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FURIN ALL'AVANGUARDIA: DAL TRAFFICO PROTEICO

ALL'EMBRIOGENESI E ALLA MALATTIA


ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1964754

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La furina catalizza una semplice reazione biochimica: la maturazione
proteolitica dei substrati di proprietà nella via secretoria. Ma la semplicità
di questa reazione smentisce i ruoli ampi e importanti della furina
nell'omeostasi, così come nelle malattie che vanno dalla malattia di
Alzheimer e dal cancro all'antrace e alla febbre di Ebola. Questa
recensione riassume le varie caratteristiche della furina: le sue proprietà
strutturali ed enzimatiche, la localizzazione intracellulare, il traffico, i
substrati e i ruoli in vivo .

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Struttura del dominio


La furina è una proteina transmembrana di tipo I espressa in modo
ubiquitario 794 che si trova in tutti i vertebrati e in molti invertebrati 1 , 2 .
La sua grande regione lumenale / extracellulare ha un'omologia generale
con le stesse regioni di altri membri della famiglia della proproteina
convertasi (PC) ( ; ), che appartiene alla superfamiglia di subtilisina delle
endoproteasi serine. La somiglianza della sequenza maggiore risiede nel
dominio catalitico simile alla subtilisina; i residui di aspartato (Asp),
istidina (His) e serina (Ser) che formano la triade cataliticasono
rigorosamente conservati e i domini catalitici degli altri PC sono identici in
sequenza dal 54 al 70% alla furina. Oltre al peptide di segnale, che dirige la
traslocazione del pro-enzima nel reticolo endoplasmatico (ER), la furina e
gli altri PC contengono prodomain che sono fiancheggiati dal sito di
scissione peptidasi del segnale sul lato ammino-terminale e da un set
conservato di aminoacidi basici che comprendono il sito di scissione
autoproteolitica sul lato carbossi-terminale. Questo prodomain essenziale
ha un ruolo cruciale nella piegatura, attivazione e trasporto dei PC e nella
regolazione dell'attività dei PC. Furin e gli altri PC condividono anche un
dominio P conservato, che è essenziale per l'attività degli enzimi e la
modulazione del fabbisogno di pH e calcio 3; questo dominio P è assente
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dai relativi enzimi batterici. Il Furin controlli dominio citoplasmatico la
localizzazione e lo smistamento di Furin nel trans rete -Golgi (TGN) /
Sistema endosomal, e Furin è un modello importante per comprendere la
regolazione del traffico di proteine nelle cellule di mammifero.

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Diagramma schematico della famiglia della proproteina convertasi
(PC). Sono mostrati gli schemi per furin e gli altri sei PC. Sono anche
mostrati gli schemi del lievito Kex2 e la subtilisina batterica
evolutivamente correlata (che manca del dominio P conservato). PC5 / 6 è
espresso come isoforma A o B. Queste isoforme sono generate da
giunzioni alternative e la linea tratteggiata diagonale collega le due metà
di PC5 / 6B. L'isoforma PC5 / 6B contiene tutto il PC5 / 6A ad eccezione di
una piccola parte del suo terminale carbossilico che viene posizionato
dopo il sito di giunzione. Le etichette in grassetto D, H e S evidenziano i
residui del sito attivo, mentre le etichette non in grassetto N e D
evidenziano i residui del foro di ossianione.

Tabella 1
La famiglia di convertasi proprotein

Proproteina Dimensione Distribuzione Localizzazione


convertasi (aminoacidi) dei tessuti subcellulare Fenotipo knockout

Furin 794 ampio TGN / Letalità embrionale


endosomiale (giorno 10,5), alterazione
della rotazione assiale

PC7 785 ampio TGN / vitale; la misexpression


endosomiale causa difetti timici

PC5 / 6A * 915 ampio Granuli ND


secretori

PC5 / 6B * 1877 ampio TGN / ND


endosomiale

PACE4 963 ampio TGN / Letalità embrionale


endosomiale (giorno 15.5), difetti
craniofacciali e del SNC

PC1 / 3 753 Sistema Granuli Topo: gravi difetti di


neuroendocrino secretori crescita, elaborazione
difettosa di GHRH e
POMC,
iperproinsulinaemia

‡ Umani: grave obesità


precoce, insufficienza
surrenalica,
iperproinsulinaemia

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Proproteina Dimensione Distribuzione Localizzazione
convertasi (aminoacidi) dei tessuti subcellulare Fenotipo knockout

PC2 638 Sistema Granuli Ipoglicemia,


neuroendocrino secretori proinsulinaemia, carenza
di glucagone, difetti
nell'elaborazione del
peptide oppioide

PC4 655 Cellule ND Maschi: infertilità


germinali
testicolari e
ovariche

Femmine: lieve infertilità

Requisiti di pH e ioni
La furina ha un ampio pH ottimale; ha oltre il 50% della sua attività
enzimatica tra pH 5 e 8, a seconda del substrato da scissione. Come altri
membri della superfamiglia di subtilisina, la furina è strettamente
dipendente dal calcio, che richiede circa 1 mM di calcio per la piena
attività. Studi di modellizzazione basati sull'allineamento della furina con
la struttura risolta della termitasi batterica - una subtilisina ben
caratterizzata che condivide l'identità della sequenza del 29% con il
dominio catalitico della furina - indicano che la furina ha due tasche
leganti il ​calcio: una con affinità media e una con alta affinità 4 . Anche la
furina si lega debolmente al potassio e il 20 mM di potassio aumenta
l'attività della furina aumentando il tasso di deacilazione, che è
importante nel ciclo catalitico della furina 5 .

PROTEINE DI TRANSMEMBRANE DI TIPO I


Proteine ​che contengono un singolo dominio di estensione della
membrana, con il terminale carbossilico orientato verso il citoplasma e
l'ammino-terminale orientato verso il lume dei compartimenti di
membrana o extracellulare.

CONVERTENZA DI PROPROTEINE
Membri della famiglia delle endoproteasi serine dipendenti dal calcio,
simili alla subtilisina che sono strutturalmente correlate a Kex2 e furina e
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che fendono i substrati di proproteina sul lato carbossi-terminale di
doppietti o cluster di amminoacidi di base.

FEROMONE A-MATING
Un feromone peptidico secreto dalle cellule alfa del lievito per stimolare
l'accoppiamento con le cellule A del lievito. Il feromone di accoppiamento
α viene sintetizzato come substrato di proproteina che viene tagliato da
Kex2. Le cellule alfa del lievito prive di Kex2 sono sterili.

Sito di scissione del consenso


Il sito di consenso che la furina si divide, che è posizionato dopo il residuo
carbossilico-terminale di arginina (Arg) nella sequenza –Arg – X – Lys / Arg
– Arg ↓ - (dove Lys è lisina, X è qualsiasi amminoacido e ↓ identifica il sito
di scissione), è stato determinato biochimicamente usando due substrati
di furina in vivo in buona fede - l'antigene protettivo di tossina antrace (PA)
e l'emagglutinina del virus dell'influenza aviaria (HA) 6 , 7 . Poiché la tossina
antrace PA e l'HA del virus dell'influenza sono divisi sulla superficie
cellulare e nel percorso TGN / biosintetico, rispettivamente, questi studi
hanno fornito la prima indicazione che la furina è attiva in diversi
compartimenti cellulari ed è un enzima chiave nell'attivazione di diversi
agenti patogeni ( ). I residui di Arg nelle posizioni p 1 e p 4 in questo sito di
scissione sono essenziali, mentre l'amminoacido basico P2 (Lys / Arg) non
lo è, ma può migliorare notevolmente l'efficienza di elaborazione.
Pertanto, –Arg – X – X – Arg ↓ - rappresenta il sito minimo di scissione
della furina, sebbene i residui favorevoli in P2 e P6 possano compensare
quelli meno favorevoli in posizione P4 ( rif . 8 ). Di conseguenza, in casi
eccezionali, –Lys / Arg – X – X – X – Lys / Arg – Arg ↓ - può essere suddiviso
per furina.

