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Farmacología I
Guión de Prácticas
Facultad de Química, UNAM
Farmacología I
Guión de Prácticas

Andrés Navarrete Castro


Liana Medina Cruz
José Luis Balderas López

Facultad de Química, UNAM


Departamento de Farmacia
Clave de la materia 1408
Primera Edición 2008
D.F. Ó UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán,
C.P. 04510, México, Distrito Fedeal.

ISBN en trámite

Prohibida la reproducción parcial o total por cualquier medio


sin autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales.

Impreso y hecho en México


Este material se desarrolló con el apoyo del

Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la


Enseñanza (PAPIME) con la clave PE205306

Proyecto: Desarrollo de procedimientos para la enseñanza de la Farmacología


Experimental basada en el principio de las 3Rs: Reducción, Refinamiento y
Reemplazo de animales de laboratorio.

El contenido de este material fue revisado por los profesores de Laboratorio de


Farmacología I del semestre 2007-1.
Índice

Prácticas

1.  Marco conceptual del laboratorio de Farmacología............................................................9

2.  Determinación de la ventana de actividad biológica y la dosis efectiva 50


   en un sistema simulado........................................................................................... 13

3.  Determinación de la concentración letal 50 (CL50)


   del dicromato de potasio en Artemia salina..................................................................17

4.  Determinación de parámetros farmacocinéticos en un modelo de vidrio................................. 23

5.  Determinación experimental de la dosis efectiva 50 (DE50) sedante en ratones....................... 29

6.  Influencia de la vía de administración sobre la respuesta farmacológica................................... 35

7.  Excreción renal de ácido acetilsalicílico en voluntarios.......................................................39

8.  Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema simulado................................ 43

9.  Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema de órgano aislado..................... 49

Apéndices

Apéndice I. Tabla de conversión de proporción a unidades Probit............................................57

Apéndice II. Técnicas de manejo e identificación de animales de laboratorio (rata y ratón).............. 59

Apéndice III. Formato de Consentimiento informado.............................................................65

Apéndice IV. Instructivo para el uso del polígrafo Biopac System MP-100................................. 67
1. Marco conceptual del laboratorio de Farmacología

La Farmacología es una ciencia experimental por excelencia. Los métodos utilizados para evaluar la seguridad y la
eficacia de los fármacos utilizan sistemas biológicos que van desde fragmentos celulares o macromoléculas aisladas
hasta poblaciones enteras. En gran parte del proceso de investigación farmacológica se utilizan animales de
laboratorio íntegros. Sin embargo, la creciente sensibilidad respecto a la práctica de la experimentación en
animales en la investigación y en la enseñanza de las Ciencias Biomédicas, y la búsqueda de enfoques nuevos
en los aspectos prácticos de la misma son parte de un debate actual (Jukes y Chiuia, 2003).

La utilización de animales de experimentación en la enseñanza de las prácticas de diferentes asignaturas de las


Ciencias Biomédicas y en especial de la Farmacología, ha venido siendo la metodología más empleada por
todos los profesores de esta disciplina. Gracias a la utilización de estos animales, los estudiantes han podido
apreciar los diferentes efectos y los principios de la acción farmacológica. Entre las prácticas clásicas que se han
realizado en la mayoría de los laboratorios de Farmacología, algunas de ellas tienen un componente importante de
crueldad y son de poca aceptación por algunos de los estudiantes. Una de las prácticas que no se puede aceptar
es la determinación de la dosis letal 50 (DL50) en ratas o ratones, cuya utilidad está en duda como parámetro
para estimar la seguridad de los fármacos y sustancias nuevas. Es obvio que el uso de animales era el único
método del que disponían los profesores hace algunos años para enseñar esta materia. Pero en los últimos años
el avance de la informática, de las tecnologías de la imagen y la disposición de líneas celulares ha permitido el
desarrollo de numerosas alternativas que no requieren el uso de los animales para lograr los objetivos docentes
que se plantean en las prácticas de laboratorio de Farmacología (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell,
2003; Eder et al., 2006).

Los métodos utilizados en la investigación, para la evaluación de la seguridad y/o toxicidad y en la enseñanza
están en continuo progreso, ya que los científicos están en permanente búsqueda de posibles alternativas que
mejoren la calidad de su trabajo. Ello es debido, en parte, a la lógica evolución de los conocimientos
científicos y de sus aplicaciones tecnológicas y, en parte, a consideraciones éticas, logísticas, económicas,
sociopolíticas y legales (Sterling y Rispin, 2002).

El número de animales utilizados en Europa con fines educativos es relativamente pequeño comparado con el
total empleado en investigación y se ha venido reduciendo en los últimos años, pero a pesar de ello todavía se
puede reducir más. En México, el uso de animales en docencia es alto, aunque no se cuenta con datos precisos
de cuántos se sacrifican en cada ciclo escolar. Por otro lado, la aplicación de la Norma Oficial Mexicana
(NOM-062-ZOO-1999) ha sido lenta en los laboratorios de enseñanza de las Ciencias Biomédicas. En
cambio, en el artículo 25 de la Convención Europea para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados
en Experimentación y otros Fines Científicos se especifica: “aquellos procedimientos llevados a cabo con
fines educativos o de entrenamiento… se deben restringir a los absolutamente necesarios para los fines relativos a
la enseñanza y el entrenamiento y se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos por
métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente efectivos”. En las legislaciones relacionadas con la
protección de los animales de todos los países de la Comunidad Europea se considera fundamental aplicar el
principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (Russell y Burch, 1959). Este principio indica
12 Dr. Andrés Navarrete Castro

la necesidad de Reemplazar los animales de experimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que
el nuevo sistema aporte el mismo grado de información, de Reducir el número de animales de experimentación
cuando su uso sea necesario y se presente como el único método válido y, finalmente, de Refinar las técnicas
empleadas con los animales, con el fin de mejorar su eficacia o disminuir el dolor o el grado de sufrimiento
infligido (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003).

En el caso de la docencia, se plantea el reemplazo de los animales de experimentación por otros métodos. Entre
los procedimientos propuestos se pueden citar:

a) Modelos, maniquíes y simuladores mecánicos.


b) Películas y videos.
c) Simulaciones de ordenador y sistemas de realidad virtual.
d) Autoexperimentación en el propio individuo.
e) Experimentos con vegetales, incluyéndose hongos y algas.
f) Uso de material procedente de los rastros.
g) Estudios in vitro con líneas celulares, organismos inferiores como bacterias, nematodos, insectos o peces
en etapa temprana.
h) Aprovechamiento de animales muertos de forma natural o utilizados después de un procedimiento
científico (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003).
En el Laboratorio de Farmacología I se plantea el desarrollo de procedimientos experimentales y actividades en los
que, bajo el principio de las “tres erres”, se reduzca, se reemplace y se refine el uso de animales de labo-
ratorio para cubrir los objetivos de la enseñanza experimental de la Farmacología.

Considerando lo anterior, en el laboratorio de Farmacología se realizarán actividades de distintos tipos:

1) Simulaciones. Se realizarán recreaciones en la computadora que permita a los estudiantes la comprensión


de aspectos que, sin la necesidad de repetir muchos experimentos, puedan comprender los conceptos
y los procedimientos para definir parámetros farmacológicos.
2) Prácticas. Desarrollo de prácticas sencillas, con lo que se pretende conozcan técnicas y hábitos del
laboratorio de Farmacología.
3) Demostraciones. En esta categoría se realizan experimentos, que debido a las siguientes razones no es
posible que la realicen los estudiantes en forma individual o en grupos pequeños:
a. El experimento requiere de cierta destreza que en una o dos sesiones no es posible que las aprenda
el estudiante.
b. La existencia de equipo de laboratorio en número reducido.
c. El tiempo limitado para la sesión de laboratorio.
4) Autoexperimentación. Sin poner en riesgo en ningún grado la integridad y la salud de los estudiantes, se realizará
una práctica para observar algunos procesos farmacocinéticos de un fármaco (Ácido acetilsalicílico).
Cualquiera que sea la modalidad que se realice, cada uno de ellos debe comprender las siguientes partes:
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 13

familiarización, ejecución y discusión del procedimiento.

Con ello se pretende:

• Facilitar el aprendizaje de los aspectos fundamentales de la Farmacología.


• Familiarizar a los estudiantes con el método científico en experimentos de esta disciplina.
• Enseñar técnicas y hábitos del laboratorio de Farmacología.
• Motivar a los futuros farmacéuticos hacia la investigación y el estudio de la Farmacología como área
de desarrollo profesional.

Bibliografía

• Eder C, Falkner E, Nehrer S, Losert U y Schoeffl H. (2006). Introducing the concept of the 3Rs
into tissue engineering research. Altex-Alternativen Zu Tierexperimenten. 23:17-23.
• Jukes N, Chiuia M. (2003). From Guinea Pig to Computer Mouse. 2ª Edición. InterNICHE.
Londres.
• Meyer B, Ferrigni N, Putnam J, Jacobsen L, Nichols D, McLaughlin J. (1982). Brine Shrimp:
A convenient general bioassays for active plant constituents. Planta Medica. 45:31-34.
• Russell W, Burch R. (1959). The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen,
Londres.
• Tallarida R. (2000). Drug synergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC.
EUA.
• Van der Valk J, Dewhurst D, Hughes I, Atkinson J, Balcombe J, Braun H, Gabrielson K, Gruber
F, Miles J, Nab J, Nardi J, Van Wilgenburg H, Zinko U y Zurlo J. (1998). Alternatives to
the use of animals in higher education. ATLA 27:39-52
• Vinardell P. (2003). Alternativas al uso de animales de experimentación en las prácticas de
fisiología. Boletín de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas. 6 (1).
2. Determinación de la ventana de actividad biológica
y la dosis efectiva 50 en un sistema simulado

Número de sesiones sugeridas: 1 sesión (ejecución y análisis).


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría, curva dosis-respuesta cuantal.

