del sistema.

1.2 Modello quasi-steady adimensionale [3]


Assumendo che la concentrazione delle molecole di mRNA raggiunge lo steady sta-
te più velocemente delle corrispettive proteine, che le proteine Lacl e TetR degradano
con la stessa velocità, allora gLp = gLp = g p ed usando le seguenti variabili adimensionali:

t0 = gp t x1 = LacI
θLacI
x2 = T etR
θT etR
u1 = aT c
θaT c
u2 = IP T G
θIP T G

si ottiene il modello adimensionale :


dx1 k1m
= k10 + 2 − x1 (5)
dt

x2
1+ 1+u21

dx2 k2m
= k20 + 2 − x2 (6)
dt

x1
1+ 1+u22

k0 kp 0 kp
kT m kp
kL m kp
kT
avendo posto k10 = gm θLLacI
L
gp
k20 = mθ
gT
T
T etR g
p k1 = mθ
gL
L
LacI g
p k2 = mθ
gT
T
T etR g
p e scelto
L
ηLacI = ηT etR = ηIP T G = etaaT c = 2

2 Analisi
2.1 Ciclo Aperto
Una prima analisi del sistema 5-6 è stata condotta implementando il sistema in Matlab,
con valori dei parametri come in Tabella 1. Si è simulata la risposta al gradino per
diversi valori di IPTG e aTc, e visualizzando l’andamento di x1 , x2 (variabili di stato
del sistema) nel tempo, con condizioni iniziali di x1 = 23,48, x2 =10 (corrispondente

2
Parametri Unità Valore
kLm0 mRN A min−1 3.20e-2
kTm0 mRN A min−1 1.19e-1
kLm mRN A min−1 8.30
kLm mRN A min−1 2.06
kLm a.u. mRN A−1 min−1 9.726e-1
kTm a.u. mRN A−1 min−1 1.170
gLm min−1 1.386e-1
gTm min−1 1.386e-1
gLp = gTp = g p min−1 1.65e-1
ηLacI = ηT etR = ηIP T G = ηaT c adim 2.00
θLacl a.u. 31.94
θT etR a.u. 30.00
θaT c ng.L−1 11.65
θIP T G mM 9.06e-2

Tabella 1: Tabella 1 supplementare di [2]

(a) (b)

(c) (d)

Figura 1: a)IPTG = 0 e aTc = 0, prevale LacI, b))IPTG = 0 e aTc = 100ng/ml, prevale


LacI,c) IPTG = 1mM e aTc = 0, prevale TetR, d) IPTG = 1mM e aTc = 20 ng/mL,
prevale TetR

3
Figura 2: Intersezione delle zerocline in tre punti, due nodi stabili e un punto di sella

a 700 a.u.1 e 300 a.u. rispettivamente). Il sistema può evolvere in uno dei due di
equilibrio, in cui solo uno dei due geni è espresso completamente, (Fig. 1 )

2.2 Piano delle fasi


L’analisi nel piano delle fasi è stata condotta con pplane8. Il sistema mostra tre punti
di equilibrio, due stabili in (80,2), (1,35) e uno instabile in (16,9) (come in Fig. 2).
Si è proceduto alla linearizzazione nel punto di sella, ottenendo lo Jacobiano usato
per l’analisi e la sintesi successiva. Per semplicità si è scelto di ridurre il sistema da
MIMO a SISO, scegliendo come un ingresso di controllo (aTc) e uscita di controllo la
concentrazione di LacI, ottenendo il seguente sistema.2
 ! !

ẋ = −1 −2.8575 0.0612
x+ u

−0.7209 −1 0 (7)
  
y = 1 0 x

(Vedi Appendice Fig. 7 per differenza tra piano delle fasi e la versione linearizzata )

2.3 Stabilità,Controllabilità,Osservabilità
Il sistema nel punto di equilibrio scelto è instabile, poichè mostra un autovalore positivo
e uno negativo (0.4353, -2.4353).
La matrice di controllabilità risulta:
 
0.0612 0
W = (8)
0 1.0852
1
unità arbitraria di fluorescenza
2
La linearizzazione è stata fatta nel punto in cui LacI è 16 e TetR è 9, per valori di IPTG = 1 mM
ng
e aTc = 20 mL .

4
Figura 3: Schem del controllo SFC + AI, implementato in Simulink

il cui rango è massimo (ρW = 2), perciò il sistema è controllabile


La matrice di osservabilità risulta:
 
1 0
O= (9)
−1 −28575
il cui rango è massimo (ρO = 2), perciò il sistema è osservabile. Essendo gli au-
tovalori della matrice dello Jacobiano non puramente immaginari, il sistema non è
positivamente controllabile.

