Con una previa verificación de las normas de seguridad e identificación del

material a utilizar, se comprobó empíricamente que la medición de volumen en

diferentes aparatos del laboratorio varían de precisión. Para comenzar, se
calculó en un vaso de precipitado 50 y 100 mL de agua destilada, que
posteriormente fue trasvasado a un balón aforado de 50 y 100 mL
respectivamente, se observó que el nivel alcanzado por el agua no es
congruente con el volumen medido inicialmente, ya que éste quedó por debajo
de la línea de aforo;

Tabla No. 1. datos experimentales del nivel alcanzado por el agua destilada medidos
en el vaso de precipitado y balón aforado

VASO DE
PRECIPITADO BALON AFORADO
50mL 35mL
100mL 90mL

por otro lado, se midió en una probeta de 100 mL un volumen de agua destilada de 50 y 100
mL, al trasegar éstos a un balón aforado, se contempló que los volúmenes no se
conservaban como inicialmente se habían tomado; algo importante a resaltar es que la
probeta es un instrumento de medición que permite evaluar volúmenes de una manera más
acertada que los vasos de precipitado pero esto no quiere decir que sea uno de los mejores
implementos al momento de necesitar un volumen determinado.

Tabla No. 2. altura del agua destilada obtenida en la probeta, comparada con el balón
aforado

PROBETA BALON AFORADO

50mL 49mL
100mL 99mL

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (HPLC) DETERMINACION

DE CAFEINA EN COCA-COLA
JOHANA FEIJOOa, CINDY IDARRAGAb, KATHERINE MINA(1324777)c
a
johana.feijoo@correounivalle.edu.co, bcindy.idarraga@ correounivalle.edu.co,
c
katherine.mina@correounivalle.edu.co
Facultad de Ciencias Naturales y exactas; Dep. Química; Universidad del valle
Cali, Colombia.
21-03-2013
RESUMEN: Para el desarrollo de la práctica, se realizó un estudio previo acerca de las
normas de seguridad en el laboratorio, el manejo y reconocimiento de los instrumentos, con
el propósito de evitar errores o accidentes en su ejecución.

También, se determinó experimentalmente el punto en el que la reacción entre el ácido (HCl)

y la base (Na(OH)) alcanza la neutralización, utilizando como solución indicadora la
fenolftaleína.
1. DATOS Con una previa verificación de
las normas de seguridad e identificación del
material a utilizar, se comprobó
empíricamente que la medición de volumen
en diferentes aparatos del laboratorio varían
de precisión. Para comenzar, se calculó en
un vaso de precipitado 50 y 100 mL de agua
destilada, que posteriormente fue trasvasado
a un balón aforado de 50 y 100 mL
respectivamente, se observó que el nivel
alcanzado por el agua no es congruente con
el volumen medido inicialmente, ya que éste
quedó por debajo de la línea de aforo;
Tabla No. 1. datos experimentales del
nivel alcanzado por el agua destilada
medidos en el vaso de precipitado y
balón aforado
VASO DE
PRECIPITADO BALON AFORADO
50mL 35mL
100mL 90mL
por otro lado, se midió en una probeta de
100 mL un volumen de agua destilada de 50
y 100 mL, al trasegar éstos a un balón
aforado, se contempló que los volúmenes no
se conservaban como inicialmente se habían
tomado; algo importante a resaltar es que la
probeta es un instrumento de medición que
permite evaluar volúmenes de una manera
más acertada que los vasos de precipitado
pero esto no quiere decir que sea uno de los
mejores implementos al momento de
necesitar un volumen determinado.
Tabla No. 2. altura del agua destilada
obtenida en la probeta, comparada con el
balón aforado
PROBETA BALON AFORADO
50mL 49mL
100mL 99mL
La determinación experimental del contenido
de cafeína en una bebida de coca cola por
HPLC se llevo a cabo utilizando el método
de curva de calibración, la cual se preparo a
partir de una solución de cafeína a una
concentración de 300 ppm, de esta solución
stock se tomaron cinco alícuotas (tabla No.
1) llevadas a un matraz aforado de 25 mL y
enrasando con fase móvil de metanol: agua
50:50. Las anteriores soluciones estándares
se pasaron por filtros de tamaño de poro de
0.45 µm antes de inyectar al cromatógrafo.
Tabla No. 1. Datos experimentales en la
preparación de las soluciones
estándares.
VOLUM
EN CONCENTRAC
ALICUO ION (ppm)
TA (mL)
1.0 12
2.0 24
3.0 36
4.0 48
5.0 60
Por su parte para la preparación de la
muestra problema fue necesario inicialmente
desgasificar la bebida de coca cola por 10
minutos en un equipo de ultrasonido. De la
solución desgasificada se tomo 15 mL y se
adiciono a un matraz volumétrico de 25 mL
enrasando con metanol puro. Posteriormente
de la solución anteriormente preparada se
tomo una alícuota de 15 mL y se enraso en
un matraz de 25 mL, esta vez utilizando
como solvente la fase móvil (metanol: agua
50:50). La solución anterior esta se filtro
empleando el mismo procedimiento
mencionado para la preparación de
estándares.
Con las soluciones anteriormente Una vez determinado las respuestas
preparadas y filtradas se procedió a realizar instrumentales para cada muestra de
la lectura por cromatografía liquida de alta solución estándar, se determino las
resolución (HPLC) utilizando las condiciones respuestas instrumentales para las muestras
mencionadas en la tabla No. problemas (Tabla No.4).