I. Introducción

Dentro de las Ciencias Biológicas, entre ellas la Farmacología, los animales muchas veces tienen un papel central
en las clases prácticas en el laboratorio. Cientos de millones son usados para experimentos o sacrificados para
su disección cada año en todo el mundo.
La visión actual del uso de animales es una educación completamente humana, donde los objetivos de la enseñanza
son alcanzados usando métodos alternativos, y donde la compasión, el respeto a la vida y el pensamiento crítico son
valorados y desarrollados. Es una visión donde los alumnos tienen libertad de conciencia y la relación negativa con los
animales ha sido transformada al pensamiento positivo en lugar de hacer un uso dañino (Jukes y Chiuia, 2006).
Un gran número de compuestos y fármacos cuenta con la determinación experimental de los valores de
dosis efectiva 50 (DE50), dosis tóxica 50 (DT50) y dosis letal 50 (DL50). El cálculo de este parámetro se
puede predecir mediante ecuaciones que explican el fenómeno farmacológico (Tallarida, 2000). Utilizando
los valores descritos en la literatura es posible simular la adición de diferentes dosis o concentraciones de
diferentes fármacos en un sistema en computadora, donde el alumno podrá construir curvas dosis-respuesta y,
por lo tanto, determinar la DE50, sin el uso de animales de laboratorio.

II. Objetivos

Los objetivos de esta práctica son:


1. Determinar la ventana de actividad biológica de fármacos mediante el uso de un sistema simulado.
2. Aprender el uso de un sistema simulado en computadora.
3. Calcular la DE50 de una serie de fármacos por medio de la ecuación de Hill, con los datos obtenidos en
el sistema simulado.

III. Material
a) Software
• Se utilizará el software SimCDR ver. 1.0 desarrollado ex profeso para la práctica por el M en C
José Luis Balderas, de la Facultad de Química de la UNAM.
El software puede ser descargado del siguiente vínculo:
http://www.paginasprodigy.com/luisbald
Este programa deberá ser instalado en una PC o compatible con Microsoft Windows 98 o posterior.
16 Dr. Andrés Navarrete Castro

IV.  Procedimiento
a) Manejo del software SimCDR ver. 1.0
Para el uso adecuado del software se dividirá su manejo por procedimiento con referencia al esquema siguiente:

1) Inicio del programa y ejecución de un nuevo experimento simulado.


a) Para iniciar el programa se deben oprimir los siguientes iconos:
b) En la casilla de Fármaco se selecciona el fármaco que se utilizará en la simulación. En la ventana
Información del fármaco aparecerán una breve descripción del mismo, así como su actividad
farmacológica más importante.
c) Se selecciona el número de dosis así como las unidades que se emplearán, en las casillas Núm. de
dosis y Unidades, respectivamente.
d) Se llenan las casillas que aparecen en la ventana Dosis a probar y se oprime el botón Calcular el %
de efecto. Si alguna de las casillas anteriores está en blanco, aparecerá un mensaje de error.
e) En la ventana Resultados aparecerán las dosis que se administraron simuladamente y los porcentajes de
respuesta que darían.
f) Para iniciar un nuevo experimento simulado, se deberá oprimir el botón Borrar datos o, si se prefiere,
cambiar los datos en las casillas correspondientes.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 17

V. Análisis de Resultados

1. Con los datos obtenidos en los experimentos simulados:

a) Construir las curvas dosis-respuesta de los fármacos utilizados.


b) Calcular la DE50 para la actividad principal de los fármacos utilizados mediante la Ecuación de Hill.
VI. Bibliografía

• Tallarida R. (2000). Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC.
EUA.
• Jukes N, Chiuia M. (2003). From Guinea Pig to Computer Mouse. 2ª Edición. InterNICHE.
Londres.
3. Determinación de la concentración letal 50 (CL50)
del dicromato de potasio en Artemia salina

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis)


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría, curva dosis-respuesta cuantal.

I. Introducción

Un bioensayo puede ser definido como cualquier prueba que involucra organismos vivos; a su vez, se puede
señalar como cualquier método por medio del cual alguna propiedad de una sustancia o material, es medida en
términos de la respuesta biológica que produce. La relación entre la respuesta biológica y la dosis o la
concentración de una sustancia activa se relaciona en la llamada curva dosis-respuesta. Esta vinculación puede
darse de forma graduada o la respuesta puede ser de tipo todo o nada, también conocida como cuantal.

En esta práctica se realizará un experimento en que se analizará el segundo tipo de relación curva dosis-
respuesta, es decir, se analizará la curva dosis-respuesta cuantal, que debido a la forma en la que se realizará,
propiamente se debe referir como la curva concentración-respuesta cuantal. Se utilizará como sistema biológico
el crustáceo Artemia salina en su forma adulta y como larva o nauplio, y como sustancia de prueba al
dicromato de potasio.

II. Objetivos

Los objetivos de esta práctica son:

1. Manejar un sistema biológico alterno a los mamíferos y roedores para la determinación de una curva
concentración-respuesta cuantal.

2. Realizar el cálculo de la CL50 mediante el análisis Probit.

III. Material

1. Utilizando Artemia salina adulta.

a) Material biológico
• De 100 a 200 ejemplares adultos de Artemia salina.
b) Materiales, cristalería y equipo
• Un vaso de precipitado de 500 mL
• Una pipeta graduada de 2 mL
• Una pipeta volumétrica de 10 mL
20 Dr. Andrés Navarrete Castro

• 24 frascos viales marcados para un volumen de 5 mL


• Una lámpara de escritorio.
• Una Pipeta Pasteur con bulbo
• Aereador con manguera y filtro
c) Reactivos
• 100 mL de disolución de dicromato de potasio, K2Cr2O7 (50 mg/mL).
Disolver 5 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar a un
volumen de 100 mL con agua destilada.

2. Utilizando nauplios de Artemia salina.

a) Material biológico
• Huevecillos liofilizados de Artemia salina.
b) Materiales, cristalería y equipo
• Pecera de vidrio capacidad 2 L
• Pecera de 500 mL
• 24 frascos viales marcados para un volumen de 2 mL
• Pipetas de vidrio
• Jeringas de 1 mL
• Foco sumergible de 5 W
• Termómetro para pecera
• Matraz Erlenmeyer de 1 L
• Vasos de precipitados de 100, 500 mL
• Cinco Pipetas Pasteur con bulbo
• Aereador con manguera y filtro
c) Reactivos
• 100 mL de disolución de dicromato de potasio, K2Cr2O7 (50 mg/mL).
Disolver 5 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar a un
volumen de 100 mL con agua destilada.

• 100 mL de disolución de dicromato de potasio, K2Cr2O7 (12.5 mg/mL).


Disolver 1.25 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar a
un volumen de 100 mL con agua destilada.

• 500 mL de agua de mar artificial.


Disolver 16 g de sal marina (o en su defecto cloruro de sodio, NaCl) en 500 mL de agua y
colocar dos gotas de anticloro. Dejar reposar por 10 minutos y filtrar si es necesario.

• Anticloro (tiosulfato de sodio, Na2S2O3, al 1 %).


Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 21

IV. Procedimiento

1. Utilizando la Artemia salina Adulta.

a) Preparación de la Artemia salina


1) Mantener a la Artemia salina en el vaso de precipitado con aeración constante.
2) Por triplicado rotular los frascos viales con las siguientes concentraciones: 0, 4, 6, 8, 10, 12, 16 y
20 mg/mL y, coloque una marca a un volumen de 5 mL.
3) Colocar 10 artemias en cada vial con ayuda de la pipeta Pasteur como se muestra en la figura siguiente.
Utilice la luz de una lámpara como fondo para facilitar el conteo. La cantidad total de agua que resulta
de la adición de las artemias debe ser de aproximadamente 1 mL, si es necesario retire el excedente.

Artemia Salina

b) Adición del dicromato de potasio


1) Adicionar las siguientes cantidades de dicromato de potasio indicadas en la siguiente cuadro:

Volumen de la disolución
Concentración (mg/mL)
de dicromato de potasio (mL)
0 (Control) 0
4 0.4
6 0.6
8 0.8
10 1.0
12 1.2
16 1.6
20 2.0
22 Dr. Andrés Navarrete Castro

2) Inmediatamente después de la adición de la solución de dicromato de potasio se incorpora la cantidad


necesaria de la solución de agua de mar para llegar a un volumen final de 5 mL.

3) Dejar durante una hora en exposición bajo luz blanca.

c) Lectura de resultados

1) Al término del periodo de exposición se contarán las artemias que sobrevivieron de la siguiente manera:
a. Las artemias que presentan movimiento, aunque sea mínimo, se consideran vivas.
b. Las artemias que permanecen inmóviles, se consideran muertas.
2. Utilizando nauplios de Artemia salina.

a) Incubación de los huevecillos de la Artemia salina


1. Se arma el dispositivo de incubación como se muestra en la siguiente figura.

Pecera con dispositivos de incubación (1), aeración (2) e iluminación (3).


2. Se colocan 300 mL de agua de mar artificial en la pecera de incubación.

3. Colocar una cantidad de agua corriente en la pecera mayor, aproximadamente a una temperatura de 26-
28°C y dejar que alcance el equilibrio con el agua de la pecera de incubación.

4. Conectar los dispositivos de aeración y luz.

5. Adicionar los huevecillos en la pecera de incubación con una espátula limpia y seca (aproximadamente
10 µg de huevecillos), colocar en la zona obscura de la pecera de 500 mL. Dejar incubar durante 48 h.

b) Preparación de los viales y realización del experimento.


A partir de este momento se seguirán los pasos a), b) y c) del experimento llevado a cabo con
artemias adultas, colocando en lugar de éstas a los nauplios. Utilizar la disolución de 12.5 mg/mL
de dicromato de potasio, las concentraciones finales serán 0, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, y 5 mg/mL
respectivamente.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 23

V. Análisis de resultados

1. Se tabulan los datos obtenidos en el siguiente cuadro:


REPETICIONES DEL EXPERIMENTO
CONCENTRACIÓN DATOS FINALES
1 2 3
(mg/mL)
ni ri ni ri ni ri Σ ni Σ ri pi yi

CONTROL

ni = número de artemias utilizadas por concentración por cada repetición Σ ni = número de artemias totales utilizadas por concentración
ri = número de artemias muertas por concentración por cada repetición Σ ri = número de artemias totales muertas por concentración
pi = probabilidad por concentración (pi = Σ ri / Σ ni) yi = unidad probit calculada por tablas a partir de pi
Nota: Recuerde que las concentraciones utilizadas varian de acuerdo al estado de madurez de la artemia utilizada.

2. Con los resultados obtenidos:

• Construya la curva concentración-respuesta cuantal para el dicromato de potasio.


• Calcule la CL50 y sus límites de confianza del dicromato de potasio por medio del análisis Probit.
Utilice la tabla de conversión de proporción a unidades Probit del Apéndice I.
3. Con la gráfica realizada y los valores calculados analice:

• Los datos encontrados con respecto a los datos informados en la literatura.


• Las ventajas y desventajas de los bioensayos con respecto a los ensayos con organismos superiores.

VI. Bibliografía

• Infante S y Calderón L. (1994). Manual de análisis probit. Colegio de Posgraduados. México.


• McLaughlin J. (1991). Crow gall tumors on potato disc and Brine Shrimp lethality; two simple
bioassay for higher plant screening and fractionation. Methods in Plant Biochemistry. Volume 6.
Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA: 1-30.
• Tallarida R. (2000). Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC.
New York.
4. Determinación de parámetros farmacocinéticos
en un modelo de vidrio

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis)


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, cálculo de parámetros farmacocinéticos

I. Introducción

La Farmacocinética es la rama de la Farmacología que estudia el curso temporal de los fármacos a través del
organismo. Comprende los procesos de absorción, distribución y eliminación de los fármacos. Este último, a
la vez, comprende los procesos de excreción y biotransformación.

La curva de concentración en función del tiempo se utiliza para determinar los parámetros farmacocinéticos. La
forma de la curva concentración-tiempo y los indicadores que se calculan a partir de ella, dependen de la vía de
administración y del fluido biológico en el que se lleve a cabo el muestreo y análisis del fármaco. Después
de una administración intravenosa es posible determinar los parámetros farmacocinéticos: constante de eliminación
(k), volumen aparente de distribución (Vd), concentración plasmática al tiempo cero (Cp°), depuración total
(ClT), área bajo la curva (ABC) y el tiempo de vida media (t½). Para cuando el fármaco se administra por
una vía que requiere de un proceso de absorción, es decir, el paso del sitio de aplicación a la circulación general,
se pueden calcular los parámetros farmacocinéticos: constante de absorción (ka), concentración plasmática
máxima (Cpmax), tiempo al que se alcanza la concentración plasmática máxima (tmax), además de k, t½ y ABC.

En esta práctica, mediante el uso de un modelo de vidrio es posible hacer una simulación de la administración
del fármaco por vía intravenosa o por otra que requiere de un proceso de absorción. También es posible simular
la toma de muestras en sangre y en orina y, con ello, realizar los cálculos de los parámetros farmacocinéticos
correspondientes a dichas simulaciones.

II. Objetivos

Los objetivos de esta práctica son:

1. Utilizar un modelo de vidrio para simular la administración de fármacos por las vías intravascular y extravascular.
2. Calcular los parámetros farmacocinéticos para la administración intravascular y extravascular.
3. Comparar el comportamiento cinético del fármaco en función de la vía de administración.

III. Material
a) Materiales, cristalería y equipo
• Dos vasos de precipitado de 500 mL con brazo recto
• Pipeta graduada de 5 mL
26 Dr. Andrés Navarrete Castro

• Perilla
• Dos vasos de precipitado de 500 mL
• Un vaso de precipitado de 100 mL
• Seis matraces volumétricos de 10 mL
• Un matraz volumétrico de 25 mL
• Una pipeta volumétrica de 1 mL
• Dos placas de agitación
• Dos soportes universal
• Dos pinzas con nuez
• Un embudo de separación de 1 L
• Un anillo para soporte universal
• Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL
• Un cronómetro
• 24 Tubos de ensayo
• Cuatro litros de agua corriente
• Dos barras magnéticas de agitación
• Dos agitadores magnéticos
• Balanza analítica
• Espectrofotómetro
b) Reactivos
• Disolución de Rojo Congo (4 mg/mL)
Disolver 100 mg del colorante Rojo Congo en 15 mL de agua y aforar a un volumen de 25 mL
con agua destilada.

IV. Procedimiento

1. Vía intravascular
a) Colocar el material de acuerdo al siguiente esquema:
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 27

b) Colocar agua corriente en el embudo de separación, mantener el mismo volumen durante todo el
experimento.
c) Mantener la agitación constante en el vaso de precipitado A.
d) Medir la velocidad de flujo del goteo y llevarla a un flujo constante de 20 mL/min.
e) Adicionar agua corriente al vaso de precipitado A, llevándolo a un volumen muy cercano para que se
inicie el goteo.
f) Adicionar 5 mL de la disolución del colorante al vaso de precipitado A. El momento en que inicia el
goteo del vaso se toma como referencia para la toma de muestras.
g) Cuando inicia el goteo, inmediatamente se toma una muestra de 2 mL del vaso A.
h) Se deja correr el experimento y se toman muestras de 2 mL del vaso A de acuerdo a los tiempos
indicados en el siguiente cuadro.

Vía intravascular
Tiempo Vaso A
(min) Absorbancia Concentración (mg/mL)
Control
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
60
75
90
120

2. Vía extravascular

a) Colocar el material de acuerdo al siguiente esquema:


28 Dr. Andrés Navarrete Castro

b) Colocar agua corriente en el embudo de separación, mantener el mismo volumen durante el experimento.
c) Mantener la agitación constante en los vasos de precipitado.
d) Medir la velocidad de flujo del goteo y llevarla a un flujo constante de 20 mL/min.
e) Adicionar agua corriente a los vasos de precipitado, llevándolos a un volumen muy cercano para que
inicie el goteo.
f) Agregar 5 mL de la solución del colorante al vaso de precipitado A. La hora en que inicia el goteo
del vaso A al B se toma como referencia para la toma de muestras.
g) Cuando inicia el goteo se toma una muestra de 2 mL del vaso A y del B.
h) Se deja correr el experimento y se toman muestras de 2 mL del vaso A y B de acuerdo al cuadro siguiente.

Vía intravascular
Vaso A Vaso B
Tiempo
(min) Concentración Concentración
Absorbancia Absorbancia
(mg/mL) (mg/mL)
Control
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
60
75
90
120

3. Determinación de las concentraciones del colorante

a) Realizar una curva estándar del pesando 1 mg del colorante, disolverlo en agua destilada, aforar a 10
mL y continuar como se indica en el esquema siguiente:
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 29

b) Leer las absorbancias de la curva estándar y de las muestras obtenidas en los experimentos en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 490 nm.

Curva estándar de rojo congo


Concentración
Tubo Absorbancia
(mg/mL)
Blanco 0
1 3.125
2 6.25
3 12.5
4 25
5 50
6 100

c) Determinar la concentración de las muestras interpolando el valor de las lecturas en la curva estándar.
V. Análisis de resultados

1. Elaborar una gráfica por cada vía de administración, considerando el logaritmo natural de la concentración
[µg/mL] contra tiempo [min].

2. Calcular los parámetros farmacocinéticos t½, Vd, k, ka, ClT, Cpmax, tmax ABC; según la vía de administración
simulada.

3. Analizar la importancia de los modelos farmacocinéticos in vitro y de los parámetros farmacocinéticos


calculados

VI. Bibliografía

• Gumtow R, Proudfoot J y Talada A (1989). An in vitro pharmacokinetic system for use in the
undergraduate pharmaceutics laboratory: a one- and two-compartment pharmacokinetic Bench
Model; the glassman patient. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, 20(3):25-30.
• Rowland M y Tozer T (1995). Clinical pharmacokinetics 3rd Ed. Lea and Febiger. EUA.
• Shargel L, Wu-Pong S y Yu A (2004). Applied biopharmaceutics and Pharmacokinetics. 5th
Edition. McGraw-Hill Medical, EUA.
5. Determinación experimental de la dosis efectiva
50 (DE50) sedante en ratones

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis)


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría y Farmacodinamia.

I. Introducción

En esta práctica se utilizará un modelo sencillo basado en el comportamiento de los roedores al explorar un
ambiente extraño. El número de levantamientos sobre sus extremidades traseras está relacionado con un estado
de alerta. La disminución en esta conducta por la acción de un fármaco está relacionado con una actividad
tranquilizante y en varios trabajos de investigación se ha utilizado para medir el efecto sedante de los depresores
del Sistema Nervioso Central (Oliva et al., 2004; Ugalde et al., 2005; González-Trujano et al., 2006).

En esta práctica se contempla determinar la DE50 sedante de pentobarbital sódico y del etanol, utilizando el
modelo de Cilindro de Exploración en ratones.

II. Objetivo

El objetivo de esta práctica es:

1. Determinar la DE50 para el efecto sedante del pentobarbital y etanol en ratón, utilizando el modelo del
Cilindro de Exploración.

III. Material
a) Material biológico
• Ratones ICR ó CD1 machos de 25-30 g de peso
b) Materiales, cristalería y equipo
• Cilindro de exploración (cilindro de vidrio de 11 cm de diámetro interno por 30 cm de altura)
• Jeringas de 1 mL con aguja del número 27
• Balanza para pesar animales
• Marcador de tinta indeleble
• Papel
• Cronómetro
• Contador manual
• Matraz volumétrico de 10 mL
• Seis frascos viales de 10 mL
32 Dr. Andrés Navarrete Castro

c) Fármacos y reactivos
• Anestesal® (pentobarbital sódico 6.3 g/100 mL, uso veterinario). Pfizer.
• Disolución de Pentobarbital sódico 3 mg/mL.
Transfiera 0.47 mL de Anestesal® a un matraz volumétrico de 10 mL y llévelo al aforo con disolución
salina.
• Etanol absoluto.
• Disolución salina fisiológica (0.9%).
• Solución hidroalcohólica al 10%.
Transfiera 50 mL de etanol a un vaso de precipitados y llévelo a un volumen de 500 mL.