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Scomparti di lavorazione della furina della rete trans- Gelol (TGN) /
sistema endosomiale. Allo stato stazionario, la furina (rappresentata
dalle forbici) è localizzata principalmente nel TGN, dove scorre tra questo
compartimento di smistamento, la superficie cellulare e gli endosomi
precoci. Nella via TGN / biosintetica, la furina taglia molti substrati tra cui il
fattore di crescita del nervo pro-β (pro-β-NGF), la proteina morfogenetica
pro-osso 4 (pro-BMP-4), il recettore dell'insulina e Ebola Zaire pro-
glicoproteina (pro-GP). Sulla superficie cellulare, la furina fende substrati
come l'antigene protettivo di antrace (PA), la proaerolisina e la α-tossina di
Clostridium septicum . Negli endosomi precoci leggermente acidi (via
endocitica), la furina scinde i substrati tra cui le tossine difterite, la tossina
shiga e la tossina shiga-1, eEsotossina pseudomonas A. Vedi il testo per
maggiori dettagli.

Come descritto di seguito, le varie permutazioni del sito di scissione della


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furina per consenso hanno importanti implicazioni per il substrato della
proproteina, sia in termini di specificità compartimentale sia in ordine
sequenziale degli eventi di scissione della furina. Un modello del dominio
catalitico della furina, basato sulle strutture delle subtilisine batteriche
BPN 'e della termitasi, prevede che i residui caricati negativamente nei
sottositi S1, S2 e S4 della tasca legante potrebbero interagire con gli
aminoacidi di base nel substrato 4 , 9 . La mancanza di una struttura
tridimensionale di furina, tuttavia, preclude qualsiasi certezza sul
substrato e sui siti di legame del cofattore.

inibitori
I requisiti del sito di scissione di Furin sono stati utilizzati per produrre
potenti inibitori a base di peptidi e proteine ​che bloccano l'attività della
furina in vitro e in vivo 10 - 12 . Forse i due inibitori della furina più utilizzati
sono l'inibitore peptidilico stechiometrico decanoile – Arg – Val – Lys – Arg
– CH 2 Cl (dove Val è valina) e α 1 -antitrypsin Portland (α 1 -PDX), una
variante bioingegnerizzata di α1 - antitrypsin . Decanoyl – Arg – Val – Lys –
Arg – CH 2 Cl inibisce tutti i PC con un K i nanomolare basso ( rif . 13),
sebbene le proprietà alchilanti del gruppo reattivo limitino l'utilità di
questo reagente. Tuttavia, negli studi di colture cellulari, il decanoile – Arg
– Val – Lys – Arg – CH 2 Cl blocca l'elaborazione di diversi substrati di
furina. L' inibitore α 1 -PDX è stato generato mutando l'ansa del sito
reattivo dell'α 1 -antitripsina per contenere la sequenza minima di
consenso per la scissione della furina (–Arg – Ile – Pro – Arg–) 14 (dove Ile è
isoleucina e Pro è prolina ) ed è altamente selettivo per la furina in vitro ( K
13 .
i = 600 pM), sebbene a concentrazioni più elevate inibirà anche altri PC
In studi biochimici, cellulari e animali, α 1-PDX è stato usato per bloccare
l'attività della furina e prevenire la produzione di virus patogeni,
attivazione di tossine batteriche e metastasi da cancro 10 (vedi sotto).

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Il prodomain di furina 83-amminoacido funge da propeptide chaperone
intramolecolare che guida il ripiegamento e l'attivazione dell'endoproteasi
15 . Il ripiegamento del centro catalitico della furina nella sua corretta

conformazione è guidato da una coppia multipla di fenditure specifiche


del compartimento nel prodomain, che producono l'enzima attivo ( ). Per
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svolgere questo compito, Furin sfrutta le proprie regole sul sito di
scissione e taglia due volte il prodomain. Il primo, e più rapido, taglio (t ½
= 10 minuti) avviene nell'ambiente a pH neutro dell'ER dopo Arg107 nel
sito di scissione della furina di consenso (–Arg – Thr – Lys – Arg 107 ↓ -
(dove Thr è treonina )), che si trova al confine del dominio catalitico. Il
secondo, più lento, taglia (t ½<2 ore) viene prodotto dopo Arg75 del sito di
scissione del propeptide furinico sensibile al pH nel prodomain (–Arg 70 –
Gly – Val – Thr – Lys – Arg 75 ↓ - (dove Gly è glicina)) durante il traffico del
propeptide– complesso furinico all'interno del sistema TGN / endosomiale
leggermente acido. La sensibilità al pH del sito di scissione del propeptide
interno della furina è nuovamente dimostrata dalle condizioni
leggermente acide necessarie per la scissione della proalbumina e
dell'esotossina A di Pseudomonas in simili siti di furina 10 ( ; vedere anche
di seguito).

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Il percorso di autoattivazione della furina. Dopo la traslocazione e la
rimozione della sequenza del segnale, il prodomain della furina funge da
chaperone intramolecolare (IMC) per facilitare il ripiegamento del dominio
catalitico non strutturato, inattivo (cerchio rosa) nella conformazione
attiva (ovale rosso). Dopo gli eventi di piegamento del reticolo
endoplasmatico iniziale (ER), la furina viene sottoposta ad escissione
intramolecolare autoproteolitica del propeptide ad Arg107. Il propeptide,
tuttavia, rimane associato al dominio maturo e funziona come un potente
autoinibitore nel trans durante il trasporto verso la via secretoria tardiva.
L'escissione del propeptide può essere bloccata inattivando la furina e
provoca l'accumulo di un intermedio pieghevole apparente nel
compartimento intermedio ER-Golgi (ERGIC) / cisRete -Golgi. Questi dati
indicano che entrambi i comparti ER ed ERGIC partecipano alle fasi iniziali
dell'attivazione della furina. A seguito dell'escissione del propeptide, il
complesso del propeptide inattivo passa agli scomparti tardivi della
secrezione - rete trans- glicol (TGN) / endosomi - dove il pH relativamente
acido promuove la scissione autoproteolitica e intramolecolare del
propeptide in un secondo sito interno (Arg75). La scissione Arg75 è
seguita dalla rapida dissociazione dei frammenti di propeptide e dalla
disinibizione della furina. Adattato con il permesso di rif . 15 . © (2002)
American Society for Biochemistry and Molecular Biology.

SOTTOTILISINA SUPERFAMILIARE
Le proteasi seriniche sono composte dalle superfamiglie di subtilisina e
chimotripsina (tra cui tripsina, trombina ed elastasi). Sorprendentemente,
le due superfamiglie sono evolutivamente distinte, ma gli atomi che
formano il centro catalitico si trovano in posizioni quasi identiche, un
notevole esempio di evoluzione convergente.

TRIAD CATALITICO
Nelle endoproteasi serine, la triade catalitica comprende i tre residui del
sito attivo spazialmente ottimizzati - serina, istidina e aspartato - che
cospirano per determinare l'idrolisi del legame peptidico.

THERMITASE BATTERICO

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Una subtilisina batterica termostabile con una struttura cristallina risolta.

P1 E P4
Una nomenclatura ampiamente utilizzata che identifica i residui di
aminoacidi che fiancheggiano il sito di scissione (legame a forbice) nei
substrati proteici e peptidici. L'amminoacido che è ammino-terminale per
il legame a forbice è designato P1. P2 è l'amminoacido che è ammino-
terminale di P1. Quindi, P4 è l'amminoacido che è quattro residui sul lato
ammino-terminale del legame scissile. Gli amminoacidi che sono carbossi-
terminali al legame scissile sono etichettati P1 ′, P2 ′ e così via.

α1 antitripsina
L'inibitore proteico circolante dell'elastasi neutrofila. Inibisce le proteasi
seriniche agendo come inibitore a legame stretto lento o substrato
suicida. Gli inibitori che usano questo tipo di meccanismo sono chiamati
serpini. Il sito reattivo, che attira la proteasi, può essere progettato per
colpire proteasi specifiche.

Ki
La costante inibitrice che descrive la dissociazione di un complesso
enzimatico (E) -inibitore (I), K i = [E] [I] / [EI].

JUXTACRINE VERSUS PARACRINE


Juxtacrine è la comunicazione tra cellule adiacenti, mentre la paracrina è
comunicazione tra cellule che sono più distanti.

La furina mostra pathway attivazione conservazione evolutiva con le vie di


attivazione di subtilisina batterica e proteasi alfa-litica che utilizzano i loro
siti propeptide escissione per guidare la piegatura del centro catalitico,
che si traduce in una riorganizzazione strutturale del ripiegata pro-enzima
16 - 19
. Il metodo "misura una volta, due volte" di Furin sembra anche
essere un modello biochimico che viene utilizzato dai membri della
famiglia trasformante fattore di crescita-β (TGF-β) per controllare la
segnalazione juxtacrina contro paracrina e dai paramyxovirus per
produrre involucri competenti per la fusione glicoproteine.

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Il rilascio di frammenti di propeptide di furina smaschera la sua attività di
endoproteasi e gli consente di scindere substrati in trans . La furina si
localizza nel TGN - una struttura tardiva del Golgi che è responsabile dello
smistamento delle proteine ​della via secretoria verso le loro destinazioni
finali, tra cui la superficie cellulare, gli endosomi, i lisosomi e i granuli
secretori 20 , 21 . Dal TGN, la furina segue un itinerario di traffico altamente
regolamentato attraverso diversi scomparti TGN / endosomiali e la
superficie cellulare 10 , 22 ( ). Questo itinerario spiega, in parte, la capacità
della furina di elaborare in vivo una diversa collezione di substrati di
proprietà. Inoltre, l'analisi del traffico di furina ha scoperto nuovi ruoli per
la fosforilazione delle proteine, il citoscheletro di actina e gli adattatori di
ordinamento nella regolazione del traffico proteico che controlla
l'omeostasi cellulare e le malattie.

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Modello di traffico di furina. Bocciolo di furina dal trans-Golgi network
(TGN) è mediata dal legame dei motivi di classificazione idrofobica a base
di tirosina o di di-leucina con la proteina adattatrice (AP) -1, che si rivolge
alla furina agli endosomi o si lega all'AP-4, che agisce sulla furina alla
superficie basolaterale dal TGN o eventualmente dagli endosomi. Nelle
cellule endocrine e neuroendocrine, AP-1 dirige il germogliamento della
furina dal TGN verso granuli secretori immaturi (ISG). La proteina-1 (PACS-
1) di cluster acida fosfofurinica collega il cluster acido furinico di furina
fosforilata con caseina chinasi 2 (CK2) all'AP-1 / clatrina per recuperare la
furina nel TGN dagli ISG, prima della loro progressione verso i granuli
secretori maturi ( MSG) o da endosomi. Le molecole di furina che arrivano
sulla superficie cellulare possono essere legate dalla proteina
filoscheletrica filamina, che è anche chiamata proteina legante l'actina
(ABP) -280. L'interiorizzazione dipendente dalla dinamina / clatrina della
furina della superficie cellulare è mediata principalmente dal motivo a
base di tirosina, che si lega all'AP-2. Una volta all'interno dei primi
endosomi, le molecole di furina che sono defosforilate dalle specifiche
isoforme della proteina fosfatasi 2A (PP2A) vengono consegnate al TGN,
apparentemente attraverso un compartimento endosomiale tardivo. Al
contrario, la furina fosforilata CK2 viene riciclata nuovamente sulla
membrana plasmatica in una fase dipendente dal PACS-1. Pertanto, i loop
TGN e quelli a ciclo periferico sono essenzialmente immagini speculari
l'uno dell'altro. Sulla base della simile itineria della carbossipeptidasi D
(CPD), il movimento della furina da un compartimento endosomiale post-
TGN sulla superficie cellulare potrebbe richiedere anche PP2A (linee
tratteggiate). L'ordinamento di nexin-15 (SNX-15), una proteina
contenente dominio PX che lega i fosfoinositidi, modula l'ordinamento
della furina attraverso gli endosomi.

La localizzazione alla trans rete -Golgi


Come per molte proteine ​di membrana di tipo I itinerante, sia la
localizzazione TGN della furina che il suo ciclo dinamico sono controllati
da sequenze nel suo dominio citoplasmatico a 56 aminoacidi ( ). La
localizzazione della furina nel TGN richiede un motivo bipartito composto
dal cluster acido fosforilato di caseina chinasi 2 (CK2) (EECPpSDpSEEDE,
dove p evidenzia i residui di serina che sono fosforilati) e un segmento
23 - 13/42
prossimale di membrana contenente due motivi idrofobici (YKGL e LI) 23 -
27 ( ). Il motivo bipartito controlla due stadi di un ciclo ciclico locale: il

segmento prossimale della membrana è necessario per l'efficiente


germogliamento della furina dal TGN agli endosomi, mentre il cluster
acido fosforilato dirige il recupero efficiente della furina endosomiale nel
TGN 28 .

I motivi di smistamento del dominio citoplasmatico di furina. Viene


mostrata la sequenza del dominio citoplasmatico della furina umana.
Sono indicati i vari motivi di ordinamento intracellulare. Vedi testo per
maggiori dettagli. ABP, proteina legante l'actina; AP, proteina
dell'adattatore; CK2, caseinchinasi 2; PACS-1, fosfofurina acida clustering
sorting protein-1; PP2A, proteina fosfatasi 2A; TGN, trans rete -Golgi. Per
una chiave per l'organizzazione del dominio furin, vedere la .

La localizzazione allo stato stazionario della furina nel TGN ha portato alla
supposizione che questo endoproteasi fende i substrati di proprietà in
questo compartimento e numerosi studi supportano questo modello 29 ,
30. Tuttavia, studi recenti indicano che i compartimenti di elaborazione
potrebbero essere formati dalla fusione di compartimenti contenenti
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furina endocitica con vescicole di esportazione che contengono proteine ​
di substrato 31 , 32 . Quale potrebbe quindi essere il ruolo del TGN nella
localizzazione della furina? Forse, oltre ad alloggiare la lavorazione di
alcuni substrati, questo compartimento potrebbe anche servire da
serbatoio strategicamente posizionato di molecole di furina che non sono
attive nel trattamento della proprietà. Tale meccanismo contribuirebbe a
spiegare il controllo della lavorazione della furinain vivo.

Ordinamento basolaterale
Nelle cellule polarizzate, la furina che si rivolge alla superficie basolaterale
è similmente controllata da un segnale bipartito che è composto dalla
parte carbossi-terminale del cluster acido - EEDE - e dal motivo FI 33 ( ). Il
motivo FI sembra legarsi alla proteina dell'adattatore di ordinamento (AP)
-4, e AP-4 è richiesto per l'ordinamento basolaterale della furina 34 ( ).
Questo ruolo dell'AP-4 espresso onnipresente spiega la mancanza di una
funzione per l'adattatore di smistamento basolaterale specifico epiteliale
AP-1B nel traffico di furina 35 , 36 .

In erba dalla trans rete -Golgi


Poco si sa circa il macchinario citoplasmatico che dirige il germogliamento
TGN della furina. Studi precedenti hanno dimostrato che la furina si
localizza nelle regioni rivestite di clatrina del TGN, il che indica un ruolo
per la proteina dell'adattatore di ordinamento AP-1.Inoltre, entrambi i
motivi LI e YKGL si legano alla catena μ1a di AP-1 ( rif . 37 ) ( figg , ). La
recente identificazione delle proteine ​localizzate nel Golgi, contenenti γ-
ear, ADP-ribosylation-factor-binding (GGA), che controllano il
germogliamento del recettore mannosio-6-fosfato dal TGN, solleva la
possibilità di un secondo percorso attraverso quale furina potrebbe uscire
dal TGN. Coerentemente con tale possibilità, il motivo LI della furina è
contenuto in una sequenza di legame di consenso GGA3 (DXXLI) 38 - 40 ( ).

CIS VERSUS TRANS SCISSIONE


la scissione cis si riferisce alla scissione intramolecolare autoproteolitica di
un propeptide endoproteasi da parte della triade catalitica che fa parte
della stessa molecola. la scissione trans si riferisce al trattamento di altre
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molecole.

ANTEROGRADO E RETROGRADO
Anterogrado si riferisce al traffico dal reticolo endoplasmatico (ER) verso
la membrana plasmatica, mentre retrogrado si riferisce al traffico dalla
membrana plasmatica verso l'ER.

Recupero dagli endosomi


A differenza del germogliamento della furina dal TGN, il recupero della
furina dagli endosomi al TGN è molto meglio compreso. L'ammasso acido
furinico fosforilato CK2 si lega alla proteina di smistamento PACS-1
(fosfofurin acid cluster sorting protein-1) - un connettore di smistamento
che collega la furina all'adattatore AP-1 clatrina e trasporta la furina dagli
endosomi al TGN 28 , 41 ( ). Il fatto che il legame tra AP-1 e PACS-1 sia
cruciale per l'ordinamento da endosoma a TGN consente di scoprire che
la mutazione del sito di legame AP-1 in PACS-1 o la delezione genetica di
AP-1 causano una simile errata localizzazione di furina nei compartimenti
endosomiali 36 , 41 , 42. PACS-1 non è dedicato esclusivamente alla furina;
controlla l'ordinamento endosoma-TGN di diverse proteine ​di membrana
che contengono motivi acidi di ordinamento dei cluster. Questi includono
proteine ​cellulari, come il recettore mannosio-6-fosfato indipendente dal
catione (CI-MPR), l'omologo furina PC5 / 6B ( ), carbossipeptidasi D (CPD),
Sortilin e diverse proteine ​patogene, incluso l'HIV -1 Nef (per "fattore
negativo") e diverse glicoproteine ​dell'involucro del virus dell'herpes,
come il virus varicella zoster gE e il citomegalovirus umano GB 28 , 43 - 45(L.
Wan e GT, osservazioni inedite). Il PACS-1 che si lega all'HIV-1 Nef è
necessario per l'immunoevasione attraverso la downregulation delle
molecole di classe I (MHC-I) di istocompatibilità della superficie cellulare e
il PACS-1 che si lega alla busta del virus dell'herpes è coinvolto nella
produzione di virus infettivi 41 , 44 (CM Crump e GT, osservazioni non
pubblicate). Come AP-1 potrebbe contribuire sia al trasporto anterogrado
che retrogrado tra il TGN e gli endosomi non è noto, ma i rapporti che
mostrano che AP-1 collega l'IC-MPR a una kinesina anterograda - KIF13A—
per la consegna sulla superficie cellulare dal TGN indica che le proteine ​di
smistamento potrebbero combinarsi per fornire la direzionalità del
trasporto 46 .
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Endocitosi
Molti motivi di smistamento che localizzano la furina nel TGN dirigono
anche il suo itinerario di smistamento endocitico. L'endocitosi della furina
è diretta principalmente dal motivo YKGL, che si lega alla subunità μ2
dell'adattatore AP-2 37 . Assunzione di superficie cellulare furin molecole
in compartimenti endocytic è regolata da legare attraverso il motivo VY a
filamin, un subcorticale proteina actina-di legame che è coinvolta nella
locomozione cellulare e di segnalazione 47 , 48 ( figg , ; G. Liu e GT,
osservazioni inedite). Inoltre, l'ordinamento di nexin-15 (SNX-15) influenza
l'interiorizzazione della furina ( ) e la sovraespressione di questa proteina
di smistamento impedisce l'interiorizzazione delle chimere contenenti
furina 49 .

Negli endosomi primitivi, la furina può essere riciclata sulla superficie


cellulare o trasferita al TGN. Il riciclaggio sulla superficie cellulare richiede
la fosforilazione CK2 del cluster acido furinico e PACS-1, mentre il
trasporto verso il TGN richiede la defosforilazione del cluster acido
furinico mediante specifiche isoforme della proteina fosfatasi 2A (PP2A) 50
, che apparentemente si verifica prima del passaggio attraverso un ritardo
endosoma intermedio 51 o attraverso endosomi di selezione / riciclaggio (
).

Quindi, PACS-1 e CK2 sembrano collocare la furina in uno dei due circuiti
di ciclismo locali - uno al TGN e uno tra la membrana plasmatica e gli
endosomi precoci. L'ordinamento tra questi due anelli richiede la
defosforilazione mediante PP2A. L'ordinamento di CPD è similmente
controllato dallo stato di fosforilazione del suo ammasso acido. Inoltre,
PP2A si lega direttamente al dominio citoplasmatico della CPD e questo
legame è essenziale per il controllo del trasporto di CPD tra il TGN e la
superficie cellulare 52 . Gli itinerari di smistamento altamente coordinati di
furina e CPD sono in correlazione con i loro ruoli sequenziali
nell'elaborazione di substrati di proprietà in vivo .

La via secretoria regolamentata


Lo studio del traffico di furina nelle cellule endocrine e neuroendocrine ha
sfidato la visione di lunga data relativa alla separazione dei percorsi
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regolati e costitutivi . In questi tipi di cellule, la furina germoglia in granuli
secretori immaturi nascenti (ISG), insieme ad ormoni e altre molecole che
sono destinati a granuli secretori maturi con nucleo denso (MSG) ( ). Gli
ISG sono compartimenti AP-1 / clatrinici di breve durata che subiscono
fusioni omotipiche e un ampio rimodellamento della membrana durante
il trasporto basato su micro-tubuli verso la periferia cellulare 53 - 55 . Alla
periferia della cellula, la furina viene rimossa dagli ISG, apparentemente
durante il rimodellamento dipendente dalla breferina A (BFA), ADP
ribosylation factor-1 (ARF1)-dipendente della membrana ISG56 , 57 e viene
restituito al TGN 55 , 58 . È probabile che il blocco BFA del rimodellamento
ISG sia dovuto all'inibizione del reclutamento di AP-1 / clatrina mediato
dall'ARF1 e al conseguente germogliamento della membrana. La
rimozione della furina dagli ISG richiede un cluster acido fosforilato CK2 e
PACS-1 ( rif 41 , 58 ). Risultati simili sono stati riportati per il recupero del
CPD e monoamina vescicolare transporter-2, che evidenzia ruoli
importanti per CK2 e PACS-1 nella maturazione granuli 59 - 61 . Numerosi
substrati di furina sono ordinati nel percorso regolato 62 - 65, che indica che
furina e CPD hanno ruoli cruciali nell'elaborazione della proprietà negli
ISG.

REGOLATO VERSO PERCORSI COSTITUTIVI


La via regolata nelle cellule endocrine e neuroendocrine costituisce la via
anterograda, che porta dalla rete trans- Golgi (TGN) ai granuli secretori
maturi contenenti peptidi che possono essere stimolati all'esocitosi a
seguito di un afflusso di calcio extracellulare. La secrezione per via
costitutiva non è stimolata dal calcio.

neurotrofine
Una classe di molecole che controllano vari aspetti della sopravvivenza e
della plasticità neuronale e che includono il fattore di crescita del nervo, il
fattore neurotrofico derivato dal cervello, la neurotrofina-3 e la
neurotropina-4/5. Le neurotrofine sono sintetizzate come proproteine ​che
richiedono la scissione in corrispondenza dei siti di furina consensuali.

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Le intuizioni acquisite dall'analisi del traffico di furina sono eguagliate da
quelle ottenute da recenti studi che indicano che la furina ha ruoli ampi e
importanti in embriogenesi, omeostasi e malattia. Paradossalmente,
sebbene la furina sia un enzima essenziale per l'embriogenesi, la sua
attività può anche portare a malattie mortali negli adulti. A causa delle
limitazioni di spazio, limiterò questa discussione principalmente al lavoro
riportato negli ultimi due anni.

Per tagliare o non tagliare - innervazione neuronale e demenza


Il fattore di crescita del nervo β 16-kDa (β-NGF) è la neurotropina
prototipica derivata dal bersaglio e studi biochimici mostrano che la
furina è l'endoproteasi principale che fende pro-β-NGF 10 , 22 ( ).
Sorprendentemente, l'elaborazione catalizzata dalla furina di pro-β-NGF
controlla se la neurotrofina attiva percorsi di sopravvivenza o morte
cellulare all'interno dei neuroni innervanti 66 . Il β-NGF trattato media la
sopravvivenza cellulare attraverso il legame ad alta affinità con le tirosin-
chinasi del recettore proto-oncogene Trk, che mediano gli effetti trofici del
β-NGF e di altre neurotrofine. Al contrario, pro-β-NGF secreto e non
trattato media l'apoptosi mediante legame ad alta affinità con il recettore
per neurotrofina 75-kDa (p75 NTR). Questo recettore è un membro del
recettore del fattore di necrosi tumorale (TNF) / famiglia FAS che
antagonizza la segnalazione trofica mediata dai recettori β-NGF e Trk. La
regolazione dell'attività della furina potrebbe quindi avere un ruolo
centrale nel determinare quali neuroni formano complessi sinaptici e
quali neuroni muoiono ( ).

19/42
20/42
Furina nello sviluppo, omeostasi e malattia. a | La scissione del fattore
di crescita del nervo pro-β (NGF) mediata dalla furina produce la
neurotropina 13-kDa β-NGF che si lega ai recettori Trk per promuovere
l'innervazione sinaptica. Al contrario, l'inibizione o il sequestro della furina
provoca la secrezione di pro-β-NGF che si lega al recettore della
neurotrofina 75-kDa (p75 NTR ) per promuovere percorsi di morte
cellulare. B| L'ectodisplasina-A (Eda-1) è un membro della famiglia del
fattore di necrosi tumorale trimerica che stimola la morfogenesi delle
strutture ectodermiche mediante l'attivazione del suo recettore, EDAR,
sulle cellule bersaglio. Eda-1 può segnalare in modo juxtacrine legandosi a
EDAR su cellule adiacenti. Tuttavia, la scissione della membrana ancorata
a Eda-1 dalla furina rilascia il ligando e gli consente di segnalare
attraverso EDAR su cellule distanti in modo paracrino. c| Nei sinoviociti, la
furina e il fattore di crescita trasformante (TGF) -β partecipano a un ciclo
di feedback positivo che provoca livelli elevati di "disintegrina e
metalloproteasi con motivi di trombospondina-4" (ADAMTS-4 o
aggrecanase-1). La furina taglia sia pro-TGF-β che pro-ADAMTS-4 per
produrre rispettivamente il fattore di crescita attivo e la proteasi. La
forma matura secreta di TGF-β si lega quindi al suo recettore e, attraverso
un percorso convergente SMAD2 e proteina chinasi attivata da mitogeno
(MAPK), aumenta l'espressione della furina. L'aumento dei livelli di furina
porta ad un aumento del TGF-β, che crea un circuito di feedback positivo.
Nei sinoviociti, TGF-β stimola anche l'espressione di pro-ADAMTS-4.
Quindi, poiché furina e TGF-β si trovano in questo circuito positivo, i livelli
di ADAMTS-4 attivi sono notevolmente elevati,d | La furina attiva diverse
metalloproteinasi a matrice di tipo membrana (MT-MMP) che sono
coinvolte nella formazione del tumore e nelle metastasi. MT-MMP1
attivato dalla furina attiva MMP2 (gelatinasi), che degrada la matrice
extracellulare, e MT-MMP1 degrada direttamente anche la matrice
extracellulare stessa.

Questo controllo dell'attività della furina potrebbe estendersi ad ulteriori


programmi di sviluppo. Ad esempio, la scissione della furina del recettore
transmembrana Notch è necessaria per il rilascio del dominio
intracellulare di Notch mediante proteolisi della γ-secretasi. Questo
dominio intracellulare si lega quindi al regolatore trascrizionale CSL (per

21/42
"fattore di legame del promotore C / soppressore di peli / Lag-1"), che
attiva i geni necessari per la comunicazione cellula-cellula durante lo
sviluppo 67 . Al contrario, Notch non spaccato media una via di
segnalazione distinta che inibisce la differenziazione cellulare 68 . Non è
noto come l'attività della furina sia controllata per regolare l'elaborazione
di questi substrati.

Il ruolo di Furin nell'elaborazione mediata da α, β e γ-secretasi della


proteina precursore β-amiloide (APP) aiuta a determinare se i peptidi
derivati ​da APP migliorano la segnalazione di NGF ai neuroni innervanti o
causano la massiccia neurodegenerazione associata all'Alzheimer malattia
69 , 70 . Il dominio extracellulare dell'APP viene suddiviso dall'α-secretasi

per produrre APP solubili che migliorano le attività anti-apoptotiche e


neuroprotettive di NGF 71 , 72 . Al contrario, la scissione dell'APP da parte di
una combinazione delle β- e γ-secretasi rilascia il βAPP 1-40 amiloidogenico
, il 1-42 APPe peptidi correlati, che formano placche amiloidi e sono
responsabili della neurodegenerazione che è sofferta da persone con
malattia di Alzheimer 73 .

DEMENTIA AMYLOID
Anomalia neurologica causata da depositi di materia proteica.

Nodo di smalto
Centro di segnalazione nell'epitelio dentale che controlla la morfogenesi
dei denti.

Studi recenti indicano un ruolo essenziale per la furina nell'attivazione sia


della α che della β-secretasi. Due membri della famiglia ADAM (per "una
disintegrina e simile alla metalloproteinasi") di metalloproteinasi di zinco -
ADAM10 e ADAM17 - sono stati implicati come α-secretasi 74 , 75 .
Caratteristica di questa famiglia di proteine, sia ADAM10 che ADAM17
contengono propeptidi che sono collegati ai loro domini catalitici da un
motivo di furina consensuale, e la scissione in questo sito è necessaria per
la loro attivazione 76 , 77 . È interessante notare che il PC7 potrebbe
attivare l'α-secretasi in condizioni basali, mentre la furina potrebbe
attivarlo in seguito all'attivazione della protein chinasi C, che aumenta il

77 22/42
rilascio catalizzato dall'α-secretasi dell'APP solubile 77La β-secretasi,
chiamata anche enzima di separazione dell'APP del sito β (BACE), è una
proteina di membrana di tipo I che si localizza nel sistema TGN /
endosomiale e richiede la rimozione proteolitica della sua proregione
dalla furina in un sito minimo di furina (- Arg-Leu-Pro-Arg ↓ ) 78 - l'80 . Le
somiglianze tra BACE e il traffico di furina supportano ulteriormente l'idea
che la furina sia l'enzima attivatore di BACE 81 , 82 .

L'Alzheimer è solo un tipo di demenza amiloide in cui la furina ha un ruolo


cruciale. Due mutazioni separate nel gene BRI che codifica per una
proteina di membrana di tipo II ampiamente espressa causano la
demenza britannica familiare (FBD) o la demenza danese familiare (FDD).
In soggetti sani, scissione di questa proteina per furina, o possibilmente
PC7, in un sito atipico di furina, che contiene una lisina a P6 (–Lys – Gly –
Ile – Gln – Lys – Arg– ↓ (dove Gln è glutammina)), rilascia un peptide
carbossi-terminale di 23 residui con una funzione non identificata 83 , 84 .
Tuttavia, la transversione nucleotidica o la duplicazione dei decamer in
FBD e FDD, rispettivamente, provoca la produzione di peptidi
amiloidogenici a 34 residui aberranti sulla scissione della furina83-85.

Studi recenti mostrano anche un ruolo della furina nelle amiloidosi


familiari di tipo finlandese e danese. Entrambe le malattie sono causate
da mutazioni che interrompono il legame del calcio con la gelsolina
plasmatica, che è uno spazzino circolante di actina extracellulare 31 , 86 , 87 .
Il legame con il calcio interrotto provoca la scissione aberrante della
furina sul lato carbossi-terminale di un sito criptico -Arg – Val – Val – Arg–
↓ , che è normalmente sepolto nel nucleo della molecola di tipo selvaggio.
La scissione mediata dalla furina avvia il rilascio di un peptide
amiloidogenico 70-amminoacido 87 .

Furina, TNF e TGF-β - segnalazione a corto e lungo raggio nello


sviluppo e nella malattia
Il rilascio proteolitico di TNF-α dalla membrana plasmatica da parte di
ADAM17 è stato a lungo considerato come un meccanismo chiave che
media la segnalazione juxtacrina contro paracrina di questa famiglia di
citochine 88 . Recentemente, tuttavia, è stato dimostrato che la furina
controlla il campo di segnalazione di un altro membro della famiglia TNF -
23/42
ectodisplasina-A (Eda-1; ). Eda-1 è una proteina di membrana plasmatica
di tipo II che controlla la formazione di numerosi tessuti epiteliali, inclusi
capelli, denti e ghiandole sudoripare eccrine. La prima espressione di Eda-
1 e del suo recettore - EDAR - si trova nelle regioni parzialmente
sovrapposte dell'epitelio dentale ispessito 89. Durante la proliferazione
dell'epitelio nel mesenchima sottostante per formare il bocciolo del dente,
l'espressione EDAR accompagna il bordo principale dello strato epiteliale
ed è in definitiva confinata al nodo dello smalto , mentre Eda-1 rimane a
diverse distanze cellulari nell'epitelio esterno. Un passaggio mediato dalla
furina dalla segnalazione juxtacrine a quella paracrina potrebbe
accompagnare il disaccoppiamento spaziale del recettore e del ligando ( ).
Le mutazioni nel sito di scissione della furina di Eda-1 rappresentano il
∼20% di tutte le mutazioni conosciute nella displasia ectodermica
idroidrotica legata all'X e bloccano la capacità di Eda-1 di segnalare in
modo paracrino 90 , 91 .

L'importanza della furina per la segnalazione di altri due membri della


famiglia TNF - fattore di attivazione delle cellule B (BAFF) e un ligando che
induce la proliferazione (APRILE) - indica un ruolo ampio per la furina nel
controllo della funzione TNF 92 - 94 .

