PRÁCTICA 3: DETERMINACIÓN DE COMPLEMENTO HEMOLÍTICO HUMANO POR

INMUNODIFUSIÓN RADIAL (IDR)

3.1 Introducción
Paul Ehrlich describió por primera vez al “complemento” de la actividad antibacteriana de
los anticuerpos. Después se descubrió que el complemento se observaba en el suero de
todos los animales y sus niveles eran independientes de su estado inmune [3]. El sistema
del complemento no es una simple proteína sino un sistema funcional de proteínas
plasmáticas y una pequeña proporción de proteínas de membrana que interaccionan unas
con otras de una forma regulada y participan en muchas de las funciones efectoras de la
inmunidad humoral y de la inflamación [4].

Varias proteínas del complemento son divididas durante la activación del sistema y los
fragmentos están designados con sufijos en subíndices (por ejemplo, C3 se divide en dos
fragmentos, C3a y C3b). Normalmente, los fragmentos más grandes se designan como “b”
y los pequeños como “a”. La nomenclatura cambia para C2, por razones históricas: el
fragmento mayor se denomina C2a y el menor C2b. Otros constituyentes del complemento
se designan con nombres descriptivos de su función: inhibidor de C1 (C1 INH), inactivadores
de C4a, C3a y C5a (C4a, C3a y C5a INa), factor acelerador del decaimiento (DAF), etc.
También se incluye a los receptores de los fragmentos de algunos de los componentes: CR1,
CR2, CR3, etc. Las vías que llevan a la fragmentación de C3 son activadas por cascadas
enzimáticas, análogas a las de la coagulación, fibrinólisis y kininas. Al final, las vías llevan a
la formación de un complejo de ataque a la membrana (MAC), que es un sistema que
construye un complejo lipofílico en las membranas celulares. Los mecanismos regulatorios
del sistema del complemento están balanceados de tal manera que por un lado, la actividad
se dirija contra la superficie de microorganismos invasores y por otra, que el depósito de
sus productos sobre células normales y tejidos sea limitado
[3].

Existen 3 vías activadoras del complemento. La Vía Clásica, en donde la primera proteína
que interviene es la proteína C1 y es el mecanismo efector para la repuesta inmunitaria
mediada por anticuerpo ya que se activa tras la unión del C1 a la porción Fc del anticuerpo,
no son todos los anticuerpos, activan el complemento (IgM y ciertas clases de IgG: IgG3,
IgG1 e IgG2 siguiendo ese orden). Al unirse el antígeno con el anticuerpo se inducen
cambios conformacionales en el fragmento Fc que expone un lugar de unión para el
componente C1. La Vía Alternativa, compuesta por cuatro proteínas séricas, el C3, el Factor
B, el Factor D y la Properdina. Se activa a través de constituyentes de la superficie celular
que son extraños para el organismo, tales como los componentes de las membranas
bacterianas. Y por último la Vía de las Lecitinas, que es una especie de variante de la vía
clásica, sin embargo se activa sin la necesidad de la presencia de anticuerpos, no obstante
últimamente, se ha encontrado activación adicional mediado por complejo antígeno-
anticuerpo y moléculas de IgG carentes de residuo terminal de galactosa, como se observa
por ejemplo en pacientes con artritis reumatoide [5].

3.2 Objetivo general

Realizar una técnica inmunológica que evalúe la participación del complemento utilizando
placas IDR.
2.2.1 Objetivos específicos

a) Analizar la participación del complemento en la respuesta inmune de los seres

humanos.
b) Aplicar el método IDR en placa para determinar el complemento hemolítico.

3.3 Materiales y Métodos

3.3.1 Listado de materiales y reactivos

1. Una placa de I.D.R, para complemento (preparada previamente por el laboratorio)

2. Cuatro jeringas con capacidad de 3 mL
3. Cuatro tubos de ensaye de 13 x 100 mm
4. Cuatro pipetas Pasteur con bulbo
5. Una micropipeta con capacidad de 10-20µL y puntillas limpias y secas
6. Lente de relojero (proporcionado por el laboratorio)

