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2. Tecnicas de Estudio Histologico

Histología General (Universidad San Sebastián)

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Apuntes de Histología General Universidad San Sebastián

Técnicas de estudio histológico

1. Microscopia óptica de luz (MO): Utiliza un instrumento conformado por lentes ópticos y
como fuente lumínica una luz blanca. Se conoce como microscopio óptico.

El microscopio óptico actual utiliza una disposición de grupos de lentes que

amplifican una imagen y su fuente de luz es una bombilla eléctrica con un filamento
cuya luz reúne un haz enfocado por la lente condensadora.

Este permite aumplificaciones totales de 40, 100, 400 y 1000 y enfocan la imagen
resultante en la retina del ojo.

La calidad de la imagen no solo depende la capacidad de un lente para amplificar, si

no también de su resolución: la capacidad de la lente para mostrar que dos objetos
distintos están separados por una distancia.

2. Microscopía electrónica de barrido (MEB): La MEB proporciona una imagen tridimensional

del espécimen.

Con esta técnica por lo general el objeto que se observa se prepara en una forma
especial que permite depositar en la superficie del espécimen una capa delgada de
metal pesado como oro o paladio.

A medida que el haz de electrones explora la superficie del objeto, algunos

(electrones) se reflejan, y se expulsa desde la capa de metal pesado.

Los detectores de electrones capturan los electrones reflejados y expulsados

(retrodispersos y secundarios respectivamente) y se interpretan, comparan y
muestran en un monitor como imagen 3D.

3. Microscopia electrónica de transmisión (MET): Se utilizan cortes mucho más delgados en

comparación con los de la microscopía optica, para teñir los tejidos.

Se requieren técnicas de precipitado de metales pesados en lugar de colorantes

hidrosolubles.

La preparación de especímenes de tejido para la MET incluye las mismas etapas

básicas que la de microscopia óptica.

En este tipo de microscopia se emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto

cuya imagen se desea aumentar.

Algunos electrones rebotan, otros se absorben y la gran mayoría atraviesan la

muerta, formando una imagen aumentada en el visor.

Bastián Jara Muñoz 1 Odontología 2018

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Preparación de los tejidos

Los pasos necesarios para la preparación de los tejidos observados en la microscopia óptica
incluyen 1) fijación, 2) deshidratación y aclaramiento, 3) inclusión, 4) corte y adhesión 5)
desparafinación e hidratación, 6) tinción y 7) montaje.

Con la finalidad de estudiar los tejidos se han desarrollados diversas técnicas de preparación,
de tal manera que se asemejen a su estado natural en vivos. Las etapas incluidas dentro de
estas técnicas son:

I. Fijación: Se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que no solo retardan
las alteraciones hísticas posteriores a la muerte (o a la remoción del organismo) si no que
también conservan su estado normal.

En resumen la fijación es utilizada para: abolir el metabolismo celular e impedir

degradación enzima tica de las células y tejidos por autólisis,

El fijador de uso más común es la Formalina, una solución acuosa de formaldehído

al 37%.

El formaldehído conserva la estructura general de la célula y de los componentes

extracelulares y debido a que este no altera la tridimensionalidad de las proteinas,
mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos.

II. Deshidratación y aclaramiento: Debido a que el agua representa una gran proporción del
tejido, se aplica una serie ascendente de baños de alcohol.

Primero el tejido es tratado con alcohol etílico al 50% y después, de manera

paulatina, con alcohol al 100% para eliminar el agua.

Es importante que el tejido fijado no pase directamente a alcoholes de 100º, porque

la deshidratación sería muy enérgica apareciendo en el tejido espacios, donde no
existían en la realidad.

A continuación de la deshidratación, el tejido es tratado con xileno, una sustancia

química que es miscible (mezclable) con parafina fundida. Este proceso se conoce
como aclaramiento ya que el tejido se torna transparente en el xileno (el xileno sirve
como eslabón entre alcohol y parafina)

III. Inclusión: Con objeto de distinguir entre células superpuestas en un tejido y la matriz
extracelular, se debe incluir los tejidos en un medio apropiado y a continuación
seccionarlos en cortes delgados.

En microscopia óptica, el medio habitual de inclusión es la parafina.

Para la inclusión, el tejido se coloca en un recipiente adecuado con parafina fundida

hasta que se infiltra por completo .

Una vez el tejido se impregna con parafina, se coloca en un receptáculo pequeño,

recubierto con parafina fundida y se deja endurecer para formar un bloque que
incluya el tejido.

Bastián Jara Muñoz 2 Odontología 2018

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IV. Corte y adhesión: Luego de que los bloques de tejido están listos, se montan para
seccionarlos.

En esta etapa se hace uso de un aparato conocido como micrótomo formado por
una cuchilla fija por la cual pasa el tejido endurecido para obtener un corte del grosor
deseado.

Para la microscopia óptica, el grosor de cada corte fluctúa entre 5 y 10 µm.

Luego, para poder colorear y observar los tejidos ya cortados, estos deben ser
pegados en portaobjetos muy limpios a través de sustancias adhesivas (solución
acuosa de albúmina) y posteriormente deben ser estirados y secados.

V. Desparafinaje e hidratación: A pesar de que los tejidos son muy delgados no es posible
distinguir las estructuras celulares ya que el tejido y las células están embebidos en
parafina.

Para colorear y teñir los cortes, la parafina debe disolverse y extraerse, con xileno y
los tejidos deben rehidratarse mediante el uso de una serie de soluciones de alcohol
decrecientes.

