UDES, Bacteriología y Laboratorio Clínico, 2020

Laboratorio de Biotecnología. Docente Claudia Diaz Informe I

MÉTODO DE CONSERVACIÓN EN CONGELACIÓN Y ACEITE MINERAL

COMO MEDIOS PREDOMINANTES PARA LA PRESERVACIÓN DE Bacillus spp,
Aspergillus niger y Cándida utilis
Karen Molina Atuesta, Natalia Barreto Lesmes, Belkys Vásquez Coronel
Entregado 24 de febrero de 2020

RESUMEN

La conservación de microorganismos es una práctica que requiere inicialmente de

investigación respecto a las características propias de cada microorganismo, su
exigencia nutricional, cualidades físicas y genéticas, etc. Lo que permite tener un
mayor control respecto a las cepas a conservar. Además, también se requiere del
conocimiento de los diferentes métodos, para aplicar los más convenientes.
Teniendo como objetivo encontrar uno que garantice viabilidad, pureza y
estabilidad genética, para ello se eligen los medios como aceite, tierra, agua y
arena, donde se busca la estabilidad de una bacteria, hongo y levadura, utilizando
diferentes temperaturas para la incubación, y además de eso los agares
correspondientes a cada microorganismo, que ya esté científicamente
comprobados que cuentan con las condiciones necesarias para el crecimiento de
cada uno de estos. De esta manera, se determinó que uno de los medios que más
convenientes para la conservación es la congelación debido a que tiene la
capacidad de mantener de manera estable todas las características de los
microorganismos empleados, aunque los demás medios también demostraron
viabilidad.
Palabras claves: conservación, microorganismos, métodos, viabilidad, pureza

INTRODUCCIÓN características químicas de los

Hoy por hoy los microorganismos se han
convertido en seres vivos esenciales para
estudios realizados en los laboratorios, ya
que han sido utilizados en los
medicamentos (antibióticos y vitaminas) y
para la elaboración de alimentos (bebidas
alcohólicas y quesos). Además, son de gran
importancia en la Biotecnología y en la
protección del medio ambiente por ello, se
ha aumentado la necesidad de conservar los
microorganismos de manera efectiva
permitiendo que sus propiedades químicas
más importantes permanezcan estables (1).
Una de las formas que ha facilitado el
mantenimiento constante de las
microorganismos es a través de la
conservación mediante la utilización de
medios de cultivos. Además, se debe tener
en cuenta que los medios de cultivo
requieren de un control de calidad confiable
que garantice una viabilidad, pureza e
identidad de las cepas (2).
Por otra parte, es fundamental que al
seleccionar el método de conservación con
el cual se trabajara en un proceso
biotecnológico se requiere que este asegure
al menos el 70-80% del crecimiento
microbiano en un periodo de tiempo
notable, teniendo en cuenta no alterar la
información genética de las células.
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Asimismo, de acuerdo Federación Mundial
de Colecciones de Cultivos (WFCC) es
importante elegir mínimo dos tipos de
métodos que garanticen la seguridad y
minimicen la posibilidad de pérdida o daño
en los microorganismos (3).
En los medios de cultivo pueden utilizarse
diferentes métodos de preservación. La
mayoría de estos han logrado reducir el
ritmo metabólico de los microorganismos
por diferentes factores como la retención de
nutrientes, agua, oxígeno y la reducción de
la temperatura de conservación (4). Para
llevar a cabo una correcta conservación de
microorganismo es importante que el
cultivo a conservar sea puro, con el fin de
evitar que se produzcan contaminaciones
(5).
Los métodos de conservación más
destacados en las prácticas de laboratorios
son; la congelación, el aceite mineral
estéril, agua estéril, tierra o arena y la
liofilización. El método de congelación es
conocido como el mejor método para la
preservación de microorganismos, en
donde se congelan las células en suspensión
en un líquido que contenga un agente
crioprotector y se guardan a temperaturas
menores a 0 °C (6).
La conservación en capa de aceite mineral
es un método que consiste en cubrir el
cultivo sobre un medio líquido o agarizado,
este es utilizado para la preservación de
MATERIALES Y MÉTODOS
Se llevó a cabo la práctica de conservación
de microorganismos a partir de un cultivo
axénico con una cepa de prueba en este caso
bacteria, hongo y levadura, donde se puso a
Informe I
muchos organismos, pero ha tenido mayor
predominio especialmente en micelios u
hongos no esporulados, donde el método de
congelación puede ser desfavorable para
ellos y es recomendado en climas tropicales
para prevenir la desecación del cultivo. Por
otro lado, la conservación con agua
destilada estéril también es un método muy
utilizados principalmente en los hongos
filamentosos y en algunas bacterias, ya que
este brinda un alto porcentaje de viabilidad
y estabilidad de los caracteres fisiológicos
y morfológicos (7). También se encuentra
el método de conservación en tierra o arena
es uno de los métodos de preservación más
utilizados en hongos especialmente en
cultivos periódicos en cuñas de agar (8).
En este trabajo se evaluó el mantenimiento
de tres tipos de microorganismos en
diferentes métodos de conservación. Los
microorganismos trabajados fueron: El
hongo Aspergillus niger; Hongo micelial
formado por hifas hialinas tabicadas,
considerado patógeno oportunista, es decir
origina infecciones en el ser humano (9). La
bacteria Bacillus sp; bacteria Gram positiva
relacionada con el ciclo del carbono,
algunas especies de estas son utilizadas
para elaboración de antibióticos y
vitaminas (10). Y la levadura Cándida
utilis; también llamada levadura torula, la
cual ha sido utilizada como suplemento
alimenticio animal debido a su alto
contenido de vitamina B y minerales (11).
prueba la supervivencia de estas en
diferentes medios.
Inóculo estándar
Este procedimiento sirve para determinar
en número de bacterias o microorganismos
presentes por mL de fluido. una suspensión
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bacteriana equivalente en turbidez a la
turbidez estándar de 0.5 mL McFarland
contiene aproximadamente 108 bacterias
por mL (12). Se preparó a partir de un
cultivo axénico del cual se tomó una
colonia de microorganismo en este caso se
utilizó Bacillus sp, Aspergillus niger y
Cándida utilis, se adiciono 10 ml de agua
destilada a cada tubo que los contenía y se
mezcló hasta obtener la turbidez similar al
tubo #5 de la escala de McFarland en las
cepas de bacteria y levadura, en el hongo no
se hizo la comparación con la escala,
después se procedió a hacer la inoculación
en los diferentes medios de conservación.
Medios de conservación
Congelación
Este medio consiste en el almacenamiento
de células a muy bajas temperaturas. En
estas condiciones el agua, mayor
componente de las células vivientes, pasa
de fase líquida a sólida. Éste tipo de
conservación radica en la disminución de la
temperatura, generalmente entre -20 °C a -
30 °C, lo cual permite que las reacciones
bioquímicas sean más lentas y además
inhibe la actividad microbiana, generando
el estado de latencia de ésta (13) , con el
objetivo de comprobar lo expresado en la
base teórica, se hizo la inoculación por
duplicado de cada una de las cepas de los
microorganismos adicionando 1 ml de
inoculo de Bacillus spp, Aspergillus niger y
Cándida utilis, en un frasco con agar
Sabouraud, se sellaron y se llevaron a una
temperatura de -20 °C durante 192 horas,
para determinar la viabilidad de este
método se realizó la siembra de cada uno
de los microorganismos en agar nutritivo
para la bacteria y agar PDA para el hongo y
levadura, se incubó Bacillus spp, y
Candida utilis a 37°C durante 24 a 48 horas
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y Aspergillus niger a una temperatura que
oscila de 25 ± 28 °C durante un tiempo de
72 a 120 horas, para finalmente realizar
lectura.
Aceite
Esta técnica disminuye la deshidratación
del medio, retarda la actividad metabólica
del cultivo por la reducción de la tensión del
oxígeno, aunque los hongos continúan
creciendo bajo aceite (14). Para este medio
se realizó inoculación de los diferentes
microorganismos en un frasco que contenía
agar Sabouraud, se adiciono 1 ml de las
cepas Bacillus spp, Aspergillus niger y
Cándida utilis por duplicado,
posteriormente se adiciono 1 ml de aceite
mineral en cada uno de los recipientes, se
sellaron los frascos y dejaron a temperatura
ambiente durante 192 horas,
posteriormente se realizó siembra de estos
microorganismos en agar nutritivo para la
bacteria, y agar PDA para hongo y
levadura, de manera que en un solo agar se
sembraron los cultivos por duplicado, se
incubó Bacillus spp, y Cándida utilis a
37°C durante 24 a 48 horas y Aspergillus
niger a una temperatura que oscila de 25 ±
28 °C durante un tiempo de 72 a 120 horas,
posteriormente se realizó lectura .
Agua
En un frasco de 2 ml de agua estéril, se
adiciono 1 ml de cada una de las cepas de
Bacillus spp, Aspergillus niger y Cándida
utilis por duplicado, se sellaron y se
expusieron a temperatura ambiente durante
192 horas, luego de transcurrido este
tiempo se hizo la siembra de cada uno de
los microorganismos inoculados, en agar
nutritivo se sembró en forma de estría la
bacteria Bacillus spp, en agar PDA se
sembró el hongo Aspergillus niger y la
levadura Cándida utilis de igual manera en
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forma de estría, en un solo agar se humedeció un poco para poder adicionar 1

dispusieron las cepas duplicadas, para
después incubar Bacillus spp, y Cándida
utilis a 37°C durante 24 a 48 horas y
Aspergillus niger a una temperatura que
oscila de 25 ± 28 °C durante un tiempo de
72 a 120 horas, finalmente se determinó la
capacidad de conservación de este medio
con la ayuda de la lectura cualitativa.
Tierra o arena
Es un sustrato el cual se ha estudiado para
conservación de hongos específicamente
patógenos (15) sin embargo, en este caso se
puso a prueba su capacidad de conservación
en bacterias, hongos y levaduras,
inicialmente en un frasco pequeño se
adiciono arena , se autoclavó 3 veces y se
ml del inóculo cada uno de
microorganismo: Bacillus spp, Aspergillus
niger y Cándida utilis por duplicado, se
selló y se almacenó a temperatura ambiente
durante 48 horas y posteriormente se
almacenó en nevera, por consiguiente se
realizó la siembra del cultivo obtenido, en
agar nutritivo la bacteria Bacillus spp, en
agar PDA se sembró el hongo Aspergillus
niger y la levadura Cándida utilis de tal
manera en que en un solo agar se sembrara
el duplicado del microorganismo.
Finalmente se incubó Bacillus spp, y
Cándida utilis a 37°C durante 24 a 48 horas
y Aspergillus niger a una temperatura de 25
± 28 °C durante un tiempo de 72 a 120
horas y luego se realizó lectura.

Fig. 1 Procedimiento para la conservación de microorganismos. a) Cultivo axénico de bacteria,

hongo y levadura b) Preparación del inoculo estándar, c) Comparación de turbidez con el tubo
#5 de la escala de McFarland, d) Inoculación en los medios de conservación, e) Medios de
conservación ya preparados (Congelación, aceite, agua y tierra), f) Prueba de viabilidad,
siembra en los medios de cultivo, g) Incubación de bacterias y levaduras, h) Incubación de
hongos, i) Lectura y registros de resultados.
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RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1. Resultados de Bacillus spp frente a diversos métodos de conservación.

Bacillus spp

Método Reporte de Características Evidencia fotográfica

viabilidad Macroscópicas

Congelación ++++ Colonias medianas, forma

circular, color beige, borde
redondeado, elevación
planoconvexa

Aceite ++++ Colonias medianas, forma

circular, color beige, borde
redondeado, elevación
planoconvexa

Tierra +++ Colonias grandes, forma

circular color beige, borde
irregular, elevación
planoconvexa
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Agua ++++ Colonias medianas, forma

circular, color blanquecino,
borde redondeado,
elevación planoconvexa

La prueba de viabilidad para la bacteria congelación conservan una alta actividad

Bacillus spp en todos los medios de metabólica para soportar cambios
conservación utilizados en la práctica de metabólicos y activar mecanismos de
laboratorio indicaron una viabilidad de los reparación, relacionados con el
microorganismos de manera abundante, es sostenimiento de la integridad celular y de
decir que Bacillus spp tuvo la capacidad de esta forma con la capacidad de ser
duplicar su material genético en cada uno cultivables (16).
de los métodos sin restringir su por otra parte, el género Bacillus spp son
metabolismo. Asimismo, de acuerdo con la bacterias que tienen una alta resistencia
literatura indica que las bacterias son debido a que morfológicamente son
microorganismos capacitados con una microorganismos esporulados lo cual
maquinaria molecular que incluye proteínas permite que puedan sobrevivir en diferentes
anticongelantes, lo cual permite que estos conservaciones y en condiciones adversos
microorganismos durante procesos de (17).

Tabla 2. Resultados de Aspergillus niger frente a diversas pruebas de conservación.

Aspergillus niger

Prueba Reporte de Características Evidencia fotográfica

viabilidad macroscópicas

Congelación ++++ Colonias pequeñas, forma

circular, color amarillento,
borde redondeado,
elevación convexa
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Aceite +++
Tierra +++
Agua +++
Los métodos de conservación utilizados
demostraron que el hongo utilizado en este
caso, Aspergillus niger, mantuvieron las
propiedades fisiológicas evaluadas,
demostrando que la congelación es uno de
los mejores métodos de conservación lo
cual confirma que para la conservación a
largo plazo existen métodos como la
crioconservación, la cual detiene el
crecimiento de células sin causar pérdida de
viabilidad, limitan la aparición de
generaciones sucesivas y la actividad
celular durante años (18), esto se debe a que
se mantiene la estabilidad genética de los
microorganismos que es uno de los
Informe I
Colonias pequeñas, forma
circular, color amarillento,
borde redondeado,
elevación convexa
Colonias pequeñas, forma
circular, color amarillento
y negro, borde redondeado,
elevación convexa
Colonias pequeñas, forma
circular, color amarillento,
borde redondeado,
elevación convexa
enfoques más importantes en la
conservación de microorganismos ya que lo
que se busca es recuperar el
microorganismo en el momento que sea
necesario y que se encuentre en las mejores
condiciones posibles.
El aceite, la tierra y el agua presentaron
similitud en cuanto a la capacidad de
conservación del hongo, sin embargo, este
último se considera de gran importancia
debido a que posee grandes ventajas, ya que
garantiza porcentajes de viabilidad, pureza
y estabilidad de las cepas, lo que se une a su
bajo costo y sencillez, usando el mismo
frasco hasta que se acabe el líquido (19).
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Tabla 3. Resultados de Cándida utilis frente a diversas pruebas de conservación.