3.3.2 Procedimiento

1. Extraer 3 mL de sangre mediante venopunción a 4 pacientes (o voluntarios)

diferentes y colocarlos en diferentes tubos de ensayo de 13 x 100 rotulándolos
respectivamente.
2. Centrifugar cada tubo con sangre a 2500 rpm por 5 minutos, para separar el suero.
3. Realizar un pool (mezcla) de sueros, colocando 200 µL de suero de cada paciente en
un tubo 13 x 100 mm, y rotularlo como “pool 100%”. Tomar un segundo tubo 13 x
100 mm y añadir 200 µL de solución salina fisiológica al 0.9 % W/V más 200 µL del
pool, y rotularlo como 50%. Tomar otro tubo 13x100 mm y añadir 200 µL de solución
salina fisiológica al 0.9% W/V más 200 µL de la dilución 50 % y rotularlo 25% (ver
Figura 1).
 4. Colocar 10 µL de suero de paciente en una horadación de la placa IDR, primero se
colocan primero 5 µL esperar 5 minutos, y añadir los otro 5 µL.
5. Colocar en la horadación rotulada como 1 la dilución 100%, en la horadación
rotulada como 2 dilución, la dilución 50%, y en la horadación 3 la dilución 25%.
6. Incubar una hora a temperatura ambiente.
7. Incubar 24 horas en refrigerador.
8. Incubar 1-3 horas a 37 °C.
9. Leer el halo de hemolisis, y realizar una curva en papel milimétrico en el eje de las
“x” los milímetros de diámetro (mm) y en el eje de la “y” los porcentajes de hemolisis
de 0 a 100 % e interpolar el resultado de su paciente.
10. Calcular su concentración (la que interpoló) y reportar.

Figura 1. Placa de IDR rotulada.

3.4 Resultados
Realice una curva en papel milimétrico en el eje de las “x” los milímetros de diámetro (mm)
y en el eje de la “y” los porcentajes de hemolisis de 0 a 100 % e interpolar el resultado de
su paciente.
Pegue la curva en este espacio:
3.5 Diagrama de Flujo de la práctica realizada
3.6 Cuestionario de repaso
1. ¿Cuántas proteínas forman el sistema de complemento y en que órgano es sintetizada
la mayor parte?
30 proteínas mayormente sintetizadas en el hígado.

2. Cite TRES de actividades importantes del complemento.

Promoción de la inflamación
Promoción de la opsonización
Muerte celular inducida por MAC

3. ¿Qué proteínas son las que inician la activación de la vía alterna y la vía clásica?
La vía clásica es iniciada por unión común a anticuerpo con C1q.
La vía alterna puede ser activada de 3 maneras, en las que participa la proteína C3:

4. Explique qué vía del complemento pertenece a la inmunidad adaptativa y porque :

Se considera parte de la respuesta adaptativa por que empieza con la formación de
complejos de antígeno-anticuerpo.

5. Dos de las tres vías comporten propiedades y componentes, diga cuales son y que
componentes comparten :
Las vías, clásica y de lectina usan el dímero C4b2a para su actividad de C3 a convertasas

6. Cite al menos 4 reguladores del complemento, mencionando a que vía pertenecen.

Factor H: Pertenece a la vía alterna
Factor I: Pertenece a la vía clásica, alternativa y de lectina
Inhibidor de C1 (C1INH): Pertenece a vía clásica y de lectina
C4BP: Pertenece a la vía clásica y de lectina

7. Los receptores CR3 y CR4 ¿En qué células se expresan y cuál es su función?
Se expresan en monocitos, macrófagos, neutrófilos, células NK y células T.
Los CR3 tienen como función la unión a moléculas de adhesión sobre leucocitos, facilita la
extravasación; la unión a iC3b aumenta la opsonización de inmunocomplejos.
Los CR4 tienen función de fagocitosis mediada por iC3b.

8. Cite dos enfermedades causadas por la alteración del complemento:

Meningitis y neumonía

9. ¿Cuántos y cuáles son los complejos enzimáticos formados por la vía clásica?
El C1 es un complejo pentamolecular dependiente de calcio conformado por una molécula
de C1q, dos de C1r y dos de C1s, que pertenece a una de las familias de las colectinas,
unida por 3 subunidades que presenta forma de "Y" y en cada rama una cabeza globular de
unión al inmunocomplejo y un tallo de tipo colágeno de unión a los componentes del
complemento.

10. ¿Cuál es la etapa final en la activación del complemento?

El resultado final de la secuencia iniciadora de las tres vías es la generación de enzimas
que dividen C3 hacia C3a y C3b y C5 hacia C5a y C5b.

Conclusión:
 Bibliografía consultada para el cuestionario:

Nombre del alumno:

Sección:
Equipo: Calificación: