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07/10/2019

citologia, istologia e embriologia


Risoluzione di uno strumento: la distanza minima intercorrente tra due punti dintinguibili come
separati
Risoluzione microscopio ottico: (o,2-0,3)micron
Risoluzione microscopio elettronico: 0,2nm
Ricorda: l’ultra struttura di una cellula è analizzabile unicamente con il microscopio elettronico.

Preparazione di un tessuto da analizzare


obiettivo: analisi della struttura e dell’organizzazione di un tessuto e delle cellule che lo
costituiscono
1. fissazione
scopo: interrompere velocemente e completamente i processi autolitici che si sviluppano nella
cellula e nei tessuti non più nutriti ed ossigenati; preservare i campioni dall'attacco di muffe e batteri
che potrebbero proliferare nutrendosi delle strutture non più in grado di proteggersi; conservare al
meglio la morfologia strutturale ed ultrastrutturale del tessuto e della cellula.
1.minimizza la degradazione dei tessuti, conseguente alla rimozione del tessuto dal suo ambiente
vitale, in seguito alla variazione di temperatura e di pH;
2.consente al preparato di sopportare gli stress fisici e chimici insiti nelle successive fasi di
disidratazione, inclusione e sezionamento.

La fissazione serve quindi per la conservazione del tessuto e può essere di due tipi:
Fisica: si tratta di un processo di congelamento in azoto (che congela a -170°C)
Limiti: crea delle criofratture artificiali
Uso: È usato per questione di fretta-----→è infatti il metodo più rapido per fissare e preparare un
campione di tessuto da analizzare (permette di produrre campioni pronti per essere analizzati anche
in soli 20 minuti)
-È usato nello studio dei tessuti adiposi
Dato il basso punto di congelamento dell’azoto liquido (-170°C) è un metodo molto utile per la
conservazione di cellule (Ricorda: sotto i -70°C) non c’è attività più enzimatica)
-È utile per la conservazione delle cellule del midollo osseo.
-i tessuti congelati devono essere tagliati con criostati combinati con microtomi: questi sono
costituiti da lame monouso.
Chimica: la fissazione chimica usa sostanze come la paraformaldeide , la formalina tamponata
(permette la conservazione più lunga), liquido di Bouin, acido acetico, alcool.
I tampono in queste sostanze sono necessari per non modificare la morfologia della cellula.
Tempi: /1-2)cm cubi di tessuto in paraformaldeide per 2 o 3 ore.

Disidratazione:
-dura una notte
si passa da alccol a 70% a alcool a 100%
-si usa lo xilolo (solvente organico-cancerogeno): il tessuto viene immerso nello xilolo, un solvente
perfetto per le paraffine. Il tessuto, se disidratato bene, si diafanizza (diventa trasparente)
-La paraffina è fluida attorno ao 60°C: quindi il tessuto viene messo in una stufa e tenuto a 60°C per
un paio di ore e infine viene immerso nella paraffina (inclusione)
-il tessuto imbevuto di paraffina viene lasciato solidificare in uno stampo a temperatura ambiente.
-il tessuto così solidificato può essere tagliato
il taglio deve essere di uno spessore di circa (5-10)micron
La sezione a questo punto è accartocciata: quindi per farla stendere la si immerge in un bagno di
acqua a 27°C ---→ la sezione alla fine viene stesa sul vetrino grazione all’utilizzo di sostanze
adesive.
- l’inclusione non deve mai superare la temperatura di 60°C: perchè a temperature superiori a questa
le proteine presenti nel campione iniziano a denaturarsi.
-alternative alle paraffine: resine che si sciolgono a 45°C.
-il processo che dalla fissazione porta al taglio del tessuto dura circa 3 giorni
colorazione:
-permette di evidenziare le varie componenti del tessuto e delle cellule
coloranti
Ematossillina-eosina base-acido Funziona grazie al principio di
(colorante elementare) affinità tra gli acidi e le basi.
Colora le componenti acide e
basiche della cellula: la
cromatina è acida e pertanto si
colorerà con l’ematossillina; il
citoplasma è basico e si colora
pertanto con l’eosina.

Con questi coloranti non si


colorano: gli amminoacidi
neutri, le fibre elastiche e
reticolari.
Miscela di Azan Mallory Permette di identificare la -Colora la matrice di blu
matrice fibrosa extracellulare -i nuclei di rosso
del tessuto e quindi di definire -il citoplasma di giallo
la struttura e le modalità di arancione
organizzazione del tessuto
Coloranti con sali metallici Sono usati nella microscopia
elettronica o per lo studio del
tessuto nervoso
Reazione PAS (acido periodico Usato per analizzare ad es. I Colora:
di Schiff) campioni citologici per il pap -di rosso I tessuti
test -di blu scuro il nucleo
-di blu chiaro il mucogeno e il
collagene
-gli amminoacidi neutri
Colorazione di Giemsa e Colora le cellule del sangue Colora:
Wright -Di rosa gli eritrociti
-di porpora I nuclei dei
leucociti, granulociti basilofili
_di blu il citoplasma dei
monociti e dei linfociti
Orceina Colora di marrone le fibre
elastiche
Sali d’argento Colora le fibre reticolari, che Colora di nero le fibre reticolari
sono molto più glicosilate (che tengono iniseme gli organi
pieni)→il tessuto adiposo è da
essere considerato come un
vero e proprio organo: quindi si
colora con questi sali
Ematossillina ferrica Colorale striature muscolari e Colora di nero gli eritrociti e le
gli eritrociti striature muscolari

microscopi

I microscopi sono di due tipi:


ottici: sono costituiti da un sistema di due lenti→ una posta vicino all’obiettivo, l’altra all’oculare.
Le lenti usate possono garantire diversi ordini di ingrandimento: 10x, 16x, 100x. Oltre
l’ingrandimento di 100x non si può andare a causa dei limiti di lunghezza d’onda della luce
elettrocici:
risoluzione: (0,2-0,3)nm
fissativo usato: glutaraldeide e acido osbico
-fornisce immagine non colorate: nell’immagine si osservano varie gradazioni di grigio.
Può essere di due tipi:
a trasmissione: ha un alto potere di risoluzione
-necessita di campioni sottilissimi (di qualche centinaio di nm)
-il preparato deve essere ben fatto
-fornisce un’immagine bidimensionale
a scansione:
fornisce un’immagine tridimensionale: non necessita di tessuti sezionati, ma di campioni di cellule
sulle quali vengono bombardati dei sali di oro colloidale, in modo tale da ottenere un’idea chiara
della superficie della cellula
-sono usati nello studio dei virus