Il ruolo di Furin nell'attivazione dei membri della famiglia TNF è superato


dal suo ruolo nel controllo della segnalazione della famiglia TGF-β.
L'inattivazione del gene furinico nei topi crea un fenotipo letale
embrionale, con morte avvenuta in una fase embrionale precoce 95 . La
furina è richiesta sia nei tessuti extra-embrionali che nel mesoderma
cardiogeno per promuovere la vasculogenesi del sacco tuorlo e la
chiusura ventrale, l'ansia del cuore e la rotazione assiale. L'incapacità di
mantenere l'asimmetria nell'embrione potrebbe derivare da un blocco
nella produzione catalizzata dalla furina dei membri della famiglia TGF-β
Nodal e Lefty-2 ( rif . 96 ). Coerentemente con questo modello, la furina
taglia diversi membri del TGF-β, inclusi TGF-β1 e proteina morfogenetica
ossea-4 (BMP-4) 97 , 98. Inoltre, l'interruzione della maturazione pro-BMP-4
negli embrioni di Xenopus laevis a quattro cellule provoca un fenotipo
dorsalizzato che imita il fenotipo che si osserva quando viene interrotta la
via di segnalazione BMP-4 98 .

24/42
morfogeni
Molecole di segnalazione secrete che regolano i modelli di sviluppo e la
formazione degli assi producendo un gradiente di concentrazione che
emana dalle cellule in cui sono sintetizzati.

glioblastomi
Tumori cerebrali maligni aggressivi derivati ​da astrociti e che
rappresentano il ∼30% di tutti i tumori cerebrali primari.

Anche il metodo di autoattivazione di Furin sembra essere usato da BMP-


4 per controllare la sua potenza e il range di segnalazione durante
l'embriogenesi 99 . Furin prima scinde pro-BMP-4 nel sito di furin
consenso che unisce i domini pro e BMP-4 (–Arg – Ser – Lys – Arg ↓ -),
seguito da una seconda scissione in un sito di furina con consenso
minimo all'interno del propeptide (–Arg – Ile – Ser – Arg ↓ -). Il contesto dei
due siti garantisce l'elaborazione ordinata di pro-BMP-4 e la corretta
attività di questo morfogeno . La presenza di consenso e siti minimi di
furina in altre molecole di segnalazione correlate a BMP-4 10 , 22 , 99indica
che il metodo "misura una volta, taglia due volte" viene utilizzato per
controllare i gradienti di segnalazione in molti organismi. Inoltre, questo
metodo potrebbe estendersi alla patogenesi virale, in cui la generazione
della proteina di fusione del virus respiratorio-sinciziale (RSV)
correttamente ripiegata richiede la scissione sequenziale in due siti di
furina per produrre progenie infettiva 100 , 101 .

Sebbene l'attivazione del TGF-β catalizzata dalla furina sia essenziale per
l'embriogenesi, questa via provoca malattie negli adulti. Furina e TGF-β
cooperano in un nuovo ciclo di feedback positivo che aggrava l'artrite
reumatoide ( ). Il TGF-β può legarsi al proprio recettore per stimolare la
trascrizione del gene furinico attraverso un percorso convergente SMAD2
e protein chinasi attivata da mitogeno (MAPK) 102 - 104. Nei sinoviociti, che
sono cellule simili ai fibroblasti e ai macrofagi che rivestono il sinovio delle
articolazioni, i livelli amplificati di furina e TGF-β si combinano per
aumentare i livelli di ADAMTS-4 (una disintegrina e metalloproteasi con
motivi trombospondinici-4). ADAMTS-4 (precedentemente identificato

25/42
come aggrecanase-1) è un membro di una nuova famiglia di proteasi di
ADAM e degrada la proteina aggrecan della cartilagine e causa l'artrite
reumatoide 105 , 106 ( ).

Metastasi di furina e tumore


La furina è sovraregolata in diversi tumori, inclusi carcinomi polmonari
non a piccole cellule, carcinomi a cellule squamose della testa e del collo e
glioblastomi 107 . Inoltre, l'aumento dei livelli di furina nei tumori è
correlato sia all'aumentata aggressività dei tumori della testa, del collo e
dei polmoni, sia all'aumento dei livelli di uno dei suoi substrati -
metalloproteinasi a matrice di tipo 1 a membrana (MT1-MMP) 108 , 109 .
MT1-MMP attiva pro-MMP2 extracellulare (pro-gelatinasi) per indurre una
rapida crescita tumorale e neovascolarizzazione 110 ( ). L'attivazione di
MMP utilizza classicamente un meccanismo di commutazione della
cisteina, in cui l'atomo di zinco del sito catalitico che è legato a un residuo
di cisteina nella regione pro del pro-enzima latente commuta per legare
una molecola d'acqua nella proteasi attiva. Tuttavia, l'attivazione di MT1-
MMP e dei familiari correlati sembra decisamente più complessa e
richiede la scissione mediata dalla furina della loro regione pro 111 , 112 . Gli
inibitori della furina, incluso α 1 -PDX, bloccano l'attivazione dell'MT1-MMP
nei carcinomi della testa, del collo e delle cellule squamose orali, il che
porta a un blocco sia nell'attivazione dell'MMP2 che nelle metastasi
tumorali nei topi trapiantati 109 , 113 . Il fatto che l'asse MT1-MMP / MMP2 è
essenziale per l' alveolizzazionedel polmone embrionale 114 fornisce un
altro esempio di una cascata attivata dalla furina che è essenziale
nell'embriogenesi ma che è dannosa negli adulti.

Un secondo substrato di furina, fattore di crescita 1 insulino-simile (IGF1),


è sovraregolato nei tumori del colon, del seno, della prostata e del
polmone. Il suo recettore, IGF1R, che è anche un substrato di furina, è
sovraregolato sulla superficie delle cellule tumorali 115 . L'elaborazione di
IGF1 e IGF1R è catalizzata da furina o PC5 / 6A e l'inibizione di questa
elaborazione da parte di α 1 -PDX riduce l'incidenza, la dimensione e la
vascolarizzazione dello sviluppo del tumore nei topi trapiantati 116 .

neovascolarizzazione
26/42
Stimolazione de novo di nuovi apporti di sangue a un tumore in crescita.

ALVEOLIZATION
Comprende le ultime fasi dello sviluppo polmonare, che iniziano con lo
sviluppo di alberi bronchiali e respiratori e culminano nella formazione di
sacculi terminali e alveoli per facilitare uno scambio di gas efficiente.

La furina non è l'unico PC associato a una prognosi sfavorevole per molti


tumori. L'omologo della furina, PACE4 ( ; ), è sovraregolato nei tumori
mammari 117 e l'espressione di questo PC aumenta l'invasività dei
carcinomi a cellule squamose del topo convertendoli in carcinomi a cellule
mandrine più aggressivi, scarsamente differenziati 118 . Insieme, questi
studi indicano che l'inibizione dei PC potrebbe essere un nuovo approccio
alla lotta contro vari tumori aggressivi.

Antrace, AIDS, Ebola> - e poi?


I primi studi che hanno dimostrato il ruolo della furina sia nell'attivazione
della tossina di antrace che nella maturazione dell'HA nel virus
dell'influenza aviaria hanno semplicemente fornito uno sguardo al ruolo
devastante della furina nell'attivazione di vari patogeni batterici e virali.
L'analisi dell'attivazione della tossina batterica ha ulteriormente chiarito
ruoli distinti per l'elaborazione della proproteina catalizzata dalla furina
sulla superficie cellulare o sugli endosomi precoci, fornendo un'unica
prospettiva per svelare la regolazione del traffico di proteine ​nelle cellule
di mammiferi. La furina sulla superficie cellulare attiva la tossina di
antrace 6 , 119 - un'arma ormai famigerata del bioterrorismo 120 (
RIQUADRO 2 ) - così come la tossina aerolisina, che è un agente causale in
molte malattie di origine alimentare 121 , eClostridium septicum α-tossina,
che provoca la cancrena gassosa 122 ( ). La scissione di ciascuna tossina da
parte della furina è un passaggio obbligatorio per rendere la tossina in
grado di formare i pori nelle membrane cellulari.

La tossina di antrace comprende tre proteine: PA, antigene protettivo,


cosiddetto per la sua capacità di edificare la protezione immunitaria
contro l'antrace; e due proteine ​tossiche: fattore letale (LF) o fattore
edema (EF) 123 . LF è una metalloproteinasi che fende le chinasi MAPK,

123 di 27/42
mentre EF è un adenilato ciclasi 123 di calmodulina-dipendente . La
molecola PA 83-kDa che viene secreta dal batterio si lega al recettore della
tossina antrace (ATR) 124 , e viene quindi scissa dalla furina della superficie
cellulare per generare un PA 63-kDa associato alle cellule e un PA libero
20-kDa ( ). La molecola PA associata alle cellule eptamerizza, si lega a uno
dei due fattori tossici e viene quindi interiorizzata in endosomi precoci 125.
Nell'ambiente pH acido endosomiale precoce, l'eptamero PA forma un
canale di membrana che sposta i fattori tossici nel citoplasma della cellula
ospite, provocando edema, shock sistemico e morte ( ). In assenza di
furina, la tossina non riesce a riunirsi e non è letale 126 . Inoltre, la
mutazione del sito di scissione della furina provoca una proteina negativa
dominante che si lega all'ATR ma non riesce a oligomerizzare 127 . Sia la
proaerolysin che il clostridium septicum α-tossina si legano alle molecole
ancorate al glicosilfosfatidilinositolo e, analogamente alla PA, è necessaria
la scissione della furina di entrambe le molecole per formare pori
eptamericani permeabili agli ioni nella membrana del plasma delle cellule
ospiti, che porta alla tossicità cellulare 128 ,129.

28/42
Attivazione furinica della tossina antrace. La scissione dell'antigene
protettivo di antrace (PA) da parte della furina porta all'internalizzazione e
all'attivazione del fattore letale (LF), che è una metalloproteinasi di zinco
che scinde le chinasi della proteina chinasi attivate dal mitogeno (MAPK) e
il fattore dell'edema (EF), che è un calmodulina adenilato ciclasi
dipendente. EF provoca la formazione di escara, che sono masse nere di
tessuto necrotizzato simile a una crosta e un massiccio edema dei tessuti
molli 123. Nei macrofagi polmonari, la LF fagocitata porta a cambiamenti
nei livelli di necrosi tumorale fattore-α e interleuchina-1β, nonché
nell'apoptosi. I livelli alterati di citochine accoppiati al sistema immunitario
innato paralizzato provocano rapidamente shock e morte sistemica
indotti dall'antrace mediante un processo complesso e irrisolto. Vedi
testo per maggiori dettagli. Modificato con l'autorizzazione di REF. 163 . ©
(2002) Birkhäuser Publishing Ltd.

La furina endosomiale precoce attiva altre tossine batteriche, tra cui l'
esotossina A di Pseudomonas (PEA), la tossina di shiga (ST), la tossina di
shiga-1 (ST-1) e le tossine di difterite (DT) 10 ( ). A differenza delle tossine
attivate dalla superficie cellulare, queste tossine sono tutte tossine di tipo
A / B che contengono un dominio attivo (A) e un dominio di legame (B) che
sono uniti da un sito di scissione della furina 129 . Dopo il legame con il
recettore, ogni tossina viene endocitata in endosomi precoci, dove viene
scissa dalla furina. La scissione di ST, ST-1 e PEA da parte della furina
richiede il pH acido che è caratteristico dei compartimenti endosomiali
precoci, mentre la scissione di DT non lo fa 10. Come nei modelli tumorali
discussi, l'inibizione dell'attività della furina da parte del rilascio
extracellulare di α 1 -PDX protegge le cellule dalla PEA e altre tossine
batteriche 13 (F. Jean e GT, osservazioni non pubblicate). La sensibilità
delle cellule al PEA è aumentata in assenza di filamina ( ), che
normalmente collega la furina alla superficie cellulare, indicando che la
filamina potrebbe controllare la formazione di compartimenti endosomici
di trattamento della furina 47 . La struttura cristallina del PEA mostra che
l'esposizione della molecola a un pH acido smaschera il sito di scissione
della furina, il che spiega almeno in parte il requisito per l'elaborazione
della furina acida dipendente dal pH 130 .

Sorprendentemente, la scissione della furina consente a PEA, ST / ST-1 e


29/42
DT di traslocare nel citosol attraverso tre distinti percorsi di traffico. Dopo
la scissione, il dominio DT B forma un canale nella membrana
endosomiale precoce che sposta il frammento A nel citosol 131 della cellula
ospite . Al contrario, il rilascio di citosol di PEA e ST / ST-1 richiede un
traffico retrogrado verso l'ER, dove le tossine sono apparentemente
traslocate nel citosol attraverso il canale 61 , 132 , 133 sec . Il traffico
retrogrado di PEA richiede il recettore kdel , che si lega alla PEA
trasformata e recupera la tossina in ER 132 , 133, mentre i traffici ST / ST-1
sono stati suddivisi verso l'ER attraverso un percorso che è sia recettore
KDEL che indipendente dal copi , il che indica che i cappotti delle vescicole
diversi dalla COPI indirizzano il loro recupero all'ER. Tuttavia, il recupero di
ST / ST-1 dipende da RAB6, una piccola GTPase che controlla il trasporto
intra-Golgi e il ciclo delle glicosiltransferasi residenti nel Golgi attraverso
l'ER 132 - 134 . Poiché è stato anche suggerito che la furina potrebbe essere
ordinata all'ER per metabolizzare i recettori dell'insulina ripiegati male,
sarà importante determinare se la furina è anche ordinata attraverso il
percorso ST / ST-1 135 .

CANALE SEC61
La principale proteina che forma il poro nella membrana del reticolo
endoplasmatico (ER) che facilita la traslocazione di proteine ​nascenti
sintetizzate nella via secretoria. Il canale SEC61 potrebbe anche essere un
condotto per la traslocazione inversa (dislocazione) delle proteine ​dall'ER
al citoplasma.

RICEVENTE KDEL
Proteina di membrana localizzata dal Golgi che si lega ai motivi KDEL (–Lys
– Asp – Glu – Leu–) carbossi-terminali, che sono presenti su molte
proteine ​del reticolo endoplasmatico residente (ER) che fuggono nel Golgi
e che li recupera in ER .

COPI
(Complesso proteico Coatomer I). Un tipo specifico di cappotto sulle
vescicole che circola principalmente tra le cisterne del Golgi e dal Golgi al
reticolo endoplasmatico. Riferito anche su endosomi precoci.
30/42
VIRULENZA
La misura o il grado in cui un patogeno può causare la malattia.

L'ampio ruolo della furina nell'attivazione delle tossine batteriche è


superato dal suo ruolo nell'attivazione di numerosi virus patogeni. Molti
virus patogeni, tra cui il virus dell'influenza aviaria, l'HIV-1, il virus del
morbillo e l'RSV, esprimono glicoproteine ​dell'involucro che devono
essere scisse in siti di furina consensuali per formare la glicoproteina
dell'involucro maturo e fusogenico 10 , 22 . Ad esempio, l'elaborazione
dell'HIV-1 gp160 svela il peptide fusogenico gp41 amino-terminale
contenuto nel complesso dell'involucro trimerico gp120 / g41. Non è noto
se furin o uno degli altri PC (ad esempio PACE4, PC5 / 6B o PC7) sia la
gp160 convertase in vivo 136 . Le cellule di Lovo, prive di furina, trattano
l'HIV-1 gp160 ( rif . 137). Tuttavia, gli inibitori della furina bloccano
l'elaborazione dell'HIV-1 gp160 e, a sua volta, la produzione dell'HIV-1
infettivo, oltre a bloccare altri virus che richiedono l'elaborazione delle
loro glicoproteine ​dell'involucro in corrispondenza dei siti di furina 10 .
Furin taglia l'HIV-1 gp160 sul lato carbossi-terminale della sequenza di
consenso –Arg – Glu – Lys – Arg– ↓ . Il glutammato P3 in questo sito di
scissione riduce l'efficienza della lavorazione della furina e la
conservazione di questo residuo in diversi isolati dell'HIV ha sollevato
dubbi sul coinvolgimento della furina nella lavorazione della gp160 136 . In
effetti, la mutazione di questo sito di scissione per creare un sito
contenente tutti gli aminoacidi di base (–Arg – Arg – Lys – Arg– ↓ ) migliora
l'elaborazione mediante furina 138. Sorprendentemente, tuttavia, l'HIV
ricombinante contenente questo sito all-basic viene attenuato, il che
indica un vantaggio selettivo per il sito suddiviso in modo inefficiente -Arg
– Glu – Lys – Arg– ↓ nell'HIV-1.