Cándida utilis

Prueba Reporte Características Evidencia fotográfica

macroscópicas

Congelación + Colonias pequeñas, forma

circular, color
blanquecino, borde
redondeado, elevación
convexa

Aceite +++ Colonias pequeñas, forma

circular, color amarillento,
borde redondeado,
elevación convexa

Tierra + Colonias pequeñas, forma

circular, color amarillento,
borde redondeado,
elevación convexa

Agua ++ Colonias pequeñas, forma

circular, color amarillento,
borde redondeado,
elevación convexa

Respecto a los resultados en la La literatura reporta que las cepas de

conservación de levaduras, se observaron
gran variabilidad a través de los diferentes
medios. En los medios donde se visualizó
mayor crecimiento fue en aceite y en agua
estéril.
hongos (levaduriformes y filamentosos) se
mantienen puros y viables por los métodos
de preservación; agua destilada y aceite
mineral estéril (20). Se puede corroborar
que las levaduras presentaron mejor
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crecimiento por medio de estos dos
métodos.
Por otra parte, el aceite es un método
alternativo usado frecuentemente para
conservar hongos, posee alta viabilidad.
Además de que es un método sencillo y
económico, sin embargo, puede verse
afectado por la contaminación de otros
hongos (21). La viabilidad de la levadura
durante la prueba de laboratorio, se vio
favorable para el aceite así mismo sucede
con el agua estéril, posee las mismas
características del aceite mineral,
determinando que son métodos muy
efectivos para la conservación. A pesar de
que, el aceite mineral destaca más, puesto
que en la práctica se vio contaminación por
otro hongo en agua mineral. Puede
contemplarse la posibilidad de mejorar las
técnicas de siembra y desinfección, de igual
forma la inoculación del microorganismo
podría estar fallando en razón a que en
métodos como tierra y congelación se
evidenció el poco crecimiento de la
levadura.
Finalmente, de acuerdo con los cuatro
métodos de conservación trabajados en el
laboratorio se evidenció que en Bacillus sp
y Aspergillus niger hubo mayor viabilidad
en las pruebas de congelación y aceite
mineral. A diferencia de levadura Cándida
utilis donde el mejor método fue el de aceite
mineral. Según la literatura, el método de
congelación es denominado como uno de
los mejores debido a que garantiza al
máximo la estabilidad genética, puesto que
evita las apariciones sucesivas y por tanto
son los más usados en la preservación de
microorganismos. Por otro lado, se destaca
que el método de conservación de aceite
mineral predomina principalmente para la
preservación de hongos como Cándida
utilis, porque este permite mantener las
Informe I
características genotípicas y fenotípicas de
las levaduras después de largos tiempos de
preservación, además facilita la
conservación de hasta 97% de las
propiedades e identificación taxonómicas
del microorganismo original (22). Así
mismo, se recomienda que al finalizar el
proceso de preservación de los
microorganismos se utilicen medios que
favorecen la esporulación como por
ejemplo el agar extracto de malta o el agar
papa dextrosa APD (23).
CONCLUSIONES
En los últimos tiempos, se ha visto un
incremento en la apreciación del valor de
las colecciones de cultivos de
microorganismos, tanto para la
conservación de recursos genéticos y la
biodiversidad, como para proveer la fuente
esencial para el desarrollo biotecnológico
mundial. Por esta razón, se han desarrollado
variedad de métodos que permiten
preservar sus características genéticas, su
viabilidad y pureza.
Los métodos de conservación utilizados
demostraron ser efectivos para los
diferentes microorganismos, para
determinar el mejor método debe realizarse
un análisis profundo donde se pruebe en
intervalos de tiempo, permitiendo así,
visualizar cual método conserva mejor el
microorganismo en un lapso.
El género Bacillus sp son bacterias que
presentan una alta viabilidad en los
métodos de conservación en congelación,
agua destilada, aceite mineral y tierra o
arena. Ya que en cada uno de estos se
observó un crecimiento y una duplicación
numerosa del microorganismo, lo cual
indica que tienen una alta capacidad de
resistencia a condiciones adversas
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