IV. Procedimiento

A. Efecto sedante de pentobarbital

a) Pesado y marcaje de animales


Cada grupo de trabajo recibirá seis ratones. Marque a sus animales con el marcador de tinta indeleble
en la base de la cola, péselos y registre el peso de cada animal.

b) Preparación de las disoluciones de pentobarbital sódico


Rotule seis frascos viales con las siguientes leyendas 0, 2.5, 5, 10, 15 y 30 mg/kg. Agregue la cantidad
indicada en el cuadro siguiente de la disolución de pentobarbital de 3 mg/mL y de disolución salina al
0.9%(p/v):

Volumenes a agregar (mL)


Dosis Concentración
Frasco vial Pentobarbital Disolución
(mg/kg) (mg/kg)
(mg/kg) salina
1 CONTROL 0 3 0
2 2.5 0.25 2.75 0.25
3 5 0.5 0.5 0.5
4 10 1 1 1
5 15 1.5 1.5 1.5
6 30 3 0 3

c) Administración del fármaco


Asigne aleatoriamente las dosis que recibirá cada ratón. Administre por vía intraperitoneal 0.1 mL de
la disolución correspondiente del fármaco o de la disolución salina por cada 10 g de peso del animal
y registre el tiempo al que lo administró.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 33

d) Desarrollo del experimento

Cilindro utilizado en la prueba de exploración.

1) Cerciórese de que el cilindro de vidrio está seco y limpio.

2) Coloque el cilindro sobre un trozo de papel mayor al diámetro del cilindro (pueden ser hojas
recicladas).

3) Treinta minutos después de haber administrado el fármaco o la solución salina introduzca al animal en el
cilindro de exploración.

4) Ponga a funcionar el cronómetro y registre el número de levantamientos que realiza el animal en un período de
5 minutos. Sólo una persona deberá cuantificar esta conducta para que sean analizados bajo el mismo
criterio.

5) Limpie con la solución hidroalcohólica el interior del cilindro y cambie el papel.

6) Continúe con el mismo procedimiento para los cinco animales restantes. No olvide limpiar el cilindro entre
cada prueba.

7) El animal que recibió la solución salina se toma como control.

Ratón Peso (g) Dosis Tiempo (h:min) Núm. de


(mg/kg) Admón. Inicio Final levantamientos
1 0 30 35
2 6 36 41
3 12 42 47
4 18 48 53
5 24 54 59
6 30 01:00 01:05

B. Efecto sedante de etanol

a) Preparación de las soluciones de etanol absoluto

Rotule seis matraces aforados de 10 mL con las siguientes leyendas 0, 500, 1000, 2000, 2500 y 3000
mg/kg. Agregue la cantidad indicada en el cuadro siguiente de etanol absoluto y afore con solución salina al
0.9% (p/v):
34 Dr. Andrés Navarrete Castro

Dosis Volúmenes a agregar (mL) Concentración


Frasco vial
(mg/kg) Etanol absoluto Disolución salina (mg/mL)
1 Control 0 10 0
2 500 0.63 9.37 50
3 1000 1.26 8.74 100
4 2000 2.52 7.48 200
5 2500 3.16 6.84 250
6 3000 3.8 6.2 300

b) Administración del fármaco


Asigne aleatoriamente las dosis que recibirá cada animal. Administre por vía intraperitoneal 0.1mL de la
solución correspondiente del fármaco o de la solución salina por cada 10 g de peso y registre el tiempo al que
lo incorporó.

c) Desarrollo del experimento


1) Cerciórese de que el cilindro de vidrio está seco y limpio.
2) Coloque el cilindro sobre un trozo de papel mayor a su diámetro (pueden ser hojas recicladas).
3) Cinco minutos después de haber administrado el fármaco o la solución salina introduzca al ratón en el
cilindro de exploración.

4) Registre el número de levantamientos que realiza el animal en un período de 5 minutos. Sólo una persona
deberá cuantificar esta conducta para que sean analizados bajo el mismo criterio.

5) Limpie con la solución hidroalcohólica el interior del cilindro y cambie el papel.


6) Continúe con el mismo procedimiento para los cinco ratones restantes. No olvide limpiar el cilindro entre cada
prueba.

7) El animal que recibió la disolución salina se toma como control.

Tiempo (h:min) Núm. de


Ratón Peso (g) Dosis (mg/kg)
Admón. Inicio Final levantamientos
1 0 5 10
2 6 11 16
3 12 17 22
4 18 23 28
5 24 29 34
6 30 35 40
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 35

V. Análisis de resultados

a) Cálculo de la DE50
1) Calcule el porcentaje de efecto por cada dosis, considerando que el número de levantamientos
promedio de los ratones control es igual al 0% de efecto.
2) Determine el modelo que siguen los datos obtenidos.
3) Calcule la DE50 para el efecto sedante de acuerdo al modelo determinado.
b) Cálculo de la potencia relativa
1) Calcule la potencia relativa del efecto sedante entre etanol y pentobarbital. Con la relación:
DE 50 Pentobarbital
Potencia relativa del Etanol(Pr EtOH)=
DE 50 Etanol

VI. Bibliografía

• González-Trujano M, Martínez A, Reyes A, Reyes B y Navarrete A. (2006). Palmitote isolated


from Annona diversifolia induces an anxiolytic-like effect in mice. Planta Medica. 72(8):703-
707
• Oliva I, González-Trujano M, Arrieta J, Enciso-Rodríguez R y Navarrete A. (2004).
Neuropharmacological profile of hydroalcoholic extract of Valerina edulis ssp. procera roots in
mice. Phytotherapy Research. 18(4):290-296.
• Tallarida R. (2000). Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC.
New York.
• Ugalde M, Reza V, González-Trujano M, Avula B, Khan I y Navarrete A. (2005). Isobolographic
analysis of the sedative interaction between six central nervous system depressant drugs and Valeriana
edulis hydroalcoholic extract in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 57:631-639.
6. Influencia de la vía de administración
sobre la respuesta farmacológica

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis)


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, vías de administración de fármacos.

I. Introducción

La respuesta farmacológica se puede ver modificada en función de la vía por la cual se administra el fármaco.
Esta transformación puede consistir en un simple retraso en la acción y, en otros casos, puede cambiar o anular
totalmente el efecto. Algunos pueden sufrir alteraciones en el sitio de aplicación, dando origen a nuevas
moléculas que no necesariamente van a presentar la misma reacción o van a seguir la misma farmacocinética.
En otros casos, debido a las propiedades fisicoquímicas, no es posible administrarlo por una vía determinada,
por ejemplo, un fármaco no soluble en soluciones acuosas no es posible administrarlo por vía intravenosa. Los
fármacos irritantes también limitan su aplicación por alguna vía determinada, así que la elección de la forma
de administración más adecuada es importante para lograr que se consiga el efecto deseado a una velocidad
y a una intensidad idóneas.

En esta práctica se evaluará la forma en la cual la vía de administración modifica la respuesta de un fármaco
bien caracterizado como el pentobarbital, para el cual se medirán el período de latencia y la duración del
efecto cuando se administra por distintos puntos.

II. Objetivos

Los objetivos de esta práctica son:

1. Determinar la influencia de la vía de administración en la acción farmacológica del pentobarbital.

2. Explicar el significado del período de latencia de la acción farmacológica del pentobarbital.

III. Material
a) Material biológico
• Cuatro ratas Wistar machos de 200-250 g de peso
b) Materiales, cristalería y equipo
• Jeringas de 1 y 3 mL
• Cánula para administración esofágica
• Balanza para pesar animales
• Cronómetro
38 Dr. Andrés Navarrete Castro

c) Fármacos y reactivos

• Anestesal ® (pentobarbital sódico 6.3 g/100 mL, uso veterinario). Pfizer.


• Disolución de Pentobarbital sódico 40 mg/mL.

Transfiera 6.35 mL de Anestesal ® a un matraz volumétrico de 10 mL y llévelo al aforo con


disolución salina. En el invierno use una disolución de 30 mg/mL: Transfiera 4.76 mL de Anestesal®
a un matraz volumétrico de 10 mL y llévelo al aforo con disolución salina.
• Disolución salina fisiológica (0.9%).

IV. Procedimiento

1) Pesado y marcaje de animales


Cada grupo de trabajo recibirá cuatro ratas. Marque a sus animales con el marcador de tinta indeleble,
péselos y registre el peso de cada uno.

2) Desarrollo del experimento


a) Asigne aleatoriamente el tratamiento que recibirá cada animal: vía oral, intraperitoneal, subcutánea o
intramuscular y anótelo en el cuadro de abajo. Administre 0.1 mL por cada 100 g de peso de la solución
del fármaco por la vía de administración que le corresponde a cada animal y registre el tiempo en el
cuadro de abajo.
b) Registre el tiempo en el cual el animal pierde el reflejo de enderezamiento, que se caracteriza por el
hecho que al ponerlo sobre su dorso no presenta resistencia para intentar volver a su posición natural.
Este tiempo se denomina Latencia.
c) La duración del efecto corresponde al tiempo entre la pérdida del reflejo de enderezamiento y el lapso
en el cual el animal vuelve a su posición natural.
d) Cubra al animal con un lienzo de franela para reducir la hipotermia producida por el fármaco.
e) Registre sus datos en el cuadro siguiente.