L'HIV-1 sembra mantenere un vantaggio di crescita selettiva usando un


sito di furina non ottimale nella sua involucro glicoproteina, mentre
l'analisi del tropismo virale - ovvero i determinanti molecolari che
consentono a un virus di diffondersi in tutto il corpo - mostra che la
virulenza di molti i virus mortali (incluso il virus dell'influenza aviaria, il
virus delle malattie di Newcastle e, potenzialmente, il virus dell'Ebola)
sono direttamente correlati alla capacità di questi virus di incorporare un

31/42
sito di scissione della furina di consenso all'interno delle loro proteine ​
dell'involucro 139 - 142 . Ad esempio, la patogenicità dei virus dell'influenza
aviaria è stata a lungo riconosciuta correlata direttamente con la scissione
del suo precursore della proteina di fusione HA 0, che viene tagliato dalla
furina per generare il complesso HA 1 –HA 2 competente per la fusione .
Simile a HIV-1 gp160, la scissione di HA 0 espone il peptide fusogenico
situato nell'ammino terminale di HA 2 , che può fondersi con le membrane
delle cellule bersaglio.

I virus avirulenti dell'influenza aviaria, che mancano di un sito di furina


consensuale nell'HA 0 , causano un'infezione localizzata nel tratto
intestinale. Tuttavia, la mutazione del sito di scissione HA 0 in un sito di
furina di consenso consente al virus di essere attivato dalla furina
ubiquitariamente espressa, permettendo invariabilmente al virus di
diffondersi sistematicamente in tutto l'uccello, inclusa l'infezione del
sistema nervoso centrale 139 . Questa capacità si riferisce allo scoppio
mortale dell'influenza a Hong Kong nel 1997 ( RIQUADRO 2). L'analisi del
virus dell'influenza H5N1, che ha ucciso almeno sei persone, ha mostrato
che erano necessarie solo due mutazioni per generare il virus letale - una
mutazione in una subunità dell'RNA polimerasi virale PB2, insieme alla
generazione di un sito di furina tandem nel giunzione di scissione tra HA 1
e HA 2 (–Arg – Glu – Arg – Arg – Arg – Lys – Lys – Arg– ↓) 143 . Non si sa
esattamente come il sito di furina in tandem e la mutazione PB2
contribuiscano all'aumento della virulenza dell'influenza H5N1.
Fortunatamente, l' infettività attenuatadi questo virus, che è anche poco
compreso, ne ha impedito la diffusione attraverso la popolazione.
Tuttavia, la propensione alla rapida mutazione e il tasso di riassortimento
dell'influenza aviaria e la sua capacità documentata di saltare
direttamente dagli uccelli agli umani sottolineano la nostra vulnerabilità a
questo patogeno 144 .

L'importanza della furina per la virulenza patogena si estende ad altri


virus, incluso il virus Ebola. Ad esempio, i ceppi altamente patogeni di
Ebola Zaire e Costa d'Avorio - che causano una febbre emorragica
massiccia e improvvisa (fulminante) che è caratterizzata da sanguinamenti
interni ed esterni massicci e che uccide il 90% delle persone che lo
contraggono - contengono un sito di furina di consenso nella loro busta
145 32/42
glicoproteina (GP) 145 . Ma, al contrario, il GP della varietà Ebola Reston
relativamente più mite manca di un sito di furina consensuale. Questo
isolato non è patogeno per l'uomo 141 . Sorprendentemente, tuttavia,
nonostante le apparenti somiglianze strutturali sottostanti tra l'HIV-1
gp160, il virus dell'influenza HA e il virus del virus dell'Ebola, la scissione
del GP catalizzata dalla furina non è richiesta per la fusione di membrana
nei modelli di coltura cellulare146 . La mancanza di un requisito per
l'elaborazione GP per la fusione di membrana è coerente con la presenza
di una sequenza di fusione interna in Ebola GP e relativi flaviviruses 147 .
Cosa potrebbe quindi spiegare il trofismo del virus Ebola dipendente dalla
furina? Un indizio risiede nella grave citotossicità e nel marcato aumento
della permeabilità vascolare del GP dall'Ebola Zaire altamente patogeno,
ma non dall'isolato apatogeno di Reston 148 , 149 . È interessante notare che
la regione cruciale del GP richiesta per questa tossicità è adiacente al sito
di scissione della furina, indicando che la proteolisi potrebbe svelare il
dominio citotossico.

INFETTIVITÀ
La capacità di un agente patogeno di invadere un ospite e replicarsi,
indipendentemente dalla sua capacità di causare malattie.

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In sintesi, la reazione proteolitica catalizzata dalla furina, che una volta
sembrava così ordinaria, ora ha chiaramente enormi implicazioni nella
ricerca biologica. Il metodo di autoattivazione "misura una volta, due
volte" di Furin ha prodotto una nuova comprensione dell'interazione tra il
ripiegamento delle proteine ​e i microambienti distinti dei compartimenti
della via secretoria precoce e tardiva. Inoltre, questo metodo di
attivazione sembra estendersi oltre i PC: viene utilizzato per controllare la
formazione di gradienti di morfogeno durante l'embriogenesi, nonché il
corretto piegamento di alcune glicoproteine ​dell'involucro virale. Il traffico
intracellulare di furina è decisamente complesso e ha fornito nuove
informazioni sulla regolazione del traffico proteico, inclusi nuovi ruoli per
la fosforilazione delle proteine, il citoscheletro di actina e adattatori di
smistamento. sorprendentemente,

33/42
Gli studi in corso sulla furina dovrebbero chiarire ulteriormente la sua
attività in vivo , nonché le sue relazioni con altri PC. Analisi
dell'innervazione neuronale, del destino cellulare e della segnalazione
juxtacrina contro paracrina indicano che l'attività della furina potrebbe
essere controllata dinamicamente, ma non sappiamo come. Una
possibilità è che gli inibitori cellulari della furina possano essere espressi
temporalmente, o che il complesso e diversificato meccanismo che dirige
l'itinerario del traffico di furina altamente regolato possa controllare se la
furina interagisce con i suoi vari substrati. Inoltre, i nostri modelli di
elaborazione della furina devono anche tenere conto dei ruoli degli altri
membri della famiglia PC ampiamente espressi che transitano in modo
simile alla furina - vale a dire PC7, PC5 / 6B e PACE4. L'estensione dei loro
ruoli nel percorso furinico rimane poco chiara.

L'analisi del traffico di furina non solo continuerà a portare a una migliore
comprensione dei processi di base coinvolti sia nel controllo del traffico di
membrana sia nell'integrazione di questi passaggi dinamici di selezione
con cascate di trasduzione del segnale, destino cellulare, altri PC e sistemi
di proteasi, chiarirà inoltre il ruolo della furina in un ampio spettro di
malattie umane. La scoperta che microrganismi patogeni e batterici
mortali usurpano il percorso della furina per esercitare la loro virulenza
sostiene fortemente una strategia che mira alla furina per un intervento
terapeutico, anche se una tale strategia dovrebbe considerare che la
stessa prevalenza della furina potrebbe anche creare tossicità nei farmaci
quel bersaglio. Tuttavia, la furina ha una grande promessa come chiave
per risolvere domande sia teoriche che pratiche in biologia cellulare.

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Mi scuso con i colleghi di cui non ho citato il lavoro a causa delle
limitazioni di spazio. Un ringraziamento speciale va a A. Zhou, D. Steiner,
membri del mio laboratorio e collaboratori per discussioni approfondite e
revisione del manoscritto, e a R. Dresbeck per il montaggio. GT è
supportata da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health.

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Collegamenti online

BANCHE DATI

34/42
I seguenti termini in questo articolo sono collegati online a:

InterPro: http://www.ebi.ac.uk/interpro/ dominio P

LocusLink: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/ AP-1 | AP-2 | AP-4 | BRI | CK2 | filamin |


IGF1 | MAPK | PP2A | proteina chinasi C | TGF-β | TNF

OMIM: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/ Morbo di Alzheimer | demenza britannica


familiare | demenza danese familiare | artrite reumatoide

Swiss-Prot: http://www.expasy.ch/ ADAM10 | ADAM17 | ADAMTS-4 | APP | APRILE | ARF1 |


ATR | BAFF | BMP-4 | CI-MPR | CPD | EDAR | EF | Furin | gelsolin | GGA3 | HA | IGF1R |
KIF13A | Lefty-2 | LF | MMP2 | MT1-MMP | β-NGF | Nodale | PA | PACE4 | PACS-1 | PC5 / 6A |
PC5 / 6B | PC7 | RAB6 | β-secretasi | SMAD2 | SNX-15 | Sortilin | TGF-β1 | TNF-α

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