Tabla No. 2. Condiciones operacionales Tabla No. 4. Respuestas instrumentales

en el cromatógrafo. para las muestras problemas.
Metanol: agua PROMEDIO
Fase Móvil MUESTRA AREA
50:50 DE AREAS
PROBLEMA (mAU.s)
Flujo 1 mL/min. (mAU.s)
Columna Hypersil ODS coca cola 628.55261
Detector UV 243 nm. 634.627053
coca cola 643.34088
3
coca cola 631.98767
Los resultados obtenidos en función de área
y concentración para las soluciones
2. CALCULOS Y RESULTADOS
estándares se encuentran tabuladas en la
tabla No. 3. Las medidas instrumentales Según los resultados obtenidos y de acuerdo
determinadas en el cromatograma fueron a la tabla No. 3 se realizó una curva de
realizadas por triplicado tanto para las calibración de promedio de áreas vs.
soluciones estándares como para las Concentración de cafeína en las soluciones
muestras problemas. estándares, determinando la pendiente y el
intercepto con sus correspondientes
Tabla No. 3. Respuestas instrumentales desviaciones estándar e intervalos de
para las muestras estándares. confianza. (Grafica No. 1).
PROMEDIO
CONCENTRACIO AREA
N (ppm)
DE AREAS
(mAU.s)
(mAU.s)
1200
12 143.99207
144.399163
12 144.43535 1000
3
12 144.77007
AREAS (mAU.S)

800

24 433.67084
432.373606
24 433.63998 600

7
24 429.81 400

36 683.69055
200
36 695.40332 693.37919
36 701.0437 0
10 20 30 40 50 60

48 1052.7361 CONCENTRACIÓN (ppm)

48 1009.3666 1042.59497
48 1065.6823 Grafica No. 1. Curva de calibración de área vs
60 1136.8943 concentración (ppm).
60 1134.9181 1135.95223
60 1136.0443 y=a+bx

AREA=−88 . 258+21 .611 [ ppmcafeina ]

La desviación estándar de la regresión o En los intervalos de confianza la letra t
desviación estándar residual fue corresponde a una constante que se
determinada a partir de la ecuación [1]. determina dependiendo del número de
grados de libertad y el porcentaje al cual se
S yy −b2 S xx
S R=
RSS
√
n−2
=
n−2 √ Ec .1
desea el intervalo de confianza. Por lo tanto,
t para 3 grados de libertad y un 95% de
confianza, t correspondió a 3.18.
Donde n corresponde al número de datos
utilizados para la realización de la curva de t=3.18( 95 % , f =3)
calibración (5) y Syy y Sxx se determinaron a
partir de las ecuaciones 1.1 y 1.2. Tabla No. 5 Parámetros de linealidad
determinados a partir de la curva de
n calibración.
S xx =∑ (xi −x́)2=1440( ppm)2 Ec .1.1
i=1 DESVIACION
PARAMETRO VALOR
n
ESTANDAR
S yy =∑ ( yi − ý)2 =6.873 x 105 (mAU . s )Ec .1 .2 21.61 1.846
PENDIENTE
i=1 mAU.s/ppm mAU.s/ppm
-88.26
INTERCEPTO 73.48 mAU.s
Y corresponde al eje y de la curva de mAU.s
calibración (promedio de áreas) x a la COEFICIENTE
DE
concentración de cafeína en las soluciones 0.9714
CORRELACIO
estándares. N (R)
R2 0.9437
Reemplazando los valores obtenidos en la
ecuación 1 se encontró que la desviación
estándar de la regresión fue de IC b95 %=21.61 mAU . s / ppm±5.871
70.06 mAU.s.
IC a95 %=−88.26 mAU . s ± 2.337 x 102
S R=70.06 mAU . s
Con la ecuación de la curva de calibración
A su vez también se determinó la pendiente se determino la concentración de cafeína en
(b) e intercepto (a) con sus respectivas la muestra problema de Coca-Cola (Ec. 6),
desviaciones estándar y sus intervalos de utilizando para ello el factor de dilución
confianza al 95%. empleado y posteriormente se analizo
estadísticamente los resultados obtenidos.
SR
Sb = Ec .2 IC =b ±t S b Ec .3
√ S xx x 0=
y o−a
Ec . 6
b
1 x́ 2
Sa =S R
√ +
n S xx
Ec .4 IC=a ± t Sa Ec .5
AREA=−88 . 258+21 .611 [ ppmcafeina ]

En las ecuaciones mostradas anteriormente 6 . 346 x 102=−88 .258+21 . 611 [ ppm cafeina ]
Sb y Sa hacen referencia a la desviación
estándar de la pendiente y el intercepto 25 mL 25 mL
[ ppmcafeina ]=33 . 45 ppm × 15 mL × 15 mL
respectivamente.
[ ppmcafeina ]=92 . 92 ppm
2
S 1 1 y o− ý
S x cafeina = R
0
+ +
b m n √ b ( ) S1 Ec . 7
xx
IC=x o ±t S x Ec .8
o líquidos y por medio de análisis se determino
m correspondió al número de veces a la cual
se leyó la señal instrumental para la muestra
problema la cual fue de 3 debido a que se
realizo por triplicado y n fue el número de
datos con los que se realizo la curva de
calibración.
Por tanto la desviación estándar de la de la
concentración de cafeína en la muestra
problema de Coca-Cola fue de 51.54 ppm y
su intervalo de confianza determinado a
través de la ecuación 8 fue de ±163.9081
IC Cafeina95 % =51.57 ppm ±1.639 x 102
Así mismo se determinaron el límite de
detección como la concentración mínima de
analito que produce una señal que fue
significativamente diferente del blanco. Para
ello se utilizo la Ec. 9 donde k es una
constante que fue definida arbitrariamente.
Limite de detección (LD) (3σ ) y cuantificación
(LC) (10σ ¿ .
SR
C LD =k Ec .9
b proporciones
SR
C LC =k
b
De tal manera, el limite de detección y
cuantificación fueron de 9.725 y 32.42 ppm
respectivamente.
3. ANALISIS DE RESULTADOS
El objetivo de la practica experimental fue
conocer las normas de seguridad para una
buena practica de laboratorio, además
observar y Manejar diferentes instrumentos
de laboratorio para la manipulación de
cual era mas preciso al momento de realizar
una medida.
en este caso se concluyo el instrumento
mas impreciso y con muy mala exactitud es
el vaso de precipitado, ya que el menisco no
se logra ver bien. asimismo que los
instrumentos para medir volúmenes con
mayor precisión son el matraz aforado, ya
que posee un cuello estrecho; de modo que
un pequeño cambio de volumen del liquido
provoque una considerable diferencia en la
altura del menisco; consecuentemente, el
error cometido al ajustar el menisco es muy
pequeño; también que la probeta es un
instrumento con el cual se puede medir
volúmenes muy pequeños con exactitud ya
que contiene una medida gradual en mL muy
pequeña y al final se determino que la pipeta
es un instrumento de mayor precisión que la
probeta ya que a pesar de que pueden
medir proporciones iguales; esta ultima es un
instrumento que permite medir volúmenes
con menor precisión mientras en
comparación con la otra se puede medir
de líquido con bastante
precisión pues tiene una llave la cual deja
salir el volumen no deseado, contando con
un margen de error de una gota al final de
la misma
El objetivo de la practica experimental es la
determinación cuantitativa de cafeína en una
muestra de coca cola utilizando el método de
la curva de calibración realizada a partir de
soluciones estándares de solución patrón de
cafeína. Para la separación cromatográfica
se va a utilizar un cromatógrafo de líquidos
que consta de una bomba de alta presión de
dos pistones, una válvula de inyección con
un bucle de 20 μl, una columna C 18 y un
detector de ultravioleta visible. Los datos
cromatográficos fueron procesados a través
de una interfase por un software que
contiene un programa de integración.