Efecto
Volumen a Tiempo de Tiempo de
Rata Peso Vía de
administración administración administración
Núm. (g) administración Inicio Término Duración
(mL) (min) (min)
(min) (min) (min)

4
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 39

V. Análisis de resultados
a) Construya una gráfica para el período de latencia y otro para la duración del efecto en función de la
vía de administración.
b) Realice el análisis estadístico correspondiente para indicar si hay o no influencia de la vía de administración
en el efecto del pentobarbital.

VI. Bibliografía

• Rowland M y Tozer T. (1995). Clinical pharmacokinetics. 3rd Edition. Lea and Febiger, EUA.
• Shargel L, Wu-Pong S y Yu A. (2004). Applied biopharmaceutics and Pharmacokinetics. 5th
Edition. McGraw-Hill Medical, EUA.
7. Excreción renal de ácido acetilsalicílico en voluntarios

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis)


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, excreción de fármacos

I. Introducción

La eliminación de fármacos comprende dos procesos: la excreción y la biotransformación. La excreción


renal es la principal vía como se desecha gran cantidad de fármacos. Cuando existe una disminución en la
eliminación por esta forma puede tener complicaciones importantes, ya que se debe modificar el esquema de
dosificación y la dosis.

En esta práctica se determinará la eliminación de un fármaco común, el ácido acetilsalicílico, cuantificando en


la orina la cantidad de salicilatos totales excretados después de la administración de dos tabletas de 500 mg
de este fármaco en voluntarios sanos.

II. Objetivos

Los objetivos de esta práctica son:

1. Identificar a la excreción renal como uno de los procesos principales de la eliminación de fármacos.

2. Determinar la eliminación por excreción renal del ácido acetilsalicílico en voluntarios sanos, así como
identificar los factores que influyen en la misma.

III. Material
a) Sujetos de estudio
Criterios de inclusión: Voluntarios adultos jóvenes sanos, de 18 a 20 años de edad, de 55-65 kg
de peso, preferentemente del género masculino.

Criterios de exclusión: No entrarán en el grupo personas con problemas gastrointestinales (úlcera


gastroduodenal, gastritis), historia de alergias, problemas en su función renal o intolerancia a salicilatos,
mujeres con problemas de hemorragias menstruales, ni sujetos que hayan tomado salicilatos en las
últimas 24 horas. Cualquiera de estas contingencias debe ser informada al profesor.

Todos los voluntarios deberán contar con el formato de Consentimiento informado, firmado por
el voluntario, un testigo y los profesores de laboratorio. El original lo entregarán a su profesor y
conservarán una copia (ver Apéndice III).
42 Dr. Andrés Navarrete Castro

b) Materiales, cristalería y equipo


• Un matraz Erlenmeyer de 100 mL
• Cinco matraces Erlenmeyer de 50 mL
• Una gradilla
• 10 tubos de ensayo de 10 mL
• Una pipeta graduada de 5 mL
• Una pipeta graduada de 1 mL
• Una pipeta graduada de 10 mL
• Una probeta de 500 mL
• Dos vasos de precipitado de 50 mL
• Dos vasos de precipitado de 250 mL
• Un vaso de precipitado de 500 mL
• Un matraz volumétrico de 25 mL
• Seis matraces volumétricos de 10 mL
• Placa de calentamiento
• Cronómetro
• Espectrofotómetro
• Potenciómetro
c) Fármacos y reactivos
• Agua potable
• Tabletas de ácido acetilsalicílico de 500 mg
• Salicilato de sodio
• Reactivo de Trinder para salicilatos
Se disuelven 10 g de cloruro mercúrico en 200 mL de agua destilada caliente. Cuando la disolución
es completa, se enfría y se añaden 30 mL de ácido clorhídrico 1 N. Posteriormente se disuelven 10 g de
nitrato férrico en la disolución y se afora a 250 mL con agua destilada.
• Amoniaco acuoso (hidróxido de amonio)
• Disolución de ácido clorhídrico 0.1 N

IV. Procedimiento
a) Preparación y toma de muestras
Rotular cinco matraces Erlenmeyer (donde se colocarán las muestras de orina) y cinco tubos de ensayo
con los tiempos 0, 40, 60, 80 y 100 minutos. Anotar en el cuadro adjunto la hora en la cual se
realizarán cada una de las tareas.

Obtención de la muestras se realizará de acuerdo con el cuadro siguiente.


Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 43

Tiempo
Hora Actividad a realizar
(min)
Desechar la primera orina.
Tomar 750 mL de agua potable.
Colectar la orina (mínimo 100 mL). Ésta será la orina basal.
Medir su volumen y anotarlo.
Tomar dos tabletas de ácido acetilsalicílico de 500 mg en un volumen de agua igual al
orinado.
0
a) Poner 30 mL de esta muestra en un vaso de precipitados. Ajustar el pH a 7
± 0.5 con Amoniaco acuoso y/o HCl al 0.1 N.
b) De esta muestra pasar 0.5 mL al tubo de ensayo correspondiente a los cero
minutos.
Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo.
40 Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo etiquetado con 40
minutos.
Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo.
60 Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo rotulado con 60
minutos.
Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo.
80 Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo etiquetado con 80
minutos.
Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo.
100 Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo rotulado 100
minutos.

b) Análisis de salicilato en orina


Para cada muestra de orina se cuantifica la cantidad de salicilatos excretados de acuerdo al siguiente
procedimiento.

1) Calentar a ebullición los tubos de ensayo con las muestras durante 10 minutos.

2) Enfriar los tubos con agua fría

3) Añadir al tubo 2.5 mL de reactivo para salicilatos. La reacción da un color cuantificable por
espectrofotometría a 525 nm.

4) Realizar una curva estándar pesando 10 mg de salicilato de sodio, disolverlo en agua destilada, aforar a
10 mL y continuar como se indica en el cuadro siguiente, utilizando matraces volumétricos de 10 mL:
44 Dr. Andrés Navarrete Castro

Volumen (mL) de disolución


Concentración
Tubo núm. stock de salicilato de sodio Absorbancia
(µg/mL)
(1 mg/mL)
1 0 0
2 0.25 25
3 0.5 50
4 1 100
5 2 200
6 3 300

5) La muestra a tiempo cero será utilizada como blanco.

6) Interpolar los valores de absorbancia de las muestras en la curva estándar para obtener la
concentración de salicilatos en la muestra.

7) Los resultados obtenidos se anotarán en el siguiente cuadro.

Cantidad excretada
Tiempo Volumen Concentración Cantidad excretada
Muestra pH Absorbancia acumulada de
(min) (mL) (µg/mL) de salicilatos (µg)
salicilatos (µg)
Blanco 0
2 40
3 60
4 80
5 100

V. Análisis de resultados

1) Construya una gráfica de cantidad excretada acumulada de salicilatos contra el tiempo y calcule la constante
de excreción.

2) Calcule el porcentaje de fármaco excretado por orina en 100 minutos y compárela con la de otros
voluntarios.

VI. Bibliografía

• Rowland M y Tozer T. (1995). Clinical pharmacokinetics. 3rd Edition. Lea and Febiger. EUA.
• Shargel L, Wu-Pong S, y Yu A. (2004). Applied biopharmaceutics and pharmacokinetics. 5th
Edition. McGraw-Hill Medical, EUA.
8. Demostración del efecto sinergista
y antagonista en un sistema simulado

Número de sesiones sugeridas: 1 sesión (ejecución y análisis)


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacodinamia, agonistas y antagonistas;
Farmacometría, relación dosis-respuesta gradual.

I. Introducción

Las lecciones prácticas son una parte importante de la enseñanza de la Farmacología en diversas áreas como la
Medicina, la Enfermería y la Farmacia. Los experimentos in vivo e in vitro han sido ampliamente utilizados en
las lecciones prácticas para ayudar a los estudiantes a adquirir habilidades en los experimentos farmacológicos,
reforzando su conocimiento aprendido con las clases teóricas y los libros.

Aunque los experimentos tradicionales en animales vivos son invaluables, tienen desventajas: alto consumo de
tiempo, dinero y sacrificio de ejemplares; sólo puede probarse un número limitado de fármacos en un tiempo
y requieren frecuentemente de un trabajo constante e intenso.

Una variedad de software ha sido desarrollado para la enseñanza de la Farmacología en pregrado y posgrado.
Evidencia previa ha mostrado que esta técnica innovadora de enseñanza, junto con los métodos de enseñanza
tradicionales, facilita al estudiante el aprendizaje y mejora su desempeño en esta disciplina.

En esta sesión, se utilizará un sistema de simulación para construir curvas concentración-respuesta de agonistas,
tal y como se realizarían en un modelo de órgano o tejido aislado.

II. Objetivo

Los objetivos de esta práctica son:

1. Demostrar el efecto concentración dependiente de la Histamina y Carbacol en un sistema simulado.

2. Determinar el tipo de interacción farmacológica de la Atropina, Mepiramina y Tubocurarina sobre la


actividad de la Histamina y Carbacol en un sistema simulado.

III. Material

a) Software

• Se utilizará el software Organ Bath Simulation 2006 ver. 1.2 desarrollado por la Universidad
de Strathclyde, Escocia.
46 Dr. Andrés Navarrete Castro

El software puede ser descargado del siguiente vínculo:

http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/media/2/OBSim%20V1.2%20Setup.exe
El software deberá ser instalado en una PC o compatible con Microsoft Windows 98 ó posterior.