VI. Tinción: Debido a que muchos constituyentes de los tejidos tienen casi las mismas
densidades optimas, deben teñirse para la microscopia óptica. La tinción apropiada debe
incluir sobre todo colorantes hidrosolubles.

Una vez sometido a tinción, se deshidrata el corte nuevamente de tal manera que
pueda fijarse de modo permanente al cubreobjetos.

Aunque existen varios tipos de colorantes para observar los múltiples componentes
celulares y tejidos, pueden agruparse en tres clases: colorantes que diferencian
componentes básicos y ácidos de la célula, colorantes especializados que distinguen
los componentes fibrosos de la MEC y sales metálicas que se precipitan en los tejidos
y forman depósitos de metales en ellos.

Los colorantes empleados con más frecuencia en histología son hematoxilina y

eosina (H&E)

VII. Montaje: Para dejar una preparación permanente y definitiva, se coloca sobre el tejido (ya
diafanizado) una sustancia adhesiva y se cubre con un cubre objeto muy limpio y se deja
secar.

Técnicas de coloración

Como se dijo anteriormente, los colorantes empleados con más frecuencia son Hematoxilina
y Eosina (H&E).

La hematoxilina es una base que tiñe de manera preferencial los componentes ácidos
de la célula de un color azuloso/morado. Puesto que la mayor parte de los
componentes ácidos son ADN; ARN; núcleo y regiones citoplasmáticas ricas en
ribosomas, estos se tiñen de color azul oscuro y son denominados basofílicos.

Bastián Jara Muñoz 3 Odontología 2018

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La eosina es un ácido que tiñe los componentes básicos de la célula de un color

rosado/naranjo. En virtud de que muchos constituyentes citoplasmaticos tienen pH
básico, las regiones del citoplasma se tiñen de tonalidad rosada y se dice que estos
elementos son acidófilos.

Otros colorantes en la preparación para estudio histologico son:

REACTIVO RESULTADO

Hematoxilina Azul: Núcleo, regiones ácidas del citoplasma y

matríz del cartílago.

Eosina Rosa: regiones básicas del citoplasma y fibras de

colágeno.

Tricómico de Masson Azul oscuro: núcleo.

Rojo: músculo, queratina, citoplasma.

Azul claro: mucinógeno, colágeno.

Colorante de orceína (para fibras elásticas) Pardo: fibras elásticas.

Colorante de Weigert (para fibras elásticas) Azul: fibras elásticas

Tinción argéntica Negro: fibras reticulares.

Hematoxilina férrica Negro: estriaciones de músculo, núcleos,

eritrocitos.

Ácido peryódico de Schiff Magenta: moléculas ricas en glucógeno y

carbohidratos.

Colorantes de Wright y Giemsa (tinción diferencial Rosa: eritrocitos, gránulos de eosinófilos.

de células sanguíneas) Azul: citoplasma monolitos y linfocitos.

HEMATOXILINA EOSINA H&E

Bastián Jara Muñoz 4 Odontología 2018

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TRICOMICO DE ORCEÍNA
MASSON

HEMATOXILINA ÁCIDO
FÉRRICA PERYODICO DE
SCHIFF

Procedimientos avanzados de observación

Histoquímica

Método de tinción de tejidos que proporciona información sobre la presencia y localización de

macromoléculas intracelulares y extracelulares.

Es posible localizar los constituyentes químicos

específicos de tejidos y células por métodos de
histoquímica y citoquímica.

Estos métodos aprovechan la actividad

enzimática, reactividad química y otros
fenómenos fisicoquimicos relacionados con
elemento en cuestión.

Las reacciones de interés se tornan evidentes

mediante la formación de un precipitado insoluble
que toma cierto color.

Con frecuencia, la histoquímica se efectúa en

Bastián Jara Muñoz 5 Odontología 2018

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tejidos congelados y puede aplicarse tanto en microscopia óptica como en

electrónica.

Inmunocitoquímica

Se utilizan anticuerpos marcados con fluoresencia y antianticuerpos para identificar una

localización intracelular y extracelular de las macromoléculas mas precisa de la que es
posible con la histoquímica.

Aunque los procedimientos histoquímicos

permiten ubicar relativamente bien ciertas
enzimas y macromoléculas en células y
tejidos, es posible tener una localización
más exacta con inmunocitoquímica.

Este procedimiento exige

desarrollar un anticuerpo contra la
macromolécula particular a
localizar y marcas el anticuerpo
con un colorante fluorescente.

Existen dos métodos de marcado con

anticuerpo: directo e indirecto.

• Método directo: se marca el

anticuerpo contra la macromolécula
con un colorante fluorescente. A continuación se permite que reaccione el anticuerpo
con la macromolécula y puede observarse el complejo resultante mediante el uso de
microscopía de fluorescencia.

• Método indirecto: se prepara un anticuerpo marcado con fluoresencia contra el

anticuerpo primero específico para la macromolécula de interés.

Bastián Jara Muñoz 6 Odontología 2018

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Bibliografía

I. Gartner, L. and Hiatt, J. (2008). Texto Atlas de Histología. 3rd ed. Mexico D.F: McGraw Hill,
pp.1-10.

II. Ross, M. and Pawllina, W. (2015). Histología Texto y Atlas correlación con Biología
Molecular y Celular. 7th ed. Barcelona: Wolters Kluwer, pp.1-22.

Bastián Jara Muñoz 7 Odontología 2018

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