La técnica de HPLC es utilizada

normalmente en la industria para la
separación de componentes en una mezcla,
para aislar compuestos deseados en
extractos naturales, al igual que la
identificación y cuantificación de compuestos
desconocidos, también se utiliza en
investigación para el desarrollo de nuevos
fármacos y el aislamiento de productos
naturale

s con importante actividad en diversas

enfermedades.

Para poder llevar a cabo el análisis mediante

HPLC de cafeína en COCA COLA, se debió
desgasificar como primera medida la bebida,
para esto, se utilizó el ultrasonido. Posterior
a la desgasificación, se preparó soluciones
de cafeína de concentración conocida, las
cuales se filtraron en un filtro de tamaño de
poro de 0.45 µm para eliminar partículas
solidas presente en la solución, también se
preparo una solución de muestra problema
de coca cola disuelta en una solución de
etanol: metanol. Con las soluciones
preparadas, se determinó el contenido de
cafeína en la muestra problema gracias a la
interacción de los componentes que tenía la
muestra con la fase móvil y la fase
estacionaria. La fase móvil utilizada fue una
mezcla 50:50 de metanol-agua y la fase
estacionaria fue de polímero de silica el cual
se encontraba recubierto con cadenas
laterales C18 hidrofóbicas.
Debido a la fuerte interacción entre la
cafeína y la fase estacionaria, el primer pico
observado se debe fundamentalmente a
azucares que se encontraban interactuando
fuertemente con la fase móvil, como se
muestra en la figura xxxxxxxx.
Los resultados experimentales obtenidos y la
concentración de cafeína en la muestra de
coca cola con un 92.92 ppm de
concentración arrojo un 4.34% de error
según el valor teórico de mg reportado para
una coca cola clásica 350 mL, cuyo valor es
34.0 mg[1] y su correspondiente valor en ppm
fue de 97.14 ppm. Estos errores
experimentales se deben principalmente a la
preparación de las muestras estándares de
la curva de calibración cuya relación entre
las variable fue pequeña debido al
coeficiente de correlación obtenido.
Además debido a que la desviación estándar
obtenida para la concentración de la muestra
problema determinada por triplicado fue tan
amplia se determino entonces que los datos
no fueron reproducibles, esto debido a que si
todos los datos fueran idénticos la
desviación estándar de la concentración de
cafeína de la muestra problema hubiera sido
cero. Por lo tanto, los resultados obtenidos
de cafeína en la muestra problema no fueron
tan reproducible debido a que la
concentración de la muestra pudo cambiar
desde que se recogió hasta que se
efectuaron los respectivos análisis.
Por otra parte la desviación estándar
residual determinada fue también
significativamente grande lo que indico una
menor asociación lineal entre el área de pico
y la concentración de cafeína en cada
solución estándar. La determinación de la
desviación estándar residual también es una
medida para determinar la variabilidad
promedio de los datos observados con
relación a la recta de regresión, además este
valor también es directamente proporcional a
la desviación de la pendiente y el intercepto
que fueron igualmente significativamente
grandes, lo que indico que la preparación de
la curva de calibración tuvo inmerso varios
errores experimentales específicamente en
la preparación de las muestras estándares
como se menciono anteriormente.
4. SOLUCION AL CUESTIONARIO
1. ¿Defina claramente cromatografía
líquida en fase normal y en fase reversa?
¿Cuales son las aplicaciones de la
cromatografía en fase normal?
LC en fase reversa: en este tipo de
cromatografía líquida, la fase estacionaria
es no polar, con frecuencia un hidrocarburo y
la fase móvil es un solvente relativamente
polar, por ejemplo agua, metanol, acetonitrilo
o tetrahidrofurano (THF) [x]. En LC en fase
reversa, la fuerza motriz de la retención, no
es la interacción favorable del soluto con la
fase estacionaria, si no el efecto del
disolvente de la fase móvil que empuja al
soluto hacia adentro de la capa
[x]
hidrocarbonácea enlazada .
LC en fase normal: en la cromatografía de
fase normal, el componente menos polar se
eluye primero; al aumentar la polaridad de la
fase móvil ocasiona una disminución del
tiempo de elución. Por el contrario, en la
cromatografía de fase inversa, los
componentes más polares aparecen primero
y un aumento de la polaridad de la fase
móvil, incrementa el tiempo de elución.
La cromatografía en fase normal, es
ampliamente utilizada para la separación de
componentes en una mezcla, según las
características químicas de cada uno de
ellos. Es utilizada en la industria para la
separación, en muchos campos de la ciencia
y para la sociedad en general, algunos
ejemplos, es la separación de aminoácidos,
proteínas, ácidos nucléicos, hidrocarburos,
carbohidratos, fármacos, terpenoides,
plaguicidas, antibióticos, esteroides,
especies organometálicas entre otros.
2. ¿Cuáles son los recubrimientos
más comunes de la fase estacionaria
empleada en HPLC y cual es la
metodología más empleada para enlazar
fases a la superficie de silica?
Normalmente, los recubrimientos mas
utilizados para HPLC son los C8 cadena n-
octilo o una cadena C18 n-octildecilo, también
se utilizan las cadenas C4. Los rellenos
utilizados normalmente de la fase normal
unida químicamente, R en la cadena de
sílice, son grupos funcionales polares, como
el caso de los grupos ciano –C 2H4CN, diol –
C3H6OCH2CHOHCH2OH, amino –C3H6NH2 y
los dimetilamino –C3H6N(CH3)2. Algunos de
estos grupos polares, se unen químicamente
al final de las cadenas C 4 C8 o C18, aunque el
costo de estos recubrimientos con los grupos
polares es mucho mas elevado que los
comúnmente utilizados C18.
3. ¿Nombre 3 analitos que pueden ser
analizados tanto por HPLC como por
cromatografía de gases? ¿Cuál de los
dos métodos emplearía usted?
Por las dos técnicas mencionadas, pueden
ser analizados aminoácidos, alcoholes de
bajo peso molecular, compuestos orgánicos
de bajo peso molecular, sin embargo la
técnica que se emplea con mayor frecuencia
es HPLC, aunque esta elección depende de
varios motivos, la naturaleza de la mezcla a
separar y de los costos. HPLC es una
técnica mejor que la GC debido a que puede
separar compuestos que sean volátiles o
termolábiles, esta técnica utiliza solventes
económicos a comparación de gases
costosos como el helio y el hidrogeno
utilizados en cromatografía de gases, sin
embargo algunos de los solventes utilizados
en HPLC son de alto costo.
4. Explique porque en el HPLC
realizar la cuantificación con curva de
calibración es precisa mientras que en
CG es aconsejable realizarla con el uso
de un patrón interno.
La técnica de HPLC es precisa, debido a que
el inyector de la muestra es un rizo de
muestreo el cual controla el volumen de
muestra que se adiciona, por ejemplo,
durante la práctica experimental, se adicionó
cantidades de aproximadamente 50 μL, y el
inyector tuvo la capacidad de tomar 20 μL
para llevar a cabo cada determinación. Esta
cantidad es reproducible para cada medida,
por lo cual no es necesaria la presencia de
un patrón estándar como en GC, puesto que
en esta técnica, se necesitaban corregir los
volúmenes adicionados, debido a la mala
inyección o imprecisión en la medida del
volumen de muestra. Algunos equipos de
HPLC contienen un automuestrador, el cual
tiene la capacidad de recolectar muestras
con volúmenes exactos y reproducibles que
no se desvían del volumen fijo, estos
equipos aunque son de costo mayor por el
automuestreador, arrojan un análisis mas
preciso.