IV. Procedimiento

A) Manejo del software Organ Bath Simulation 2006 ver. 1.2


Para el uso adecuado del software se dividirá su manejo por procedimiento con referencia al esquema siguiente:

1. Inicio del programa y comienzo de un nuevo experimento

Para iniciar el programa se debe oprimir el siguiente icono:

Para comenzar un nuevo experimento:

a) Seleccione en Tissue type, el tejido Guinea Pig Ileum. Este tejido es el que será colocado dentro de
la cámara de órgano aislado.
b) Oprima el botón New Experiment.
c) Oprima el botón Record, para comenzar la lectura dentro del área de registro.
d) Seleccione y aplique fármacos de la lista de agonistas o antagonistas como se indica a continuación.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 47

2. Adición de agonistas a la cámara de órgano aislado

a) En el apartado Agonist, seleccione el agonista que se utilizará.


b) Seleccione la concentración molar que se empleará.
c) Introduzca en el volumen a utilizar: 0.10 mL
d) Oprima el botón Add to Organ Bath, para agregar el agonista a la cámara. Registre por 12 segundos
(un cuadro en la línea de tiempo) que equivale a 3 minutos en la simulación.
e) Para curvas acumulativas, agregue la siguiente concentración de agonista. Para curvas por lotes o no
acumulativas, oprima el botón Flush Reservoir to Bath, para lavar el tejido con disolución Krebs.
3. Adición de antagonistas a la cámara de órgano aislado

a) En el apartado Antagonist, seleccione el antagonista que se utilizará.


b) Seleccione la concentración molar que se empleará.
c) Introduzca en el volumen a utilizar: 0.10 mL
d) En la lista desplegable que se encuentra a la derecha del botón Add to, seleccione Organ Bath, y
oprima el botón Add to para agregar el antagonista a la cámara.
4. Medición de la respuesta del tejido

Para medir la amplitud de los picos de las contracciones del tejido:

a) Oprima el botón Stop, para terminar el experimento.


b) Usando la barra de desplazamiento horizontal del área de registro, seleccione la sección que contiene
las contracciones del tejido que serán medidas.
c) Arrastre el cursor de medición al punto de la gráfica de registro que será medido. La fuerza de
contracción (en gramos) será mostrada debajo del cursor.
d) Se sugiere tomar al menos cinco lecturas cercanas dentro de la meseta o área de medida y obtener el
promedio de las lecturas para un mejor resultado.
B) Experimentos a realizar en el software de simulación
Experimento1.
Curvas concentración respuesta de agonistas.
a) Seleccione como tejido al íleon de cobayo e inicie un nuevo experimento.
b) Seleccione a Histamina (Histamine) como el agonista a utilizar a una concentración de 1x10–8 M y
un volumen de 0.10 mL.
c) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.
d) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de registro) y se
oprime el botón Add to Organ Bath.
e) Cuando la contracción del músculo se estabilice (se registre una meseta) o hayan transcurrido 3
minutos de la simulación (si es que no hay contracción), se agrega la concentración de 1x10 –7 M y
así sucesivamente hasta agregar la concentración de 1x100 M.
48 Dr. Andrés Navarrete Castro

f) Al terminar la curva, se oprime el botón Stop y se guarda el registro. Se calcula la fuerza de contracción
por cada concentración agregada.
g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol (Carbachol).

Experimento 2.
Efecto de un antagonista en la curva concentración respuesta de agonistas

a) Seleccione como tejido al íleon de cobayo e inicie un nuevo experimento.


b) Seleccione a Histamina como el agonista a utilizar a una concentración de 1x10 –8 M y un volumen
de 0.10 mL.
c) Seleccione a Mepiramina (Mepyramine) como el antagonista a utilizar a una concentración de 1x10–6
M y un volumen de 0.10 mL.
d) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.
e) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de registro) y
se agrega el antagonista a Organ Bath oprimiendo el botón Add to del apartado Antagonist. Se
deja incubar por 3 minutos de simulación.
f) Después de terminada la incubación. Se construye la curva concentración respuesta de la Histamina
como se describe en el experimento 1.
g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol como agonista y Atropina (Atropine) como
antagonista.
h) Adicionalmente, realice el mismo experimento utilizando dos concentraciones más del antagonista, a
fin de tener el efecto del antagonista a tres diferentes concentraciones, en la acción del agonista.
Nota: Se puede experimentar con combinaciones de agonistas y antagonistas con los que cuenta el
software, para demostrar la selectividad de estos últimos.

Experimento 3.
Efecto relajante de antagonistas

a) Seleccione como tejido al íleon de cobayo e inicie un nuevo experimento.


b) Seleccione a Histamina como el agonista a utilizar a una concentración de 1x10-1 M y un volumen
de 0.10 mL.
c) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.
d) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de registro) y
se oprime el botón Add to Organ Bath.
e) Cuando la contracción del músculo se estabilice (se registre una meseta) o hayan transcurrido 3 minutos
de la simulación (si es que no hay contracción), se construye una curva concentración respuesta con
concentraciones crecientes de Mepiramina (de 1x10–8 M a 1x100 M). Tome en cuenta que ahora
la fuerza de contracción disminuirá en lugar de aumentar.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 49

f) Al terminar la curva, se oprime el botón Stop y se guarda el registro. Se calcula la fuerza de


contracción por cada concentración agregada.
g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol a una concentración de 1x10 –3 M y como
antagonista Atropina.
Nota importante: Al igual que en los experimentos in vitro, la concentración real en la cámara de órgano
aislado es 100 menor debido a la dilución 1:100 que se realiza al agregar 0.01 mL de muestra
en 10 mL de disolución que contiene la cámara.

V. Análisis de resultados

1. Con los datos obtenidos del experimento 1

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol.


b) Determinar el modelo al que se ajustan los datos.
c) Calcular la CE50 para la Histamina y el Carbacol de acuerdo con modelo determinado en el inciso
anterior.
2. Con los datos del experimento 2

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol con cada uno de los
antagonistas utilizados.
b) Calcular la CE50 para las combinaciones de Histamina y de Carbacol con los antagonistas utilizados de
acuerdo con modelo determinado en el experimento anterior.
c) Calcular cuántas veces se disminuyó el efecto del Carbacol y de la Histamina por la presencia de sus
antagonistas.
d) Con las tres curvas concentración-respuesta de los antagonistas a diferente concentración, calcule la
potencia o pA2 del antagonista.
3. Con los datos del experimento 3

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol con cada uno de los
antagonistas utilizados.
b) Determinar el modelo al que se ajustan los datos.
c) Calcular la CI50 (Concentración Inhibitoria media) para las combinaciones de Histamina y
de Carbacol con los antagonistas utilizados, de acuerdo con modelo determinado en el inciso
anterior.
50 Dr. Andrés Navarrete Castro

VI. Bibliografía

• Samuelsson G. (1991). Assays for pharmacological activity: Non-specific assays. Methods in


Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 261-280.
• Schwinghammer T y Kroboth P. (1988). Basic concepts in pharmacodynamic modeling. Journal
of Clinical Pharmacology. 28:388-394.
• Tallarida R. (2000). Drug sinergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC,
EUA.
9. Demostración del efecto sinergista y antagonista
en un sistema de órgano aislado

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis)


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacodinamia, agonistas y antagonistas; Farmacometría, relación
dosis-respuesta gradual.

I. Introducción

Las preparaciones de tejidos u órganos aislados son comúnmente usadas para estudiar los efectos de un
fármaco sobre un tipo específico de receptores. Estas preparaciones son también utilizadas para bioensayos,
caracterización de receptores específicos o sus subtipos, para determinar la curva concentración-respuesta de
un agonista y para estudiar el antagonismo entre un fármaco y otro nuevo descubierto.

El íleon de cobayo ha sido una preparación in vitro utilizada para estudiar cambios mediados por receptores,
para identificar nuevos receptores, y para determinar la variación en especies producidas por fármacos anti-
colinérgicos. Varios receptores, incluyendo los de histamina, los GABAérgicos y adrenorreceptores se pueden
estudiar en este tipo de preparaciones.

La preparación de íleon de rata puede ser usada para enseñar los conceptos básicos del bioensayo y para
demostrar la actividad espasmolítica de fármacos colinérgicos y anticolinérgicos. Las ventajas de esta pre-
paración son su bajo costo y fácil implementación y manejo.

En esta práctica se utilizará la preparación de íleon de rata para determinar el efecto del Carbacol y Atropina
sobre los receptores colinérgicos presentes en la preparación.

II. Objetivos

Los objetivos de esta práctica son:

1. Demostrar el efecto concentración dependiente del Carbacol en íleon de rata.

2. Determinar el tipo de interacción farmacológica de la Atropina sobre la actividad del Carbacol en íleon
de rata.

III. Material
a) Material biológico
• Una rata Wistar hembra de 200-250 g de peso, con ayuno de 12 h y libre acceso al agua.
52 Dr. Andrés Navarrete Castro

b) Materiales, cristalería y equipo


• Vaso de precipitado de 1 L
• Pipetas graduadas de 1 mL
• Seis matraces aforados de 10 mL
• Estuche de disección
• Placa de agitación
• Balanza analítica
• Polígrafo Biopac System acoplado a una computadora con el software AcqKnowledge versión
3.7
c) Reactivos
• Disolución Krebs-Henseleit (KHS).
Composición en mM: NaCl 118, KCl 4.7, MgSO4.7H2O 1.2, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2,
NaHCO3 25, glucosa (C6H12O6) 11.

Cantidades de las sales para preparar 1000 mL de disolución Krebs-Henseleit (KHS)


D-glucosa C6H12O6 1.998 g
Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4 l 7H2O 0.2956 g
Dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 0.1632 g
Cloruro de potasio KCl 0.351 g
Cloruro de sodio NaCl 6.903 g
Hidrógenocarbonato de sodio NaHCO3 2.1 g
EDTA disódico dihidratado C10H14O8N2Na2 l 2H2O 0.0117 g
Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 l 2H2O 0.3677 g

Se disuelven todas las sales, una por una, en aproximadamente 500 mL de agua destilada. Disolviendo al
último el cloruro de calcio. Una vez disueltas las sales y sin signos de precipitación se lleva a un volumen de
1000 mL con agua destilada.

La disolución KHS deberá tener un pH de 7.4 a 37ºC y se mantendrá con burbujeo constante de gas
carbógeno (95% O2 y 5% CO2). Si presenta precipitación deberá prepararse nuevamente.

• Disoluciones de Carbacol (1x10–4, 3x10–5, 1x10–5, 3x10–6 y 1x10–6 M).


Preparación de la disolución Stock (1x10–3 M).