3 Sintesi
3.1 Specifiche
Si vuole provare a controllare il sistema linearizzato, in modo da garantire un anda-
mento di LacI il più vicino possibile al valore di 511 a.u. (16 unità adimensionale) in
un tempo inferiore a 25 min. Ovvero in altri termini bisogna garantire:
i. per un riferimento r1 (t) = 16(t), errore il più piccolo possibilie
ii. tempo di assestamento inferiore a 25min.3
iii. smorzamento 0.4

3.2 StateFeedback Control


Si è realizzato un controllo retroazionato di stato con azione integrale (Fig. 3), sce-
gliendo autovalori -2± j4.58 e -1, procedendo al calcolo dei coefficienti K, Ki in matlab
3
Il tempo di assestamento per il sistema adimensionale è t0a = gp ta = 4.125.

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Figura 4: Schema del controllo bang bang , implementato in Simulink

tramite il comando place . Un primo tentativo ha portato a un’azione di controllo con


valori negativi, assurdo per il modello preso in considerazione. Per ovviare a questa
problematica si è introdotto un blocco di saturazione per imporre un limite inferiore e
superiore all’ingresso. Si è ottenuto un’azione di controllo simile ad un controllore bang
bang e un andamento di LacI come in figura. In oltre è stata valutata l’introduzione
di un’azione Feed Foward per regolare il valore a regime ma questo rendeva controllo
vano.

3.3 Dominio della Frequenza


Si è risalito alla funzione di trasferimento che caratterizzano il sistema, nonostante
i vari tentativi non è stato possibile sintetizzare un controllore soddisfacente avente
significato fisico.

3.4 BangBang
Data l’estrema somiglianza del controllore SFC ad un controllo a relè si è proceduto
alla sintesi di un controllore di questo tipo scegliendo come limite inferiore 0, limite
ng
superiore 20 mL ,inf = 0,sup = 0.1 , (Fig. 4).

4 Confronto
I due controllori sintetizzati cercano di soddisfare le specifiche controllando la con-
centrazione di LacI il più vicino possibile al riferimento. In entrambi i casi ci si può
ritenere soddisfatti, considerando l’andamento della concentrazione di LacI in figura
Fig.5.In figura Fig. 6 è possibile apprezzare il confronto tra le azioni di controllo b)

6
Figura 5: Risposta al gradino del sistema linearizzato, ciclo aperto

(a)
(b)

(d)
(c)

Figura 6: a) andamento Lac per l’SFC, b) andamento aTc per l’SFC, c) andamento
Lac per il relè, d) andamento aTc per il relè

e d), preferendo quella del relè che è di più facile realizzabilità. Molteplici tentativi
sono stati fatti per controllare il sistema per valori di riferimento maggiore di 16, senza

7
riuscirci, probabilmente la saturazione forzata degli ingressi e il punto in cui è stata
fatta la linearizzazione limita i valori raggiungibili dalla concentrazione di LacI. Per
questa ragione è stato difficile condurre un’analisi riguardante la reiezione di disturbi.

5 Appendice
Le pseudo-reazioni che descrivono il comportamento dell’espressione genica sono le se-
guente e rappresentano:

la trascrizione dei geni


f m (T etR,aT c)
L T f m (LacI,IP GT )
∅ −−−−−−−−→ mRN AL e ∅ −− −−−−−−−→ mRN AT

la traduzione proteica

L kp T kp
mRN AL −→ mRN AL + LacI e mRN AT −→ mRN AT + T etR

la degradazione nel tempo

L gm T gm L Tgp gp
mRN AL −→ ∅ e mRN AT −→ ∅ e LacI −→ ∅ e T etR −→ ∅

Le funzioni fLm (T etR, aT c) = kLm0 + kLm · h− (T etR · h− (aT c, θaT c , ηaT c ), θT etR , ηT etR ) e
fTm (Lac, IP T G) = kTm0 +kTm ·h− (LacI ·h− (IP T G, θIP T G , ηIP T G ), θLacI , ηLacI ) descrivono
come i geni vengono regolati dall’espressione delle proteine opposte e dai corrispettivi
induttori. h− (x, θ, η) = (1+(x/θ)
1
η ) è la funzione di Hill, che descrive in che modo avviene

la repressione delle proteine, con θ valore di soglia per cui c’è la repressione e η (detto
coefficiente di Hill) che rappresenta la cooperatività che c’è tra le molecole.

(a) (b)

Figura 7: a) traiettorie sistema non linearizzato b) traiettorie sistema linearizzato

8
Riferimenti bibliografici
[1] T. S. Gardner, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Construction of a genetic toggle
switch in escherichia coli,” Nature, 2000.

[2] J. baptiste Lugagne, “Balancing a genetic toggle switch by real-time feedback


control and periodic forcing,” Nature Communications, 2017.

[3] D. Fiore, A. Guarino, and M. D. Bernardo, “Analysisi and control of genetic toggle
switches subject to periodic multi-input stimulation,” 2018.