Disolver 1.825 mg de Carbacol en agua destilada y aforar a 10 mL.

Preparación de las disoluciones.

Una vez preparada la disolución stock deberá seguirse la serie de diluciones como se muestra en el
siguiente esquema, utilizando matraces aforados de 10 ml:
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 53

• Disolución de Sulfato de Atropina (1x10 –6 M).


Se pesan 1.692 mg de sulfato de atropina, se disuelven agua destilada y se afora aun volumen
de 10 mL (disolución Stock). A continuación se sigue el esquema de diluciones como se indica:

IV. Procedimiento

a) Manejo del Polígrafo Biopac System


Para el manejo adecuado del Polígrafo Biopac System por medio del software AcqKnowledge, véase
el Apéndice IV de esta guía.

b) Disección del íleon de rata


1) Sacrificar la rata en la cámara de CO2 o por dislocación cervical.
2) Abrir el abdomen y realizar la disección del íleon. La localización del íleon se muestra en el
siguiente esquema.
54 Dr. Andrés Navarrete Castro

3) Disecar una longitud aproximada de 10–12 cm de íleon, lavarlo con disolución KHS hasta que la
luz intestinal quede libre materia orgánica.
4) Cortar segmentos de aproximadamente 1 cm de largo y colocarlos en disolución KHS, con burbujeo continuo
de gas carbógeno.

c) Montaje de la preparación
1) Cada preparación se suspenderá en una cámara para órgano aislado con ganchos de alambre
de nicromel, que se incrustan en el tejido. Uno de los extremos se fija a la cámara y el otro al
transductor de fuerza conectado al Polígrafo Biopac System, de acuerdo a las siguientes figuras:
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 55

2) Cada cámara deberá contener 10 mL de solución KHS con burbujeo constante de gas carbógeno
a una temperatura de 37±1 ºC.
3) El tejido se somete a una tensión inicial de 1 g dejándolo estabilizar por 20 minutos, con un
lavado intermedio a los 10 minutos.
4) Realizar dos estimulaciones con 100 µL de Carbacol (1x10-4 M) a intervalos de 20 minutos,
con un lavado intermedio a los 10 minutos Después de cada estimulación se lava el tejido con
solución KHS dos veces para eliminar al Carbacol.
Nota: La concentración real en la cámara de órgano aislado es 100 veces menor debido a la
dilución (1:100).
5) El cronograma de los pasos 2 a 4 es el siguiente:
Tiempo corrido (min) Actividad
Inicio
0
(Oprimir el botón Start)
10 Lavado con KHS
Estimulación 1 y
20
Lavado con KHS
30 Lavado con KHS
Estimulación 2 y
40
Lavado con KHS
50 Lavado con KHS
60 Lavado con KHS
70 Inicio de las evaluaciones

d) Curva acumulativa concentración respuesta del Carbacol


1) Estando estable el tejido, se registra una línea basal durante 5 minutos y se adicionan 0.1 mL de
Carbacol 1x10-6 M (disolución 1). Las siguientes disoluciones se agregarán sucesivamente en el
momento en que la disolución anterior alcance una meseta de contracción.
Disolución Concentración de Carbacol
1 1x10–6 M
2 3x10–6 M
3 1x10–5 M
4 3x10–5 M
5 1x10–4 M

2) Después de evaluar se lava el tejido por dos veces con disolución KHS dejando reposar por
periodos de 10 minutos entre cada uno.
e) Efecto de la Atropina en la acción del Carbacol
1) Estando estable el tejido, se registra una línea basal durante 5 minutos y se adicionan 0.1 mL de
Atropina 1x10–6 M.
2) Se deja incubar el tejido con la Atropina durante 5 minutos y posteriormente se realiza la curva
acumulativa concentración-respuesta, como se indicó en el inciso e).
56 Dr. Andrés Navarrete Castro

V. Análisis de resultados

1. Para analizar los datos es necesario descargar el software AcqKnowledge 3.9 Demo en la siguiente
dirección electrónica:

http://www.biopac.com/Demos.asp?did=4&PCDemoResearch=Y

Es necesario registrase para descargarlo, y debe instalarse como indican las instrucciones del sitio web.

Con ayuda del software y de su profesor deberá llenar el cuadro de datos anexa.

TABLA DE DATOS DEL EXPERIMENTO


EXPERIMENTO 1. CARBACOL
CONCENTRACIÓN MUESTRA / CANAL
NÚM. LOG [CONC (M)]
(M) CARBACOL 1 2 3 4

Basal

EXPERIMENTO 2. CARBACOL + ATROPINA (1X10-6 M)


CONCENTRACIÓN MUESTRA / CANAL
NÚM. LOG [CONC (M)]
(M) CARBACOL 1 2 3 4

Basal

2. Con los datos obtenidos:

a) Construir las curvas concentración respuesta de Carbacol y de Carbacol+Atropina.


b) Determinar el modelo al que se ajustan los datos.
c) Calcular las CE50 para el Carbacol y para Carbacol+Atropina, de acuerdo con el modelo determinado
en el inciso anterior.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 57

d) Calcular cuántas veces se disminuyó el efecto del Carbacol por la presencia de la Atropina.
e) Determinar el tipo de interacción de la Atropina sobre la acción del Carbacol.

VI. Bibliografía

• Samuelsson G. (1991). Assays for pharmacological activity: Non-specific assays. Methods in


Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 261-280.
• Schwinghammer T y Kroboth P. (1988). Basic concepts in pharmacodynamic modeling. Journal
of Clinical Pharmacology. 28:388-394.
• Tallarida R. (2000). Drug sinergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC, EUA.
Tabla de convensión de proporción
Apéndice I. a unidades Probit

Tabla de conversión de proporción (pi) a unidades probit (yi)

pi 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

0.00 --- 2.673 2.945 3.119 3.249 3.355 3.445 3.524 3.595 3.659

0.10 3.718 3.773 3.825 3.874 3.920 3.964 4.006 4.046 4.085 4.122

0.20 4.156 4.194 4.228 4.261 4.294 4.326 4.357 4.388 4.417 4.447

0.30 4.476 4.505 4.532 4.561 4.588 4.615 4.642 4.669 4.695 4.721

0.40 4.747 4.773 4.798 4.824 4.849 4.874 4.900 4.925 4.950 4.975

0.50 5.000 5.025 5.050 5.075 5.100 5.125 5.151 5.176 5.202 5.227

0.60 5.253 5.279 5.305 5.331 5.358 5.385 5.412 5.439 5.467 5.495

0.70 5.524 5.553 5.582 5.612 5.643 5.674 5.706 5.739 5.771 5.806

0.80 5.841 5.878 5.915 5.954 5.994 6.036 6.080 6.126 6.175 6.227

0.90 6.282 6.341 6.405 6.476 6.555 6.645 6.751 6.881 7.054 7.327

pi 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009

0.97 6.88 6.896 6.911 6.927 6.944 6.960 6.978 6.996 7.014 7.034

0.98 7.054 7.075 7.097 7.121 7.145 7.171 7.198 7.227 7.258 7.291

0.99 7.327 7.366 7.409 7.458 7.513 7.576 7.652 7.748 7.879 8.091
Técnicas de manejo e identificación
Apéndice II. de animales de laboratorio (rata y ratón)

I. Manejo del ratón.

Los ratones, así como la mayoría de los animales de laboratorio, pueden ser levantados por su cola. La base
de la cola es sujetada entre los dedos pulgar e índice y el roedor entonces es levantado en posición vertical.
Esta técnica resulta útil para manejar y trasladar a los ratones distancias cortas. Se debe tener cuidado de no
sujetarlo por la punta de la cola ya que podría escalar la misma y morder la mano (figura 1 y 2).

Figura 1. Forma correcta de manejar un ratón Figura 2. Forma incorrecta de manejar un ratón

Para la inmovilización del ratón con el objetivo de administrarle un fármaco o sustancia, se procederá de la
siguiente manera:

Se toma al ratón como se explicó anteriormente, y el peso del cuerpo del roedor es apoyado sobre la reja
de la caja (figura 3), se toma ahora la cola del ratón por medio del dedo meñique y con los dedos índice y
pulgar se toma de la piel de la nuca (figura 4 y 5). Se voltea y se levanta la mano, de manera que el vientre
quede expuesto (figura 6 y 7). Una buena inmovilización evita que el ratón se voltee o se mueva al momento
de la administración.
62 Dr. Andrés Navarrete Castro

Figura 3. Figura 4.

Figura 5. Figura 6.

Figura 7.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 63

Una vez inmovilizado el ratón se puede proceder a la administración del fármaco o sustancia, teniendo
cuidado de sujetarlo firmemente.

II. Manejo de la rata

La rata debe manejarse por la base de la cola y evitar levantarla de esta manera por mucho tiempo debido a los
movimientos que realiza (figura 8). El traslado se realizará de esta manera en distancias muy cortas y no se
deberá sujetar por la punta de la cola.

Figura 8. Forma correcta de manejar a una rata.


Para la inmovilización de la rata de laboratorio existen muchas técnicas. A continuación se explicarán las más
utilizadas.

Técnica 1.

Se sujeta a la rata por la base de la cola con la mano derecha y con la izquierda se coloca el cuello de la rata
entre los dedos medio e índice. La rata entonces es sujetada por las extremidades anteriores y el abdomen
sin hacer presión sobre el cuello (figura 9, 10 y 11). Se levanta la mano y la cola es sujetada con la mano
izquierda para dejar expuesto el vientre (figura 12 y 13). Se levanta la mano y la cola es sujetada con la
mano derecha para dejar expuesto el vientre.

Figura 9. Figura 10. Figura 11.


64 Dr. Andrés Navarrete Castro

Figura 12. Figura 13.

Técnica 2.

Se sujeta a la rata por la base de la cola con la mano derecha y con la mano izquierda se coloca el cuello de la rata
entre los dedos pulgar e índice (figura 14 y 15), de manera que los dedos queden a la altura de las extre-
midades anteriores. Con el movimiento natural de la mano, se cierra ésta de manera que las extremidades anteriores
de la rata queden cruzadas, se levanta y se sujeta la cola con la mano derecha para dejar expuesto el vientre
(figuras 16, 17 y 18).

Figura 14. Figura 15. Figura 16.


Figura 17. Figura 18.


Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 65

III. Marcaje del ratón y la rata

La técnica recomendada para el marcaje de ratones y ratas en el Laboratorio de Farmacología se realiza en la


cola del animal por medio de un marcador indeleble, siguiendo la clave que se muestra en las figuras 19 a 25.
Esta técnica se recomienda cuando se utilizan pocos animales y en experimentos muy cortos en duración.

Figura 19. Marcaje en la cola con marcador. Figura 20. Ratón marcado con el número 1.


Figura 21. Ratón marcado con el número 2. Figura 22. Ratón marcado con el número 3.

Figura 23. Ratón marcado con el número 4. Figura 24. Ratón marcado con el número 5.

Figura 25. Ratón marcado con el número 6.


66 Dr. Andrés Navarrete Castro

IV. Bibliografía

• Short D y Woodnott D (editores). (1963). The A.T.A. manual of laboratory animal practice
and techniques. Charles C. Thomas-Publisher, EUA: 47-57.
Apéndice III. Formato de Consentimiento Informado
Instructivo para el uso del polígrafo
Apéndice IV. Biopac System MP-100

I. Materiales y reactivos

• Polígrafo Biopac System MP-100A-CE


• Gas carbógeno (oxigeno 95%-dióxido de carbono 5%).
• Disolución Krebs-Henseleit (KHS)

Disolución Krebs-Henseleit (KHS)


D-glucosa C6H12O6 1.998 g
Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO47H2O 0.2956 g
Dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 0.1632 g
Cloruro de potasio KCl 0.351 g
Cloruro de sodio NaCl 6.903 g
Hidrógenocarbonato de sodio NaHCO3 2.1 g
EDTA disódico dihidratado C10H14O8N2Na22H2O 0.0117 g
Cloruro de calcio dihidratado CaCl22H2O 0.3677 g

Preparación: Se disuelven todas las sales en aproximadamente 500 mL de agua destilada. Disolviendo
en último término al Cloruro de calcio. Una vez disueltas las sales y sin signos de precipitación se lleva a un
volumen de 1000 mL con agua destilada.

• Disolución de Acetilcolina 3x10-5 M


• Disolución de Norepinefrina 1x10-6 M
• Disolución de Carbacol 1x10-4 M
70 Dr. Andrés Navarrete Castro

II. Procedimiento

A. Calibración del polígrafo.

1. Se verifica que todos los canales estén firmemente conectados y ajustados.

2. Se enciende la computadora y el polígrafo oprimiendo el botón en la posición ON.

3. Se verifica que el nivel de agua del baño recirculador cubra la resistencia y la bomba. Se enciende y
deja estabilizar la temperatura en 37±1°C. Este baño proporciona el flujo de agua que mantiene
la temperatura de la disolución KHS a dicha temperatura.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 71

4. En la pantalla de la computadora se selecciona el icono

   para iniciar el programa AcqKnowledge, el cual registra los datos provenientes del Polígrafo.

5. Al comenzar el programa se abre la ventana que se ilustra enseguida.

6. Para comenzar la configuración del polígrafo se selecciona en el menú la opción MP100, y posteriormente
la opción Setup Channels que nos abrirá una ventana emergente.
72 Dr. Andrés Navarrete Castro

7. En la ventana emergente Input Channels, se activan los canales que se utilizarán seleccionando las casillas
Acquire, Plot y Values con √ para cada canal An.

8. Para la calibración de cada canal se selecciona primero el canal y se oprime el botón con el
cual aparecerá la siguiente ventana emergente.

9. En las casillas Scale value se colocan 0 (cero) y 2 (dos) y en Units se coloca g (gramos) como se muestra
a continuación.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 73

10. Con el valor Scale value = 0, se oprime el botón y el programa automáticamente calculará el
valor Input volts correspondiente a 0 g (cero). Con el valor Scale value = 2, se coloca una pesa de 2
gramos sobre el transductor y se oprime el botón , el programa entonces, automáticamente calculará
el valor Input volts correspondiente a 2 g (dos gramos). Al terminar se oprime el botón OK.

Este procedimiento se repite con cada canal que se utilizará.

11. Continuando con la calibración, se selecciona en el menú la opción MP100, y posteriormente la opción
Setup Acquisition.

12. Al seleccionar la opción Setup Acquisition se abrirá la siguiente pantalla emergente.


74 Dr. Andrés Navarrete Castro

13. En la pantalla emergente Setup Acquisition, se seleccionarán las opciones Record and Save once to
Disk acquisition. Posteriormente se elegirá Acquisition Sample Rate en 0.5 ó 1.0 samples /second, y en
Total lengh se determinará el máximo en horas, como se muestra a continuación.

14. El Polígrafo ya está calibrado y se puede seguir con el montaje del tejido.

B. Montaje del tejido

1. Antes de montar el tejido se selecciona en el menú del software AcqKnowledge la opción MP100, y
posteriormente. Show Input Values.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 75

2. Al seleccionar abrirá una ventana emergente que muestra los valores que se registran en el Polígrafo.

En la ventana emergente se oprime el botón n y después el de Options. En esta última se seleccionan Channel
numbers, Units y Values, y el tamaño de letra adecuado para su visualización (se recomienda de 14-18
puntos). Al terminar se oprime el botón OK.
76 Dr. Andrés Navarrete Castro

3. Se realiza la disección del tejido a utilizar de acuerdo a lo reportado en la literatura. En caso de íleon o
tráquea de cobayo o aorta de rata el tejido se cortará en anillos para su montaje.

4. Para aorta y traquea el tejido es sujetado por medio de ganchos de alambre Nicromel como se muestra
en la figura.

Para íleon el tejido es montado de acuerdo a la siguiente figura, insertando el tejido en los ganchos:

5. Los ganchos junto con el tejido son colocados dentro de la cámara de órgano aislado previamente llena
con KHS y con burbujeo constante de gas carbógeno, como se muestra a continuación.
Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 77

6. Se le da una tensión a cada tejido de cada cámara, por medio del tensor del transductor de acuerdo con
el siguiente cuadro.

Tejido Tensión
Aorta de rata 4.0 gramos
Tráquea de cobayo 1.5 gramos
Íleon de rata 1.0 gramo

7. Se oprime el botón Start para comenzar el registro del experimento.

8. Al oprimir el botón Start, comenzará el registro como se muestra a continuación.


78 Dr. Andrés Navarrete Castro

9. Para personalizar las opciones de visualización se recomienda consultar el siguiente cuadro.

BOTÓN NOMBRE DEL BOTÓN EFECTO

Scope Mode

(muestra todos los


canales juntos)

Chart Mode

(muestra cada canal


por separado)

Show / Hide Journal

(Muestra / oculta la ventana de


anotaciones
en la parte inferior)

Show / Hide Markers

(Muestra / oculta la barra


de marcadores de evento.
Para agregar un marcador
se oprime la tecla F9)

Show / Hide Grid

(Muestra / oculta la rejilla)


Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 79

Set Screen Vertical Axis


Oprimir
sobre el eje (Cambia la visualización del
Y eje Y. Se recomienda un Scale
Setting = 1 g)

Oprimir Set Screen Horizontal Axis


sobre el eje
(Cambia la visualización del eje
X
X. Se recomienda un Scale =
15 minutes)
80 Dr. Andrés Navarrete Castro

C. Estimulación del tejido para el experimento.

1. Una vez montados los tejidos se procederá a su estimulación de acuerdo con el siguiente cuadro.

Sustancia para
Tejido Concentración
estimulación
Aorta de rata Norepinefrina 1x10–6 M
Traquea de cobayo Acetilcolina 3x10–5 M
Íleon de rata Carbacol 1X10–4 M

2. El cronograma de estimulación y lavado de los tejidos se realizará como sigue.

Tiempo corrido
Actividad
(min)
0 Inicio (Oprimir el botón Start)
15 Lavado con KHS
30 Estimulación 1 y Lavado con KHS
40 Lavado con KHS
50 Estimulación 2 y Lavado con KHS
60 Lavado con KHS
70 Lavado con KHS
80 Inicio de las evaluaciones

3. En el minuto 80, se puede iniciar la evaluación de las sustancias de acuerdo a lo reportado en la


literatura y a los objetivos establecidos.

III. Bibliografía

• Estrada S, et al. (1999). Nitric oxide/c GMP mediates the spasmolytic action of 3,4’-dihydroxy-
5,5’- imethoxybibenzyl from Scaphyglottis livida. Planta Medica. 65(2):109-114.
• Hsieh G, et al. (2003). YC-1 potentiates the nitric oxide/cyclic GMP pathway in corpus
cavernosum and facilitates penile erection in rats. European Journal of Pharmacology. 458:83-
189.
• Sánchez-Mendoza M, et al. (2007). Mechanisms of relaxant action of a crude hexane extract
of Gnaphalium liebmannii in guinea pig tracheal smooth muscle. Journal of Ethnopharmacology.
111:142–147.
Farmacología I Guión de Prácticas es una obra editada por la Facultad de Química.
Se terminó de imprimir en diciembre de 2008 en los talleres de la misma.

Se tiraron 1000 ejemplares en papel bond de 36 gramos.

Tipo de impresión: Offset.

Para la composición del texto se utilizó la fuente Geometr231 BT 12 y 18 pts.


normal, Geometr231 BT 13 pts. bold.

El cuidado de la edición estuvo a cargo de la Sección de Diseño Editorial, área


adscrita al Departamento de Publicaciones.

Publicación aprobada por el Comité Editorial de la FQ.

Diciembre de 2008.

Diseño de interiores: Lourdes Gracia Archundia.


Diseño de portada: Lic. Leticia González González.